CN103464092B - 一种TiO2/硅藻土复合材料的制备及其纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种新型TiO2/硅藻土复合材料的制备及其纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,属于化学复合材料制备和生物活性物质纯化技术领域。本发明提供了一种改进的沉淀法制备负载型纳米TiO2的方法,并以这种负载型的复合材料为吸附载体分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽。本发明选用具有较大比表面积的硅藻土材料作为负载基体,将TiO2通过化学共沉淀法沉积在硅藻土表面,通过控制实验条件来控制制得的TiO2的粒子大小和晶型,制备得到的复合材料具有较大的比表面积和较好的覆盖率。将其应用于卵黄高磷蛋白磷酸肽的分离纯化,可提高其纯化效率和吸附载量。同时还可以将其应用于磷酸蛋白质组学的研究中,用于蛋白质磷酸化位点的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及复合材料制备和生物活性物质分离纯化技术领域,特别涉及一种采用金属氧化物负载活性载体的复合材料的制备,及其分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法。
背景技术
卵黄高磷蛋白是蛋黄中的主要含磷蛋白,一级结构中含有217个氨基酸残基,其中124个是丝氨酸残基,约占总氨基酸残基含量的56%。卵黄高磷蛋白中含有约-179的高净负电荷,是阳离子蛋白活性载体。已有众多研究表明,卵黄高磷蛋白可与Ca2+,Mg2+,Mn2+,Co2+,Sr2+,Fe2+,Fe3+等结合。另一方面,由于卵黄高磷蛋白与金属离子结合牢固,不易被水解,使得其生物学效价较低,不利于营养吸收。现已证实,能与钙形成可溶性络合物的主要功能团是磷酸酰丝氨酸残基,所以将磷酸酰丝氨酸残基含量高的卵黄高磷蛋白进行水解,其水解产物卵黄高磷蛋白磷酸肽可作为很好的钙吸收促进剂,不仅能增加钙在小肠内的吸收及其在体内的蓄积,而且卵黄高磷蛋白磷酸肽诱导的钙代谢无需维生素D的参与,且能促进铁、锌等离子的吸收。目前关于卵黄高磷蛋白磷酸肽研究仅限于实验室水平,采用的纯化方法为乙醇钙沉淀法、离子交换树脂等方法。
目前磷酸化蛋白质组学的研究中纯化磷酸化蛋白的方法有免疫沉淀法、固相金属离子亲和色谱、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱、离子交换和等电聚焦等。其中,金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(metal oxide/hydroxide affinity chromatography,MOAC)是近几年得到发展的磷酸肽富集技术。目前,研究主要集中在TiO2富集磷酸肽上,对Al(OH)3和ZrO2富集磷酸肽的研究也在同时开展。根据已有研究结果,TiO2是一种两性物质,由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和,TiO2在不同的pH值下可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性溶液中,,钛原子带正电表现为路易斯酸,可以与阴离子结合。实验表明,磷酸盐、硼酸盐、羧酸盐和硫酸盐都与TiO2具有高度的亲和力,其中TiO2与磷酸盐的结合能力最高。因此,调节适宜的pH,可以将TiO2用于磷酸肽的富集。采用TiO2富集磷酸肽具有特异性高、纯化倍数高、材料稳定性高,以及重复利用率高等优点。
目前,采用TiO2富集磷酸肽已有报道,但是尚未有人将其用于卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集。同时,由于采用粉末状TiO2富集磷酸肽时,受到TiO2粉末粒径的影响,使得其分离困难,需要采用离心,才能将TiO2与多肽溶液分离开。同时,TiO2粉末的回收困难,影响其重复利用。有研究表明,将TiO2固定化,使其负载在一些多孔性的载体上可以提高其比表面积和吸附性能。但是关于这类复合材料的研究主要集中在净化染料废水、制备光催化剂等方面。
到目前为止,尚未见采用TiO2复合材料作为吸附剂,用于卵黄高磷蛋白磷酸肽的分离纯化的报道。本发明采用一种改进的沉淀法制备负载型纳米TiO2的方法,并以这种负载型的复合材料为吸附载体分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TiO2/硅藻土复合材料的制备方法,制备的复合材料形貌规整、粒径均一、性质稳定,具有良好的生物相容性。采用所制备的TiO2/硅藻土复合材料分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽,操作简便、成本低廉,生产周期短,且易于大规模化生产卵黄高磷蛋白磷酸肽,解决了传统卵黄高磷蛋白磷酸肽分离工艺复杂、步骤繁多等问题。
本发明提供的TiO2/硅藻土复合材料的制备及其分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,实施方案如下:
1.化学沉淀法制备TiO2/硅藻土复合材料,步骤如下:
(1)称取一定量的硅藻土分散在固液比为1∶1~1∶10的稀盐酸中,搅拌反应3~4h,然后调节pH值,过滤、洗涤,煅烧,得到较纯的载体硅藻土,其中稀盐酸的浓度为0.01~2M,pH值为4~10;
(2)称取一定质量的提纯硅藻土,加入固液比为1∶10~1∶40,浓度为0.01~2M的盐酸,搅拌30min,然后按比例加入一定体积的TiCl4溶液,继续搅拌2~3h,然后调节反应体系的pH值至4~8,在搅拌条件下反应1~2h,终止反应。过滤,用去离子水洗涤材料至滤液中不含Cl离子,所用搅拌速率为400~600rpm;
(3)将上述材料烘干,在300~800℃下煅烧4~8h,得到TiO2/硅藻土复合材料。
2、应用制得的TiO2/硅藻土复合材料纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽,工艺为:
(1)用丙酮-乙醇提取法将蛋黄粉中的脂质脱去,丙酮与蛋黄粉的体积比为5∶1~9∶1,乙醇与蛋黄粉的体积比为4∶1~8∶1,得到的脱脂蛋黄粉用0.1M~2M的NaOH溶液脱磷,脱脂蛋黄粉与NaOH溶液的固液比为1∶10~1∶100,超滤除去游离的磷酸根,再经过蛋白酶酶解得到粗蛋黄酶解产物;
(2)将TiO2/硅藻土复合材料加入到上述酶解液中,调节pH值为2~6,在4~50℃下搅拌吸附10~120min,过滤,将吸附有卵黄高磷蛋白磷酸肽的复合材料从酶解液中分离出来,用去离子水清洗三次去除未吸附的非磷酸肽,用洗脱液进行洗脱,洗脱液选用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1M,pH9~11),碳酸钠(0.1M)和氢氧化钠(0.1M)中的任何一种,收集洗脱液,干燥后可得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供了一种化学沉淀法制备TiO2/硅藻土复合材料的方法,制得的复合材料 形貌规整,粒径均一,具有较好的材料稳定性,同时在水溶液中具有良好的分散性,可用于卵黄高磷蛋白磷酸肽的分离纯化。
(2)本发明提供的卵黄高磷蛋白磷酸肽酶的纯化方法操作简单、分离纯化周期较短,从吸附、清洗到洗脱整个过程在2~3h内完成。
(3)以TiO2/硅藻土复合材料通过静电相互作用能与粗蛋黄酶解产物中的卵黄高磷蛋白磷酸肽发生特异性吸附,所得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品的产率和纯度较高。
(4)本发明提供的卵黄高磷蛋白磷酸肽纯化工艺反应条件温和,磷酸肽的活性保留率较高。
(5)本工艺中卵黄高磷蛋白磷酸肽的吸附、清洗和洗脱过程可以进行连续化生产操作,整个工艺可以进行工业化连续操作。
附图说明
图1是TiO2/硅藻土复合材料的热重分析图;
图2是TiO2/硅藻土复合材料透光率%图。
具体实施方式
实施例1
称取一定量的硅藻土分散在固液比为1∶10的稀盐酸中,搅拌反应3h,然后调节pH值至5.0,然后过滤、洗涤,煅烧,得到较纯的载体硅藻土,其中稀盐酸的浓度为2M,pH值为4。称取一定质量的提纯硅藻土,加入固液比为1∶10,浓度为2M的盐酸,搅拌30min,然后按比例加入一定体积的TiCl4溶液,继续搅拌2h,然后调节反应体系的pH值至4,再搅拌条件下反应2h,终止反应。过滤,用去离子水洗涤材料至滤液中不含Cl离子,所用搅拌速率为500rpm。将上述材料烘干,在800℃下煅烧5h,得到TiO2/硅藻土复合材料。
用丙酮-乙醇提取法将蛋黄粉中的脂质脱去,丙酮与蛋黄粉的体积比为6∶1,乙醇与蛋黄粉的体积比为6∶1,得到的脱脂蛋黄粉用0.1M~2M的NaOH溶液脱磷,脱脂蛋黄粉与NaOH溶液的固液比为1∶50,超滤除去游离的磷酸根,再经过蛋白酶酶解得到粗蛋黄酶解产物;
将TiO2/硅藻土复合材料加入到上述酶解液中,调节pH值为4,在37℃下搅拌吸附60min,过滤,将吸附有磷酸肽的复合材料从酶解液中分离出来,用去离子水清洗三次去除未吸附的非磷酸肽,用碳酸钠(0.1M)进行洗脱,收集洗脱液,干燥后可得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品。
实施例2
称取一定量的硅藻土分散在固液比为1∶10的稀盐酸中,搅拌反应3h,然后调节pH值至4.0,然后过滤、洗涤,煅烧,得到较纯的载体硅藻土,其中稀盐酸的浓度为2M,pH值为4。称取一定质量的提纯硅藻土,加入固液比为1∶10,浓度为0.1M的盐酸,搅拌30min,然后按 比例加入一定体积的TiCl4溶液,继续搅拌2h,然后调节反应体系的pH值至6,再搅拌条件下反应2h,终止反应,过滤,用去离子水洗涤材料至滤液中不含Cl离子,所用搅拌速率为400rpm。将上述材料烘干,在500℃下煅烧5h,得到TiO2/硅藻土复合材料。
用丙酮-乙醇提取法将蛋黄粉中的脂质脱去,丙酮与蛋黄粉的体积比为6∶1,乙醇与蛋黄粉的体积比为6∶1,得到的脱脂蛋黄粉用0.1M~2M的NaOH溶液脱磷,脱脂蛋黄粉与NaOH溶液的固液比为1∶50,超滤除去游离的磷酸根,再经过蛋白酶酶解得到粗蛋黄酶解产物;
将TiO2/硅藻土复合材料加入到上述酶解液中,调节pH值为5,在37℃下搅拌吸附60min,过滤,将吸附有磷酸肽的复合材料从酶解液中分离出来,用去离子水清洗三次去除未吸附的非磷酸肽,用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1M,pH10)进行洗脱,收集洗脱液,干燥后可得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品。
Claims (6)
1.一种利用TiO2/硅藻土复合材料分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征是采用改进的化学沉淀法,将二氧化钛(TiO2)负载在硅藻土载体表面,制得复合材料,并以该复合材料为吸附载体分离磷酸肽;TiO2/硅藻土复合材料的制备工艺为:
(1)称取一定量的硅藻土分散在一定浓度的盐酸中,搅拌反应1~6h,然后调节pH值至中性,过滤、洗涤,煅烧,得到较纯的载体硅藻土;
(2)称取一定质量的提纯硅藻土,加入一定体积的盐酸,搅拌30min,然后按比例加入一定体积的四氯化钛(TiCl4)溶液,继续搅拌1~5h,然后调节反应体系的pH值,再搅拌条件下反应2~4h,终止反应后过滤,用去离子水洗涤材料;
(3)将上述材料烘干,在一定的温度下煅烧,得到TiO2/硅藻土复合材料;
应用制得的TiO2/硅藻土复合材料纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的工艺为:
(1)用丙酮-乙醇提取法将蛋黄粉中的脂质脱去,丙酮与蛋黄粉的体积比为6∶1~9∶1,乙醇与蛋黄粉的体积比为4∶1~8∶1,得到的脱脂蛋黄粉用NaOH溶液脱磷,超滤除去游离的磷酸根,再经过蛋白酶酶解得到粗蛋黄酶解产物;
(2)将TiO2/硅藻土复合材料加入到酶解液中,在一定温度下搅拌吸附10~120min,过滤,将吸附有卵黄高磷蛋白磷酸肽的复合材料从酶解液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,用洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,干燥后得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品。
2.根据权利要求1所述的分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征在于使用TiCl4作为反应底物;使用载体为硅藻土;其中复合材料中TiO2与硅藻土的质量比为1∶4~4∶1。
3.根据权利要求1所述的分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征在于反应体系最终的pH值为3~9。
4.根据权利要求1所述的分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征在于复合材料的煅烧温度为300~800℃。
5.根据权利要求1所述的分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征在于洗脱液选用0.1M,pH 9~11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,0.1M的碳酸钠和0.1M的氢氧化钠中的任何一种。
6.根据权利要求1所述的分离卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法,其特征在于纯化工艺中所述搅拌的速率为100~400rpm。
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