CN104109190B - 一种制备单一多肽-Zn（Ⅱ）配合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种制备、分离、筛选单一多肽，并进而定向合成一种多肽与微量元素锌的配合物即单一多肽‑Zn(Ⅱ)配合物的方法，包括溶解、乳化、交联、活化、接入配基、螯合Zn²⁺制备金属离子亲和介质等工序，既有理论上的科学意义，又有很高的实用价值。

Description

一种制备单一多肽-Zn（Ⅱ）配合物的方法

技术领域

本发明涉及蛋白多肽的筛选与纯化领域，具体是一种制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法。

背景技术

多肽-锌配合物是一种具有复合生物活性功能的新型有机金属化合物，是多肽配基与Zn²⁺通过配合作用形成的配位化合物。构成该配合物其中一种组分的锌，作为多种酶的活化剂和不可缺少的组分，是所有生物***(包括细菌、植物、动物和人类)必不可少的微量元素，有“生命元素”之称，它对所有细胞体系内的基本细胞功能有着不可替代的作用(从酸碱平衡到免疫功能)。机体缺锌会导致多方面的负面影响，如基础代谢下降、影响生长发育、蛋白质利用率降低和食欲与消化功能低下等。据统计，世界上有17.3％的人群正处于缺锌状态。目前常使用氧化锌、硫酸锌或葡萄糖酸锌等无机锌作为人或动物机体的补锌剂。尽管金属盐是最常使用的，但它在体内的生物利用率低，并可能产生副作用。近年来的研究发现，与无机锌相比，在体内氨基酸、多肽类与锌螯合形成有机锌螯合物的生物学利用率比无机锌的高，只需摄入微量的有机锌就可以达到良好的补锌效果，并且可以避免无机锌在机体内因吸收不良而导致锌过量，进而产生对人体和环境的危害。目前，关于人工方法制备多肽并进而合成多肽-锌配合物的研究已有相关文献报道，问题是人工方法制备多肽的成本较高，而且多肽的生物活性较低，甚至没有生物活性。从天然产物中制取多肽源于天然动植物，而且活性较高，是多肽产品开发的重点发展方向。

在本申请者已获得的授权专利(一种锌-多肽配合物及其制备方法和应用ZL200810028217.8)中阐述了蛋白酶解多肽与锌配合形成多肽-锌复杂混合物的生物功能活性及其应用，但如何获得高纯度的多肽-锌配合物 仍是尚未解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的在于提出一种制备、分离、筛选单一多肽，并进而定向合成一种多肽与微量元素锌的配合物即单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，既有理论上的科学意义，又有很高的实用价值。为实现上述目的本发明的方案如下：

一种制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法：

首先将金属锌离子通过交联和螯合作用固定在高分子载体上，制备出锌离子亲和层析柱，并通过层析柱对水解蛋白多肽的亲和作用筛选出锌离子结合多肽，然后采用洗脱剂将亲和多肽洗脱下来，再定向合成单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物。

优选的，所述的高分子载体为葡聚糖G-25、壳聚糖或琼脂糖。

优选的，制备锌离子亲和层析柱包括以下步骤：

溶解：称取高分子载体，加入到质量百分比1％的乙酸溶液中，搅拌并微波处理，直至全溶解，获得质量百分比1.5％的高分子溶液；

乳化作用：在高分子溶液中加入乳化剂，恒温水浴温度50-55℃，以450rpm的速度连续搅拌1.0h；

交联作用：取质量百分比50％的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L的NaOH溶液，继续在50-55℃恒温水浴中450rpm的速度搅拌交联反应2h，获得高分子微粒；

活化：称取交联后的高分子微粒，并与环氧氯丙烷(ECH)混合，再加入1.2mol/L的NaOH溶液，放入50℃、130rpm的恒温水浴振荡器中，活化反应1.5h，取出用真空抽滤泵抽滤，用蒸馏水洗冲除去NaOH溶液；

接入配基：称取活化微粒，向其中加入亚氨基乙二酸(IDA)以及1.2mol/L NaOH溶液并放置于50℃、30rpm恒温振荡器中反应4h，再将混合液进行抽滤，用去离子水将微粒表面的IDA清洗干净，得到接入配基IDA的高分子微粒；

螯合Zn²⁺制备锌离子亲和介质：称取连接了IDA的微粒，向其中加入0.25mol/L的ZnSO₄溶液，在常温下震荡反应3h，将混合液倒入布氏漏斗进行抽滤，用去离子水洗涤微球得到高分子锌离子亲和层析胶，将滤液收集并稀释至50000倍，通过原子吸收分光光度法测定滤液中的锌离子含量，根据反应前锌离子浓度与滤液中锌离子浓度之差计算出层析胶螯合锌离子的量。

优选的，所述乳化剂为甘油或石蜡。

优选的，筛选出锌离子结合多肽，采用洗脱剂将亲和多肽洗脱包括以下步骤：

将制备的锌离子亲和介质装入层析柱中，再向其中注入质量百分比20％的罗非鱼水解蛋白多肽液使其经过层析柱，采用0.1mol/L EDTA溶液作为洗脱液，收集与锌离子结合的多肽组分。

优选的，定向合成单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物是指收集与锌离子结合的多肽，合成多肽-Zn(Ⅱ)配合物。

优选的，多肽N与乙酸锌的Zn质量配比为4:1，pH为4.5，反应温度为45℃，反应时间为40min，在此条件下，多肽与Zn²⁺发生配合作用生成多肽-锌配合物。

要制备出特定多肽-锌配合物，首先必须制备出单一多肽配基，但如何获取单一蛋白多肽一直是国内外一项极具难点的课题，需要建立特殊的技术方法才能实现单一多肽的制备。本发明提供的制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法具有如下有益效果：

(1)明确了锌离子亲和介质制备的技术参数，建立了一种通过制备的锌离子亲和介质从鱼蛋白水解产物的多肽混合物中筛选、分离出一种对锌离子有较强亲和力的多肽的有效方法，并分析揭示了获取单一多肽从N端至C端的氨基酸序列为(由12个氨基酸组成)：Thr-Phe-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Arg(苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-甘氨酸-脯氨 酸-精氨酸)。

(2)采用该发明所提供的从水解鱼蛋白混合物中获取单一锌离子亲和多肽的方法，制备出由12个氨基酸组成的单一多肽，并进而合成了多肽-Zn(Ⅱ)配合物。

(3)采用该法获取了单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物，为进一步探究其构效关系及人工设计合成该类配合物奠定基础。

附图说明

图1是本发明实施例制备工艺流程图；

图2是本发明实施例高分子微粒分离多肽图谱；

图3是本发明实施例高分子微粒固定化锌离子层析分离多肽图谱；

图4是本发明实施例多肽及多肽-锌配合物红外光谱图。

具体实施方式

本发明的目的通过下述方案来实现一种定向制备多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，制备工艺流程如图1所示：

1、高分子载体是指葡聚糖G-25、琼脂糖、壳聚糖，首选葡聚糖G-25。

2、溶解：称取1.5g高分子载体，加入到质量百分比1％的乙酸溶液中，搅拌并微波处理，直至全溶解，获得质量百分比1.5％的高分子溶液。

3、乳化作用：在高分子溶液中加入25mL甘油或石蜡作为乳化剂，恒温水浴温度50-55℃，以450rpm的速度连续搅拌1.0h。

4、交联作用：取0.5mL质量百分比50％的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L的NaOH溶液2mL，继续在50-55℃恒温水浴中450rpm的速度搅拌交联反应2h，获得高分子微粒。

5、活化：称取2g交联后的高分子微粒，并与10mL环氧氯丙烷(ECH)混合，再加入20mL1.2mol/L的NaOH溶液，放入50℃130rpm的恒温水浴振荡器中，活化反应1.5h，取出用真空抽滤泵抽滤，用蒸馏水洗冲除去NaOH溶液。

6、接入配基：称取活化微粒2g，向其中加入1.8g的亚氨基乙二酸 (IDA)以及20ml1.2mol/L NaOH溶液并放置于50℃130rpm恒温振荡器中反应4h。再将混合液倒入布氏漏斗中进行抽滤，用去离子水将微粒表面的IDA清洗干净，得到接入配基IDA的高分子微粒。

7、螯合Zn²⁺制备锌离子亲和介质：称取1.0g连接了IDA的微粒，向其中加入25ml0.25mol/L的ZnSO₄溶液，在常温下震荡反应3h。将混合液倒入布氏漏斗进行抽滤，用去离子水洗涤微球得到高分子锌离子亲和层析胶。将滤液收集并稀释至50000倍。通过原子吸收分光光度法测定滤液中的锌离子含量，根据反应前锌离子浓度与滤液中锌离子浓度之差计算出层析胶螯合锌离子的量。

8、多肽层析与洗脱：将制备的高分子锌离子亲和介质装入层析柱中，再向其中加入2ml质量百分比20％的罗非鱼水解蛋白多肽液使其经过层析柱；采用0.1mol/L EDTA溶液作为洗脱液，用紫外层析图谱***在波长280nm下检测多肽组分，收集与锌离子结合的多肽组分(洗脱的第二峰)，冷冻浓缩干燥备用。检测图谱如图2、图3所示。

9、多肽的纯化及氨基酸序列分析：上述制备的冷冻干燥多肽再经过反相高效液相色谱纯化及氨基酸序列分析，确定多肽的氨基酸组成是Arg、Gln、Gly₃、Phe₂、Pro₃、Thr、Val，多肽从N端至C端的氨基酸序列为Thr-Phe-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Arg(苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸)。

10、配合作用：多肽N与乙酸锌的Zn质量配比为4:1，pH为4.5，反应温度为45℃，反应时间为40min，在此条件下，多肽与Zn²⁺发生配合作用生成多肽-锌配合物。

11、如图4所示，多肽及多肽-锌配合物结构分析：从红外光谱图可以看出，多肽在3349cm^-1处有一个宽吸收峰，这是由酰胺的N-H的伸缩振动引起的，而在多肽-锌配合物的吸收带中，这个谱峰移至较低波数3294cm^-1处，红移了54.50cm^-1。多肽在2959cm^-1处的吸收峰，这是由-CH₃基团伸缩 振动引起的，在多肽-锌配合物中转变到2964cm^-1处，蓝移了5.30cm^-1，强度也减弱了，并且多肽-锌配合物在3077cm^-1处出现了吸收峰，说明Zn²⁺与多肽结合后，多肽的结构构型发生了改变。多肽在1650cm-¹附近有伸缩振动酰胺I带的特征谱峰，这是由酰胺的C＝O伸缩振动引起的。多肽与Zn²⁺结合后，这个谱带位置变换到了1655cm^-1，蓝移了5.30cm^-1。多肽在1596cm^-1处有一个吸收峰，可能是由C＝N、C＝C伸缩振动引起的，与Zn²⁺结合后这个峰消失了。多肽在在多肽吸收带1400cm^-1处有附近有伸缩振动酰胺III带的特征谱峰，这是由酰胺的N-H弯曲振动或C-N的伸缩振动引起的，在多肽-锌配合物的吸收带变换到1398cm^-1，红移了2.27cm^-1。接着观察光谱的指纹区，多肽在1113cm^-1和1048cm^-1处分别有一个特征峰，这是由C-O伸缩振动引起的，但多肽-锌配合物的这两个谱峰均消失了。在多肽吸收带652cm^-1处有附近有一个宽吸收峰，这是由N-H面外变形振动引起的，多肽与锌结合后这个谱带位置变换到669cm^-1，蓝移了16.65cm^-1。以上这些结果表明Zn²⁺与多肽的配合位置可能在N-H的氮原子与C＝O或C-O的氧原子上。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (3)

1.一种制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，其特征在于：

首先将金属锌离子通过交联和螯合作用固定在高分子载体上，制备出锌离子亲和层析柱，并通过层析柱对水解蛋白多肽的亲和作用筛选出锌离子结合多肽，然后采用洗脱剂将亲和多肽洗脱下来，再定向合成单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物；

制备锌离子亲和层析柱包括以下步骤：

溶解：称取高分子载体，加入到质量百分比1％的乙酸溶液中，搅拌并微波处理，直至全溶解，获得质量百分比1.5％的高分子溶液；

乳化作用：在高分子溶液中加入乳化剂，恒温水浴温度50-55℃，以450rpm的速度连续搅拌1.0h；

交联作用：取质量百分比50％的戊二醛滴加到上述溶液中，再加2mol/L的NaOH溶液，继续在50-55℃恒温水浴中450rpm的速度搅拌交联反应2h，获得高分子微粒；

活化：称取交联后的高分子微粒，并与环氧氯丙烷即ECH混合，再加入1.2mol/L的NaOH溶液，放入50℃、130rpm的恒温水浴振荡器中，活化反应1.5h，取出用真空抽滤泵抽滤，用蒸馏水洗冲除去NaOH溶液；

接入配基：称取活化微粒，向其中加入亚氨基乙二酸即IDA以及1.2mol/L NaOH溶液并放置于50℃、30rpm恒温振荡器中反应4h，再将混合液进行抽滤，用去离子水将微粒表面的IDA清洗干净，得到接入配基IDA的高分子微粒；

螯合Zn²⁺制备锌离子亲和介质：称取连接了IDA的微粒，向其中加入0.25mol/L的ZnSO₄溶液，在常温下震荡反应3h，将混合液倒入布氏漏斗进行抽滤，用去离子水洗涤微球得到高分子锌离子亲和层析胶，将滤液收集并稀释至50000倍，通过原子吸收分光光度法测定滤液中的锌离子含量，根据反应前锌离子浓度与滤液中锌离子浓度之差计算出层析胶螯合锌离子的量；

筛选出锌离子结合多肽，采用洗脱剂将亲和多肽洗脱包括以下步骤：

将制备的锌离子亲和介质装入层析柱中，再向其中注入质量百分比20％的罗非鱼水解蛋白多肽液使其经过层析柱，采用0.1mol/LEDTA溶液作为洗脱液，收集与锌离子结合的多肽组分；

多肽N与乙酸锌的Zn质量配比为4:1，pH为4.5，反应温度为45℃，反应时间为40min，在此条件下，多肽与Zn²⁺发生配合作用生成多肽-锌配合物；

所述的高分子载体为葡聚糖G-25或琼脂糖；

所述罗非鱼水解蛋白多肽液中包括单一多肽，该多肽从N端至C端的氨基酸序列为：

Thr-Phe-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Arg，即苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸。

2.如权利要求1所述的制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，其特征在于：所述乳化剂为甘油或石蜡。

3.如权利要求1所述的制备单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物的方法，其特征在于：

定向合成单一多肽-Zn(Ⅱ)配合物是指收集与锌离子结合的多肽，合成多肽-Zn(Ⅱ)配合物。