CN111537739A - 一种单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明提供单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、是硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：其中，洗涤的抗原喷涂于所述是硝酸纤维素膜上形成检测线，荧光标记的兔抗羊抗体喷涂于C线处形成质控线，荧光标记的羊抗鼠抗体喷涂于反应微孔，用于捕捉待测目标抗体。另外，本发明还提供了单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条在检测单克隆抗体效价和特异性荧光中的应用。本发明的试纸条灵敏度高、测试结果无漏检、时间短。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条。
背景技术
1975年德国学者Kohler和Milstein成功将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞既具有可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体的B淋巴细胞特性，同时也具有瘤细胞无限增殖的特性。杂交瘤技术的创建，开创了抗体制备的新纪元，结合纳米粒子、电化学、核酸传感器和芯片等新材料和新技术的改进，使得单克隆抗体已经广泛应用于食品安全有害物检测、疾病早期筛查和免疫治疗等领域。
在单克隆抗体的实际应用过程中，如何快速的挑选出特异性较好、广谱性强、效价高的抗体或杂交瘤显得尤为关键。目前，对单克隆抗体的筛选、效价的测定均依赖间接ELISA方法，该方法主要是将抗原固定在固相载体上，封闭，洗脱，与目标的抗体孵育，洗脱，与酶标抗体孵育，洗脱，形成抗原-抗体-酶标抗体的三元复合物，催化底物形成有色物质，产物的量与抗体的量直接相关，每次测定时间需要5h-24h，劳动强度高，时间长。
单克隆抗体的特异性不仅针对抗原特异性，还包括针对抗原近亲家族的特异性，同时包括测试体系中的交叉反应特异性。
目前，针对抗原特异性的杂交瘤分选方法除了上述的间接ELISA法，还有基于半固体的细胞膜荧光免疫吸附测定法、流式细胞仪分选方法、全自动高效细胞株筛选***ClonePix FL等方法。基于半固体的细胞膜荧光免疫测定法主要是将抗原与油链连接，与荧光标记的二抗一起加入到含有杂交瘤细胞的半固体培养基中，油链锚定在瘤细胞膜上，分泌的抗体与锚定在瘤细胞上的抗原结合，荧光标记的二抗与抗体结合，洗脱未结合的抗原和二抗，通过倒置荧光显微镜观察，最终在产抗原特异性的抗体的杂交瘤细胞周围形成绿色荧光聚集的现象。流式细胞仪分选方法主要是通过将荧光标记的抗原和IgG与杂交瘤一起孵育，经流式细胞仪探测器对含有双荧光信号的杂交瘤进行识别和挑选。全自动高效细胞株筛选***ClonePix FL则是通过荧光标记的抗原或者荧光二抗包埋在半固体培养基中，杂交瘤分泌的抗体与荧光标记的抗原或者抗体结合形成聚合物，呈现荧光聚集的现象，通过仪器的识别、定位和挑选，实现对产抗原特异性抗体或者产抗体的杂交瘤进行挑选。而对抗原近亲家族的特异性和测试体系交叉反应特异性依然只依赖间接ELISA方法，需要将不同的测试物包被在微孔中，并做好相关的记录，按照上述测抗原特异性的方法进行测试，这种方法费时费力，难以将高质量可大范围应用的抗体挑选出来。
因此，设计一种检测便捷、快速的试纸条，可大大提高单克隆抗体筛选和制备的效率，能够使高质量的抗体得到快速的应用。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条。
本发明提供了一种单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、是硝酸纤维素膜和吸水垫，具有这样的特征：其中，洗涤的抗原喷涂于是硝酸纤维素膜上形成检测线，荧光标记的兔抗羊抗体喷涂于C线处形成质控线，荧光标记的羊抗鼠抗体喷涂于反应微孔，用于捕捉待测目标抗体。
本发明还提供了单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条在检测单克隆抗体效价和特异性荧光中的应用。
发明的作用与效果
本发明的单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，能够进行便捷、快速的单克隆抗体效价及特异性快速测定，可大大提高单克隆抗体筛选和制备的效率，能够使高质量的抗体得到快速的应用。
附图说明
图1是本发明实施例中测单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条结构示意图；
图2是本发明实施例中测单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条T线不同抗原浓度测试结果图；
图3是本发明实施例中单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条中不同荧光二抗浓度测试结果图；
图4是本发明实施例中测效价“梳子”荧光试纸条组装结构示意图；
图5是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞D3细胞上清中抗体效价结果；
图6是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7腹水中抗体效价结果图；
图7是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7纯化后的抗体效价结果图；
图8是本发明实施例中荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157：H7 D3细胞上清中单克隆抗体特异性测试结果图；
图9是本发明实施例中荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157：H7 E7细胞上清中单克隆抗体特异性测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
实施例：
本实施例中采用的主要试剂以及主要仪器如下所示：
主要试剂
PVP、TWEEN-20国药集团化学试剂有限公司；样品垫、吸水垫上海金标生物科技有限公司；BSA上海杰一生物技术有限公司；FITC上海索莱宝生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)95赛多利斯；羊抗鼠、兔抗羊洛阳佰奥通实验材料中心。出血性大肠杆菌O157:H7D3杂交瘤和E7杂交瘤为本实验室所有。
主要仪器
高压蒸汽灭菌锅购自日本TOMY；酶标仪SpectraMax M2购自Molecular Devices；Nanodrop 2000C购自Thermo Scientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTMLP 358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
一、测效价荧光试纸条组建
1、试纸条组建
图1是本发明实施例中测单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条结构示意图。
如图1所示，单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条100，包括：样品垫1、硝酸纤维素膜2、检测线3、质控线4，吸水垫5和PVC底板6。PVC底板6在最下层，其次是硝酸纤维素膜2即NC膜，硝酸纤维素膜居于中间，两端分别连着样品垫1和吸水垫5，NC膜2上具有检测线3和质控线4，检测线3靠近样品垫1一侧。
此外，洗涤的抗原喷涂于NC膜2上形成检测线，和普通侧向层析试纸条不同的是，该试纸条100检测线3喷涂的为灭活的细菌抗原而非抗体，荧光标记的兔抗羊抗体喷涂于C线处形成质控线4，荧光标记的羊抗鼠抗体喷涂于反应微孔，用于捕捉待测目标抗体。
2、T线抗原浓度优化
大肠杆菌O157:H7活化后，挑取单菌落，接种于液体培养基中，于恒温摇床180rpm/min培养16h，加入0.3％甲醛常温灭活6小时，取菌悬液，5000rpm离心5min，用无菌的PBS洗三次，浓缩，测定激发波长600nm处的吸光值(A600)，对半稀释，同时，采用倾注法测定菌的含量，结果如表1所示。采用羊抗鼠抗体喷涂于C线作为质控线，制备试纸条，按照不同T线抗原浓度的试纸条，依照表1.1T线抗原浓度分别进行测试。每个T线抗原浓度的试纸条同时测定阳性结果和阴性结果，阳性采用50μL大肠杆菌O157:H7细胞上清与10μL荧光二抗的混合物，阴性采用50μL PBS与10μL的荧光二抗的混合物。
表1试纸条T线浓度A600
| 编号 | 1/2 | 3/4 | 5/6 | 7/8 | 9/10 |
| A600 | 0.5695 | 0.8677 | 1.1219 | 1.3336 | 1.5144 |
| 菌浓度 | 6.9*10<sup>7</sup> | 1.38*10<sup>8</sup> | 2.76*10<sup>8</sup> | 5.52*10<sup>8</sup> | 1.1*10<sup>9</sup> |
图2是本发明实施例中测单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条T线不同抗原浓度测试结果图。
将试纸条***含有待测样本的微孔中，且微孔至于温度37℃反应10-15min，结果如图2所示。从图中可以看出，随着菌的浓度增加，T线越来越亮，且阴性试纸条均未出现条带。当T线菌的OD值达到1.12以上时，试纸条T线较亮，其中T线菌的OD值达到1.5144,试纸条T线最亮。C线采用羊抗鼠抗体制备试纸条时，阴性试纸条的C线较亮，而阳性的试纸条C线较弱，说明C线采用羊抗鼠抗体不适合，另外C线试纸条的宽度相对T线来说，要细一些，可增加C线的喷线量。
2、荧光二抗浓度优化
增加C线的喷线量为1.5μL/cm，同时将C线羊抗鼠抗体换成兔抗羊抗体，制备试纸条。
图3是本发明实施例中单克隆抗体效价和特异性荧光试纸条中不同荧光二抗浓度测试结果。
保持细胞上清体积不变，逐步增加FITC-羊抗鼠的体积，并同时做相应的阴性试纸条对照。1/2号试纸条荧光二抗体积为5μL，3/4号试纸条荧光二抗体积为10μL，5/6号试纸条荧光二抗体积为15μL，7/8号试纸条荧光二抗体积为20μL，9/10号试纸条荧光体积为25μL，11/12号试纸条荧光二抗体积为30μL，测试结果如图3所示，6号试纸条最亮，且5号试纸条没有假阳性。因此，后续的实验，荧光二抗使用量比例为细胞上清：荧光二抗浓度体积比为50:15。
二、测效价“梳子”试纸条组建
图4是本发明实施例中测效价“梳子”荧光试纸条组装结构示意图。
将上述优化好的试纸条，进行了NC膜和样品垫的组装之后，使每个试纸条之间间隙保持0.5cm-0.7cm，且统一固定在PVC底板上，最后覆盖上一整块吸水垫，压紧，结果如图4所示。
三、测试单克隆抗体特异性试纸条组建
按照上述优化好的条件，对出血性大肠杆菌的近亲家族的大肠杆菌和交叉反应体系测试菌株分别进行扩大培养，革兰氏阳性菌采用脑心浸液培养，革兰氏阴性菌采用营养肉汤培养，培养后进行灭活，用无菌PBS洗涤，并浓缩，结果如表2，并喷线组装制备试纸条。
表2试纸条线不同菌株浓度A600吸光值
三、“梳子”试纸条测不同样本中抗体效价
1、测细胞上清效价
将大肠杆菌杂交瘤O157:H7 D3杂交瘤细胞上清按照1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600梯度进行稀释，每个稀释梯度取100μL用于间接ELISA测定效价，同时取100μL用于荧光试纸条测试效价，荧光二抗使用量按照细胞上清与荧光二抗体积比50:15，应取30μL混合进行“梳子”试纸条测试。
细胞上清、腹水及纯化后单克隆抗体效价测定的步骤如下：
步骤1，加入100uL的108菌液于所设定的孔中进行包被；
步骤2，37℃避光孵育2小时或者4℃过夜；
步骤3，洗板2次，每次加入220uL 1×PBST，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
步骤4，每孔加入220uL3％BSA封闭液封闭菌板；
步骤5，37℃避光孵育1.5小时或者4℃过夜；
步骤6，洗板2次，每次加入220uL 1×PBST，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
步骤7，将待测抗体按照倍比梯度稀释，充分混匀；
步骤8，在每孔中加入100uL稀释过不同梯度的一抗，轻轻摇动微孔板混匀；
步骤9，室温37℃避光孵育1小时；
步骤10，洗板3次，每次加入220uL 1×PBST，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
步骤11，每孔加入100uL1×二抗(避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖微孔板)；
步骤12，室温37℃避光孵育1小时；
步骤13，洗板3次，每次加入220uL1×PBST，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
步骤14，加入100uL的TMB显色液(配制好的显色液无色，出现颜色变化不能使用)；
步骤15，室温37℃避光孵育10-15分钟，加入50uL的终止液终止反应，在450nm下读OD值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。
图5是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞D3细胞上清中抗体效价结果图。
间接ELISA测试结果如表3，按照阳性OD值/阴性OD值大于2.1倍为阳性判定标准，间接ELISA测试结果为细胞上清效价为400倍。梳子试纸条测试效价结果如图5所示，在稀释比为1600倍时，“梳子”试纸条7号试纸条具有弱条带，8号试纸条(阴性)没有条带，“梳子”试纸条测定细胞上清的效价为1600倍。
表3细胞上清中抗体效价间接ELISA测定结果
2、测腹水效价
图6是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7腹水中抗体效价结果图。
将大肠杆菌杂交瘤O157:H7 D3杂交瘤制备的腹水按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释梯度进行稀释，每个稀释梯度取100μL用于间接ELISA测定效价，具体方法如上，同时取100μL细胞上清与30μL荧光二抗混合进行“梳子”试纸条测试。间接ELISA测试结果如表4，按照阳性OD值/阴性OD值大于2.1倍为阳性判定标准，间接ELISA测试结果为腹水中抗体效价为4000倍。梳子试纸条测试效价结果如图6所示，在稀释比为8000倍时，“梳子”试纸条5号试纸条具有弱条带，8号试纸条(阴性)没有条带，“梳子”试纸条测定细胞上清的效价为8000倍。
表4腹水中抗体效价间接ELISA测定结果
3、测纯化后抗体效价
图7是本发明实施例中“梳子”荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7纯化后的抗体效价结果图。
将大肠杆菌杂交瘤O157:H7 D3杂交瘤细胞上清按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释梯度进行稀释，每个稀释梯度取100μL用于间接ELISA测定效价，具体方法如上，同时取100μL细胞上清与30μL荧光二抗混合进行“梳子”试纸条测试。间接ELISA测试结果如表5，按照阳性OD值/阴性OD值大于2.1倍为阳性判定标准，间接ELISA测试结果为细胞上清效价为32000倍。梳子试纸条测试效价结果如图7所示，在稀释比为64000倍时，“梳子”试纸条7号试纸条具有弱条带，8号试纸条(阴性)没有条带，“梳子”试纸条测定细胞上清的效价为64000倍。
表5腹水中抗体效价间接ELISA测定结果
四、细胞上清单克隆抗体特异性测试
1、出血性大肠杆菌O157:H7 D3细胞上清特异性测试
将出血性大肠杆菌O157:H7 D3杂交瘤细胞上清与荧光二抗按照比例50:15的比例进行混合，阴性采用PBS与荧光二抗也按照比例50:15的比例进行测试，每个测试同时测定阳性和阴性。同时，提前将不同的抗原包被在微孔中，并做好记录，在测定细胞上清的单克隆抗体特异性的同时，取100μL用于间接ELISA特异性测试，其他步骤与上述间接ELISA法测效价相同。
图8是本发明实施例中荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157：H7 D3细胞上清中单克隆抗体特异性测试结果图。
间接ELISA测试结果如表6，按照阳性OD值/阴性OD值大于2.1倍为阳性判定标准，间接ELISA特异性测试结果为D3杂交瘤细胞上清单克隆抗体能结合出血性大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889和NCTC 12900，不能结合ATCC 43895，有漏检的情况，与其他大肠杆菌近亲家族及其他致病菌均无交叉反应。D3细胞上清单克隆抗体试纸条测试结果如图8所示，通过阳性和阴性试纸条的测试结果比对，D3细胞上清单克隆抗体能够与三株出血性大肠杆菌O157：H7结合，实现了全覆盖，无漏检。29号试纸条阳性结果比阴性结果要亮，但30号试纸条C线与T相比较，几乎一样亮，这个可能与试纸条的干燥均匀度及干燥时间有关系，因此判定D3杂交瘤细胞上清与金黄色葡萄球菌ATCC 29213无交叉反应。由图8也可以看出，阳性结果均比阴性几乎一样，或者比阴性结果弱，D3杂交瘤细胞上清单克隆抗体与其他菌株均无交叉反应。综上所述，单克隆抗体特异性试纸条测试结果与间接ELISA测试的结果几乎高度一致，其中，间接ELISA测试结果出现漏检的现象，而试纸条测试结果表面，D3细胞上清单克隆抗体实现了对目标菌株的全覆盖。
表6 D3杂交瘤细胞上清间接ELISA测试结果
2、出血性大肠杆菌O157:H7 E7细胞上清特异性测试
将出血性大肠杆菌O157:H7 D3杂交瘤细胞上清与荧光二抗按照比例50:15的比例进行混合，阴性采用PBS与荧光二抗也按照比例50:15的比例进行测试，每个测试同时测定阳性和阴性。同时，提前将不同的抗原包被在微孔中，并做好记录，在测定细胞上清的单克隆抗体特异性的同时，取100μL用于间接ELISA特异性测试，测试方法如上。
图9是本发明实施例中荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157：H7 E7细胞上清中单克隆抗体特异性测试结果图。
间接ELISA测试结果如表7，按照阳性OD值/阴性OD值大于2.1倍为阳性判定标准，间接ELISA特异性测试结果为E7杂交瘤细胞上清单克隆抗体能结合出血性大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889和NCTC 12900，不能结合ATCC 43895，有漏检的情况，与其他大肠杆菌近亲家族及其他致病菌均无交叉反应。D3细胞上清单克隆抗体试纸条测试结果如图9所示，通过阳性和阴性试纸条的测试结果比对，D3细胞上清单克隆抗体能够与三株出血性大肠杆菌O157：H7结合，实现了全覆盖，无漏检。由图9也可以看出，阳性结果均比阴性几乎一样，或者比阴性结果弱，D3杂交瘤细胞上清单克隆抗体与其他菌株均无交叉反应。综上所述，单克隆抗体特异性试纸条测试结果与间接ELISA测试的结果几乎高度一致，其中，间接ELISA测试结果出现漏检的现象，而试纸条测试结果表面，E7细胞上清单克隆抗体实现了对目标菌株的全覆盖。
表7 E7杂交瘤细胞上清间接ELISA测试结果
实施例的作用与效果
以上实施例中的单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，由于采用了新的试纸条，实验结果显示，与间接ELISA方法对比，单克隆抗体测效价快速测定免疫荧光试纸条灵敏度高，基于同样结构的单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条与间接ELISA特异性测试结果高度一致，且间接ELISA测试结果出现漏检，单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条测试结果无漏检，时间仅需10-15min。
此外，本实施例的单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，能够进行便捷、快速的单克隆抗体效价及特异性快速测定，可大大提高单克隆抗体筛选和制备的效率，能够使高质量的抗体得到快速的应用。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、是硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：
其中，洗涤的抗原喷涂于所述是硝酸纤维素膜上形成检测线，荧光标记的兔抗羊抗体喷涂于C线处形成质控线，荧光标记的羊抗鼠抗体喷涂于反应微孔，用于捕捉待测目标抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体效价快速测定免疫荧光试纸条在检测单克隆抗体效价和特异性荧光中的应用。
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