CN104089949A - 胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒、其制备方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒及其检测方法，包括磁分离试剂的制备、酶反应物的制备、反应增强剂的配制、校准品稀释液的配制、校准品和质控品的配制、清洗浓缩液的配制和底物溶液的配制七个步骤。本发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒及其检测方法具有较高的灵敏度和特异性，更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式，还能区分小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），对肺癌的早期诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒、其制备方法及检测方法，所述定量测定试剂盒广泛用于包括小细胞肺癌在内的多种肺癌的早期发现和治疗监测、复发监测等。
背景技术
由于人口老龄化、城市工业化、吸烟、空气与环境污染、遗传易感等因素的影响，我国肺癌的发病率和死亡率迅速上升。根据《2012年肿瘤登记年报》统计数据显示：肺癌已代替肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因。目前，我国每4例恶性肿瘤死亡者中就有1例是肺癌。
肺癌主要分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。 NSCLC约占肺癌的80%，包括大细胞癌、腺癌和鳞癌。相比NSCLC，由于SCLC仅占肺癌的15－20%，因此不管是诊断还是治疗领域，SCLC获得的关注度都较低。但SCLS却是一种恶性化程度更高、病因更复杂的肿瘤，具有快速和侵袭性生长的特点，易发生广泛性坏死和***转移。
胃泌素释放肽前体（ProGRP）作为小细胞肺癌（SCLC）新的标记物，具有敏感性高、特异性强的特点，并可准确反映小细胞肺癌（SCLC）病情及对化疗的反应。因此，将对小细胞肺癌（SCLC）的诊断具有较高敏感度，特异度和准确率的胃泌素释放肽前体（ProGRP）作为提示小细胞肺癌（SCLC）的血清肿瘤标志物，可为临床鉴定小细胞肺癌（SCLC）提供参考依据。胃泌素释放肽前体作为血清肿瘤标志物，不仅可用于小细胞肺癌（SCLC）的早期诊断，还有助于判断治疗效果及早期发现肿瘤复发。另外，胃泌素释放肽前体还能区分小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。目前，国内外采用酶联免疫方法测定胃泌素释放肽前体（ProGRP）已处于临床应用阶段，但是酶联免疫法灵敏度不高，不易检测出痕量胃泌素释放肽前体（ProGRP），影响对小细胞肺癌（SCLC）检测的准确性。
ELISA技术由于其分析灵敏度不高，因而限制了其发展与使用。本发明结合了免疫反应的高特异性和化学发光反应的高灵敏性，仪器简单，成本低廉，检测范围更广，发展潜力更大，因而受到了越来越多的关注。
经专利检索表明，北京科美东雅生物技术有限公司在2008年有申请专利号为CN 101368966的专利——一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒。但这项专利并没有涉及磁颗粒，不会影响到我们公司对本发明的专利申报。本发明利用磁颗粒，能够使该发明的灵敏度提高、特异性增强，增加了诊断的准确性。
发明内容
本发明目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简单的胃泌素释放肽前体（ProGRP）板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒、其制备方法及其检测方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有微孔板和位于盒体底部的支撑板，其中微孔板由48或96个微孔组成，支撑板上开有多个孔，所述孔内共放置有八个试剂瓶，所述八个试剂瓶内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有胃泌素释放肽前体（ProGRP）单克隆抗体包被的磁颗粒。
一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒的制备方法，其试剂准备过程如下：
步骤一、磁分离试剂的制备
一、磁珠缓冲液配制
（1）、称取缓血酸胺TRIS 4.58g和NaCl 6.81g于1L容器中，然后称取0.96g Tween-20（吐温20）于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；
（2）、用移液器将防腐剂Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入 800mL纯化水，充分搅拌；
（3）、调节pH计测量其pH值，控制pH在7.95-8.05之间；
（4）、称取BSA（牛血清白蛋白） 3g倒入上述1L容器中；
（5）、最后1L容器定容至1000mL，用0.2μm滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的制备
（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50μL DMSO中，取2mg抗ProGRP单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液（磷酸盐缓冲液）中至总体积为1mL；
（2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述ProGRP单克隆抗体溶液中，置室温90min；
（3）、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5mL；
（4）、取0.5mL磁珠加入5mL反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2min后吸取上清；
（5）、每次加入1.5mL pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4h；
（6）、加入0.3mL 1mol/L的TRIS溶液 37℃15min；
（7）、每次加入1.5mL pH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；
（8）、用100mL磁珠保存液将磁珠转入125mL玻璃瓶，即为0.05％的ProGRP磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％Tween-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；
（9）、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
步骤二、酶反应物的制备
步骤三、反应增强剂的配制
（1）、称取TRIS 1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将 Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
（2）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调pH值，控制pH在7.35-7.45之间；
（3）、称取阻断剂Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000mL，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤；
步骤四、校准品稀释液的配制
步骤五、校准品和质控品的配制
步骤六、清洗浓缩液的配制
（1）、称取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中；
（2）、称取0.225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
（3）、用移液器将Proclin-300量取0.225mL于盛有15mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
（4）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；
（5）、调pH，控制其范围在7.35-7.45之间；
（6）、最后定容至1000mL，完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得；
步骤七、底物溶液的配制
一、底物溶液A的配制步骤
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；
（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05之间；
（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得；
二、底物溶液B的配制
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和防腐剂PC300 250μL于1L烧杯中；
（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH控制其范围在7.95-8.05之间；
（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。
一种胃泌素释放肽前体（ProGRP）的检测方法，包括如下步骤：
（一）样品的前处理：
使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体、校准品/待测样品、ProGRP抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15-30min，使它们平衡到室温；之后，将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否工作正常。
（二）操作步骤：
（1）、加50μL胃泌素释放肽前体（ProGRP）校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；
（2）、加50μL酶反应物至每一微孔中；
（3）、加50μL反应增强剂至每一微孔中；
（4）、加50μL磁分离试剂至每一微孔中；
（5）、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37℃水浴30min；
（6）、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2min；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
（7）、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μL稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；
（8）、重复步骤（6）、（7）、（6）一遍；
（9）、加100μL底物溶液至微孔中混匀3s，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
（10）、以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出标准曲线（双对数曲线），以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的ProGRP的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为ProGRP浓度（单位为pg/mL）。
本发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定检测方法，所述底物溶液的制备包括以下步骤：
工作原理：
本发明为双抗体夹心法化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标ProGRP抗原、结合着磁性微粒的ProGRP单克隆抗体及稳定增强剂。37℃孵育后，酶标ProGRP抗原与标本、校准品和质控品中ProGRP竞争的与结合着磁性微粒的ProGRP单克隆抗体发生特异性结合。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，反应的发光强度与样本中的ProGRP浓度成反比。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强。
2、本发明对所用的原材料进行筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性，磁颗粒的吸附性能和变异大小，（HRP）的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等，对于（HRP）的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简单、产率高、成本低、质量可靠的标记方法。
3、本发明采用一种新的专用稳定增强剂以及清洗浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本。
4、试剂盒中的磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品，清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
5、本发明采用微孔板磁颗粒整合了两种技术，主要体现在：（1）利用磁颗粒在相同体积的情况下表面积最大的原理，能够结合更多的抗体，从而使得反应的灵敏度更高，线性范围更宽；（2）可以同时批量测量，适合大批量血清筛查。
综上，本发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒及其检测方法具有较高的灵敏度和特异性，更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式，还能区分小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），对肺癌的早期诊断具有重要意义。
附图说明
图1为本发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒及其检测方法的结构示意图。
图2为图1去掉盒盖和微孔板后的俯视图。
图3为图1中微孔板的结构示意图。
其中：
盒体1
盒盖2
支撑板3
孔4
试剂瓶5
微孔板6
微孔7。
具体实施方式
参见图1-图3，本发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒，包括盒体1和盒体上方的盒盖2，所述盒体1内设有微孔板6和位于盒体1底部的由泡沫塑料制成的支撑板3，其中微孔板6由48或96个微孔7组成，支撑板3上开有多个孔4，所述孔4内共放置有八个试剂瓶5，所述八个试剂瓶5内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有胃泌素释放肽前体（ProGRP）单克隆抗体包被的磁颗粒。
制备方法
步骤一、磁分离试剂的制备
一、磁珠缓冲液配制
1、称取TRIS 4.58g和NaCl 6.81g于1L容器中，然后称取0.96g Tween-20于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800mL纯化水，充分搅拌；
3、调节pH计测量其pH值，控制pH在7.95-8.05之间；
4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；
5、最后1L容器定容至1000mL，用0.2μm滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存。
二、磁分离试剂的制备
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50μL DMSO中，取2mg抗ProGRP单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液中至总体积为1mL；
2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述ProGRP单克隆抗体溶液中，置室温90min；
3、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5mL；
4、取0.5mL磁珠加入5mL反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2min后吸取上清；
5、每次加入1.5mL pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4h；
6、加入0.3mL1mol/L的TRIS溶液 37℃15min；
7、每次加入1.5mL pH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100mL磁珠保存液将磁珠转入125mL玻璃瓶，即为0.05％的ProGRP磁分离试剂；
磁珠保存液配方为0.1％ BSA，0.05％Tween-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。
9、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。
步骤二、酶反应物的制备
一、酶反应物稀释液的配制
1、取TRIS 4.846g、HCl 2847μL于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；
2、调pH，控制 pH在 7.35-7.45；
3、称取BSA 4g倒入上述烧杯中；
4、最后烧杯定容至400mL，用0.2μm滤器过滤即得。
二、辣根过氧化物酶（HRP）与 ProGRP抗原的偶联
1、取ProGRP-3-cmo-BSA抗原1mg放置于1mL玻璃管中；
2、取200μL DMSO溶解抗原使抗原的终浓度到达5mg/mL，然后充分混匀；
3、按照1mol抗原加入10mol的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯到上述2溶液中，37℃恒温箱中反应 1.5h；
4、按照3mol抗原加入1mol的（HRP）的摩尔比往上述3的溶液中添加（HRP），然后加入1mL的pH为7.4浓度为0.1M的PB缓冲液，置于37度恒温箱中反应 3h；
5、将上述4的溶液用PD-10柱纯化，收集纯化液，按照1:3000的体积添加获得的酶反应物稀释液，混合均匀即得酶反应物。
步骤三、反应增强剂的配制
1、称取TRIS 1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将 Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调pH值，控制pH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000mL，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤。
步骤四、校准品稀释液的配制
1、称取TRIS 7.268g和HCl 4270μL于1L的容器中，定容至600mL；
2、用量筒量取小牛血清300mL，加入上述溶液中，校准品稀释液备用。
步骤五、校准品和质控品的配制
校准品浓度分别为0，30，150，300，600，1200pg/mL；质控品浓度分别为0.75，7.5pg/mL。
步骤六、清洗浓缩液的配制
1、称取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中；
2、称取0.225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.225mL于盛有15mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；
5、调pH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容至1000mL，完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得。
步骤七、底物溶液的配制
一、底物溶液A的配制步骤
1、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；
2、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05之间；
3、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。
二、底物溶液B的配制
1、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和PC300 250μL于1L烧杯中；
2、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH控制其范围在7.95-8.05之间；
3、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。
所得的产品分装即为半成品，抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成胃泌素释放肽前体（ProGRP）微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
使用方法
（1）样品的前处理：
使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体、校准品/待测样品、ProGRP抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15-30min，使它们平衡到室温；之后，将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否工作正常。
（2）操作步骤：
1、加50μLProGRP校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；
2、加50μL酶反应物至每一微孔中；
3、加50μL反应增强剂至每一微孔中；
4、加50μL磁分离试剂至每一微孔中；
5、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37℃水浴30min；
6、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2min；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
7、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μL稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；
8、重复步骤 6、7、6一遍；
9、加100μL底物溶液至微孔中混匀3s，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出标准曲线（双对数曲线），以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的ProGRP的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为ProGRP浓度（单位为pg/mL）。
性能指标
1）准确性：试剂盒校准品与国家校准品同时测定，两条剂量-反应曲线不显著偏离平行。以国家校准品为对照品，试剂盒校准品试剂盒的实际值与标示值之比应该在0.90-1.10的范围内
2）剂量-反应曲线的线性：用双对数数学模型拟合，在0-1200pg/mL浓度范围内，剂量-反应曲线的相关系数（r）的绝度值不低于0.9900
3）精密性：CV≤ 15％；重复性：CV≤ 10％
4）最低检出量：≤ 1.35pg/mL
5）质控血清测定值：应在质控范围内
6）特异性：交叉反应率应小于0.2%
7）稳定性：将试剂盒37℃放置3天，测定结果应符合上述1）~5）项要求。
发明胃泌素释放肽前体（ProGRP）定量测定试剂盒及其检测方法具有较高的灵敏度和特异性，更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式，还能区分小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），对肺癌的早期诊断具有重要意义。
Claims (5)
1.一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，包括盒体（1）和盒体上方的盒盖（2），其特征是：所述盒体（1）内设有微孔板（6）和位于盒体（1）底部的支撑板（3），支撑板（3）上开有多个孔（4），所述孔（4）内共放置有八个试剂瓶（5），八个试剂瓶（5）分别含为磁分离试剂瓶、酶反应物瓶、稳定增强剂瓶、校准品瓶、质控品瓶、清洗浓缩液瓶、稀释液瓶以及底物溶液瓶。
2.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，其特征在于：所述微孔板（6）上设置48或96个微孔（7）。
3.根据权利要求1或2所述的胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒，其特征在于：所述磁分离试剂瓶内含有胃泌素释放肽前体单克隆抗体包被的磁颗粒。
4.制备权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体定量测定试剂盒的方法，其特征在于：所述试剂瓶中试剂准备过程如下：
步骤一、磁分离试剂的制备
一、磁珠缓冲液配制
（1）、称取TRIS 4.58g和NaCl 6.81g于1L容器中，然后称取0.96g 吐温20于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；
（2）、用移液器将防腐剂量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入 800mL纯化水，充分搅拌；
（3）、调节pH计测量其pH值，控制pH在7.95-8.05之间；
（4）、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；
（5）、最后1L容器定容至 1000mL，用0.2μm滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的制备
（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50μL DMSO中，取2mg抗ProGRP单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液中至总体积为1mL；
（2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述ProGRP单克隆抗体溶液中，置室温90min；
（3）、然后将抗体溶液加入到浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5mL；
（4）、取0.5mL磁珠加入5mL反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2min后吸取上清；
（5）、每次加入1.5mL pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4h；
（6）、加入0.3mL1mol/L的TRIS溶液37℃15min；
（7）、每次加入1.5mL pH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30s，上架，去上清，重复操作3次；
（8）、用100mL磁珠保存液将磁珠转入125mL玻璃瓶，即为0.05％的ProGRP磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％Tween-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；
（9）、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
步骤二、酶反应物的制备
步骤三、反应增强剂的配制
（1）、称取TRIS 1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将 Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；
（2）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调pH值，控制pH在 7.35-7.45之间；
（3）、称取阻断剂 0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000mL，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤；
步骤四、校准品稀释液的配制
步骤五、校准品和质控品的配制
步骤六、清洗浓缩液的配制
（1）、称取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中；
（2）、称取0.225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
（3）、用移液器将防腐剂量取0.225mL于盛有15mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
（4）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；
（5）、调pH，控制其范围在7.35-7.45之间；
（6）、最后定容至1000mL，完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得；
步骤七、底物溶液的配制
一、底物溶液A的配制步骤
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；
（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05之间；
（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得；
二、底物溶液B的配制
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和防腐剂250μL于1L烧杯中；
（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH控制其范围在7.95-8.05之间；
（3）、用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。
5.使用权利要求4制备的胃泌素释放肽前体试剂盒进行检测的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
（一）样品的前处理：
使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的ProGRP抗体、校准品/待测样品、ProGRP抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15-30min，使它们平衡到室温；之后，将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否工作正常；
（二）操作步骤：
（1）、加50μL胃泌素释放肽前体校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；
（2）、加50μL酶反应物至每一微孔中；
（3）、加50μL反应增强剂至每一微孔中；
（4）、加50μL磁分离试剂至每一微孔中；
（5）、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37℃水浴30min；
（6）、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2min；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
（7）、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μL稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；
（8）、重复步骤（6）、（7）、（6）一遍；
（9）、加100μL底物溶液至微孔中混匀3s，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
（10）、以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出双对数标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的ProGRP的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为ProGRP浓度，单位为pg/mL。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104845975A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-19 | 郑州大学 | 小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的dna核酸适体 |
| CN105067599A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-11-18 | 南京闻智生物科技有限公司 | 一种检测胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒 |
| WO2016127320A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种用于检测胃泌素-17的试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN108333360A (zh) * | 2017-01-19 | 2018-07-27 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 胃泌素释放肽前体稀释液及其应用和试剂盒 |
| CN109212188A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-15 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒 |
| CN109342728A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-15 | 郑州标源生物科技有限公司 | 一种适用肿瘤标志物Pro-GRP定量检测的质控品 |
| CN111551717A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-08-18 | 深圳大学 | 一种基于有机光电化学晶体管的胃泌素释放肽前体传感器及其制备方法与应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006117994A1 (ja) * | 2005-04-13 | 2006-11-09 | Advanced Life Science Institute, Inc. | ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用 |
| CN101368966A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-02-18 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒 |
| WO2010015633A1 (de) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Synmed Research Gmbh | Verfahren zur charakterisierung, insbesondere quantifizierung, von durch, aus dem gewebe in die blutbahn rezirkulierten, blutmakrophagen intrazellulär aus gewebe aufgenommenen molekularen markern sowie analyseanordnung zur durchführung des verfahrens |
| CN103033619A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-04-10 | 河南生生医疗器械有限公司 | 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法 |
| CN103424551A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-12-04 | 江苏福隆生物技术有限公司 | 人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒及其检测方法 |
| CN103472229A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-25 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种癌胚抗原磁微粒化学发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法 |
-
2014
- 2014-06-27 CN CN201410297442.7A patent/CN104089949A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006117994A1 (ja) * | 2005-04-13 | 2006-11-09 | Advanced Life Science Institute, Inc. | ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用 |
| CN101368966A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-02-18 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒 |
| WO2010015633A1 (de) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Synmed Research Gmbh | Verfahren zur charakterisierung, insbesondere quantifizierung, von durch, aus dem gewebe in die blutbahn rezirkulierten, blutmakrophagen intrazellulär aus gewebe aufgenommenen molekularen markern sowie analyseanordnung zur durchführung des verfahrens |
| CN103033619A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-04-10 | 河南生生医疗器械有限公司 | 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法 |
| CN103424551A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-12-04 | 江苏福隆生物技术有限公司 | 人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒及其检测方法 |
| CN103472229A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-25 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种癌胚抗原磁微粒化学发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 康淑霞等: "胃泌素释放肽前体实验室检测及临床应用进展", 《中华全科医学》, vol. 10, no. 1, 31 January 2012 (2012-01-31) * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016127320A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种用于检测胃泌素-17的试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN104845975A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-08-19 | 郑州大学 | 小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的dna核酸适体 |
| CN105067599A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-11-18 | 南京闻智生物科技有限公司 | 一种检测胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒 |
| CN108333360A (zh) * | 2017-01-19 | 2018-07-27 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 胃泌素释放肽前体稀释液及其应用和试剂盒 |
| CN109212188A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-15 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种便于临床应用的胃泌素释放肽前体检测试剂盒 |
| CN109342728A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-15 | 郑州标源生物科技有限公司 | 一种适用肿瘤标志物Pro-GRP定量检测的质控品 |
| CN111551717A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-08-18 | 深圳大学 | 一种基于有机光电化学晶体管的胃泌素释放肽前体传感器及其制备方法与应用 |
| CN111551717B (zh) * | 2020-04-10 | 2023-04-07 | 深圳大学 | 一种基于有机光电化学晶体管的胃泌素释放肽前体传感器及其制备方法与应用 |
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