CN104087584A - 尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途 - Google Patents

尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途 Download PDF

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张洁
陈骁
张保卫
王慧
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Abstract

本发明公开了尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途，尖嘴魟微卫星位点包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示。所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：30所示。所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为3-24个，平均等位基因数为13.6个。期望杂合度He为0.5-0.984，观测杂合度Ho为0.429-1，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。

Description

尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途
技术领域
本发明涉及，尤其涉及的是一种尖嘴魟微卫星位点序列、引物及其用途。
背景技术
尖嘴魟(Dasyatis zugei)隶属鲼形目、魟科，是一种生活在近海区域的软骨鱼。受到污染、过度捕捞、渔业养殖等影响，目前种群数量日益减少，亟待保护。对其保护需要了解其种群结构及遗传背景等遗传学信息，目前国内尚没有开展软骨鱼的分子遗传学研究。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，首次提供尖嘴魟的微卫星位点及引物，也是目前国内首次针对软骨鱼类的分子遗传学研究结果。
本发明的技术方案如下：
尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：10所示。
所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：30所示。
所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为3-24个，平均等位基因数为13.6个。期望杂合度He为0.5-0.984，观测杂合度Ho为0.429-1，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。
附图说明
图1尖嘴魟DNA 1％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker；1-4：尖嘴魟全基因组DNA；Y：空白对照；
图2 AFLP扩增产物1％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker；1-8：AFLP扩增产物；Y：空白对照；
图3菌落PCR 2％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker(同图2)；1-8：菌落PCR结果，其中2、6、7和8号为双带，被认为阳性重组子；Y：空白对照；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、DNA抽提
利用尖嘴魟肌肉组织，提取基因组DNA。抽提方法采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径(Sambrook et al.，1999)。DNA抽提效果见图1(展示部分).
2、尖嘴魟微卫星富集文库的构建
取基因组DNA 250ng左右，使用限制性内切酶MseI打断，同时与MseI的AFLP受体接头(5'-TAC TCA GGA CTC AT-3’/5’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3’)进行连接。将消化产物稀释十倍以后，使用AFLP受体特异的引物(5'-GAT GAG TCC TGA GTAAN-3’，简称MseI-N)进行PCR扩增。扩增产物使用1％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带，见图2。
分别使用带有生物素接头的探针(AC)12和(AG)12与上述PCR扩增片段进行杂交后，使用链霉亲和素磁珠进行吸附洗脱，以获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以MseI-N为引物进行双链DNA恢复。PCR产物经PCR清洁试剂盒(Axygen)纯化，并用1％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带则视为成功。
将纯化后的双链恢复产物与pEASY-T1 Simple Cloning Vector(TransGen Biotech)连接后转化于Trans5 α chemically competent cells(TransGen Biotech)中。将已转化的感受态细胞涂布于添加0.5mM IPTG和0.5μg/mL X-Gal含0.06mg/ml氨苄(Amp)的LB固体培养基平板上，在恒温培养箱中37℃培养13h，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。
3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计
挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养(37℃，5h)。采用三引物PCR法(Zane et al，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通用引物(M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针(AC)12/(AG)12进行反应。如果产物在2％琼脂糖-EB凝胶电泳结果中出现两条或两条以上的条带，则认为该单克隆含有目的序列，见图3(展示部分)。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子107个，对这些重组子的质粒使用M13通用引物进行测序。
4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选
检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件(Tandem RepeatsFinder，Version3.2.1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列(Benson，1999)。使用PRIMER5软件(Lalitha，2000；Singh et al.，1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将目的片段设置为100-400bp之间。共选择28个微卫星重复位点作为备选标记。
5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得
对初选出的28个微卫星位点的单侧引物5’端加上荧光基团标记(FAM/HEX/TAMRA)，然后使用15个尖嘴魟个体的DNA对上述微卫星位点进行扩增筛选。首先对待选位点的PCR进行扩增条件的优化，循环设置为：95℃预变性5 min；95℃变性30 sec，48℃到60℃中选择8个温度梯度退火30sec，72℃延伸60sec，反应30个循环；72℃延伸10min。扩增产物使用2％琼脂糖-EB凝胶电泳检测，确定出最合适的引物退火温度。排除出现以下情况的备选位点：在8个温度梯度中均未得到清晰的单一条带；扩增结果不稳定，在不同个体中不具有重复性。对具有稳定单一条带的扩增产物使用Tamara500荧光分子量标准在ABI 3730DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用Genescan 2.0软件进行读取。基因分型结果经过分析后，去除出现下列情况的备选位点：无基因分型结果的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在15个野生尖嘴魟中等位基因在两个以下的位点。经过筛选后，最终获得10个稳定的多态性微卫星位点，微卫星序列如下所示：
DzuI25(291bp)
ACATTGAATGACATTTAGAAATGGGAACAGAAGTGCTTGTCAGCCAACCATGAGTCTTCTTTAGATAACAGCAACAACAAACAGCAAAACAGCAAACCAGATCCTTTCCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCACACACACACACACTCACACACACACACTCACACACACACACATACACACACACACACACACACAGGCTATTATTTATACAAAATAGCATAGAAAGAAAGAGGCATTTATTCTCTTTTCACTCCTCACTCCT
DzuI45(520bp)
ATGGTGAAACTGAAGGAGCTGGACTTGGTGGGGATCACGCTATTGCCTGTGTTGGAGAGGCCTCGGTGTGCGAAGGTGGTGTGTAGTCCAACAGCGAGTGACTGTCTTAGTTGCTTGTCTTGTGATCACAAGACCCTGTTGGAAGTTGTTGGTGTGGAGCGCTGCAAGTCCAATTCCTGATTTATTGGCGGGGGGCGGGGGAGCTGCGTGGCCTCTGACCTGGCGAGGAGTGGGCCTCAAGCCGCAGTGTTGCCTGTTTACAGACACCCAGGAGAGAGGCATTGGAGTCGGAGGCGGCGTCAGAGCTGAAGCTGGGTGCTGCCATCTAGTGTTTGCCCAGCAGAATACAAGGTGCATGTTCGACTGCAACTGCTGCAGCATTAGCGGACTCACAGCCTTGGACTATTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGATTGTCGGTACTGTGTCTTGGCCCCAGTACTAGCAACACTTTTGTTTGTCTGTAAACCTGGATATGGT
DzuI31(569bp)
ACTCCACCCTGCCACTTTCCCACTTGGCACAAGCTGCCATCACCCCTCCTCAGTCTGCCTATCATAGTTGCTGCATGTTTTACCTCTCCCGCTCTCCTCTTTACACTGGCCATCTTACCTCTCCAATCCTGGTCGTGACACAGGGTTTTGACCCAAAATGCCAGACCCCAGTTCCTCGATACACACAGATACTGCTTGATCACTGAGTTCATGCATCTGCATTCCGTCATATTGTAATGTGTGCGAGCAATATCTGATAACAGCATCTCCAGTGACATTGGGGGAGTGAGGGAAGTACTAACTTTCCAATGGGGCATAAATCAAGGGGATTTACAAATACAGTCTTGTGCAAAAGTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAGCTAGGGTTTGTAAGACTTTATCTGGCAGGAGCAAAGGATGTTGGGAATGGTGAGGGTGGAGGACTGTAGGACTGGTGGTAGAGAGGAGTGACAAGACTGGGAGGGTGGTGCAGGTGCAGACACACCCAGCCCTGAGACACCAGGCAAGGTCATTTGATTCTAAACAATTGGT
DzuI46(472bp)
CGTTATGTAGGCAGTCCTGGAAACAAAGTTATAGAGAAATATCAGACAGAGGCAAAATACTTAGATGAGTCATTCCTTCAATGTCATCATTTTGCTCTTACTTTGATCGCTGAAATCTCCGGAGAAGTTGGTGAGGTATATTTCATGTACCACAGTGGCAGAAATCGCTGCTTTCCTTCTCTTTGTGATACAGAATACATCCGTTTGATCCGTCAGAACCATGCAGGCCCCCGACGGAGGGATTACTTACTCTCCTCACTCTATTTTTTCTGTATCCCTGTAGTTCTGCCCTCTCTCTCTCTCACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACATCCTACACACACACACACACACACACACACACACTCACACTCACACAGACACACACACACACACACACAAATATCCATGCCTCTTTGATTGTTTGCTGCTATGGAGAT
DzuI51(430bp)
CCCACCATGGGCAATAGAAAAGTCACTGTTGCAAACAGTGCAGCGAGCAACACTGTCATTATTTTTTACCCCTATTAGGCAGGGGTACACTTCGGTGTAGTCTGGGGTGAAGTATGTTTTATATTTTCATTTTTTGGAACACTTTGCCATGGTTCATGTTTTCTCTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCGCATATACTGTAGCAGAGGTCCCAATACAGACTGGTTACAGACCTCCAGCCAGAACCACTACCATTGACAGCTACTTTCTATCTTCTATGGTCTGAGTCCAACATCCAAGTCACTGCAGATTGCATGCATCCTTTTCTCTGCATGAGCCCTCCATGAGGGACCTGATCGAATAGGTTACTAAAATCCATGTAGACAACATCCTTACCT
DzuI57(720bp)
TGCCAAACAAAGTCACCCTCACTTTCCAAAACAAGAGAAAATCTGCAGATGCTCAAAATCCAAGCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAATGCTGCAGGAACTCTGCAGGCTAGGTAGCATCCATGGAAAATAATAAACAGTCGATGCTTCTGGCCAAGACTCCTTCGGCGCCCTCAGTTTCCCTCTGGATTTCACCCCAAGGGTTCAGGGAGTGATGATGGTTAGAACTGTTGGTCCTGAAACCCAAACCGTTTATACTGAGTAAATGCCTCGTCGCCATTGTCATTACTTTGCTAATGACTGAGGACAGACCAATCAGGTGCTAAATAGGTACATAATGGGTCTGTCATGTTTCTGTGATCAGAACTTATCTCAGAAGCTTTATGCATGGTTGGGCAAATGTCAGTGCTGTAACTACACTGGACAGCTTGGCTAGAGATGCGACTAATACTGGAATAGAAACCTTCACCACTGCAATGGTTTCCCTTTGCCCTGTCTTATAGCCTTTACTGCATCCTGCGCCTCTTGGCCGTTTCTTGGAGTGAAATGAGTGAGCTAAATCCTGGATACCAAGACAGCAGCTATCCCCAGGAGAAAGCATTTACTTTGAATGAAGATCGCTGTACATGGACTTATCAAAAGATGTTTGCAAATGCTGGAACAATACAAGTTTCTAACACTTAGATCAAAAGATTTTTTTTGT
DzuI71(811bp)
ACTAACTAATGCCACATAAATACTGCATGATTATTTATCCCCTCGTGTGGCCAGTAGTCATCCGCCATCATCTACAAATGGCCATTGAGATTCTTTTGACATAGGGAGGCCATTACCTCAAGGATTTGGCAGAGCAAGATCTTGGCAACAAGATCCAAAATGGTCAAACTGGCTCGGCTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAATTCCACCTAACTGCCCCCCATCTGTCAGACACTACCCTCTCAACTTCCTCCCCTTTCACTTGACCCCTTCCTTTCTCCCTCTTTCTTCTTCCGAATCCGGCCTCCTCCTCTCCATTTGCCAGGAGCCTGCTCCCTCTGATAATCACAGGTGTTCAGTTTATTAGTGTCTGCTTCCCAACTGCACGATACTTCCCCATTACAACTGGTCCCCAAAGTTACACCACCGCAGAATTTCTGAAATTTCCCCAGAAAACCACAGGATGTTCTGCAAGTGACTACCCAAAGCCGCTCAACGTTGGCAGATGGTGGTTTCTTGGTGCTCTGTTGGTGGAGGACATGTGGGTTTTGAGGGAAAGGGTAGTGTGTGGAAGGCAGAGTTTAAGATCATTGTATATGCTGAGCGATCCGATGATGAGCAATGAGGGACCCTCACTCCTGCAGAATGTAATCTCCTTCACAGTTAGGACTTACCAAAACCTTCACAGAGAGCTGAAAGAATGTTTGGTTTTGT
DzuI82(352bp)
CAAATAAAGGCGCCCTATACACACAGACAAGCTAAATCACACACACACACACACAATCTATAAATATTCTCTCTCCCTCACTCACTCACTCACACACATACACTACAGACATAGGCAGACTATCTCTCTTTTTCACCCACCTATCCCACCCCCTCTATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTGGAAGGAGACACAAATGAAATATAACGGGAAGTAACTCAATACAACTCTATCTTCGTTTATCACAGACACAATGGGACGAACCGTCTCCTCTGTGTGCGTCGGATTTCAAATATACAGAGATGCGTACACGATAAACCAGAT
DzuII15(410bp)
GGATAGTTCACGATAATACGGTATATATCCTGGAATGTAGAACGCAGCGGTACAACAGGTGGTGCTGCTGCATGACCTCCAGTGTCTAGCATTTGACCCTGACTTTGGATGCAAACTGTCTCCCTGTAGCTGCAAGGGTTTCTGCCAGATGCACTGCATTCCTGCCTTATCCCAAAGTTGTGCTGGCAGGTTAGCTGGCTGTTGTAAATTGCCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTTGGCACGTGGCCTAGTGGGCAAGGCATCAGACTAGTAACCTGAAGGTCACAGGTTCAAGCCTCAGCTGAGGCAGCGAGTGTGTGTCCTTGAGCAAGGCAGT
DzuII64(649bp)
CTATTTATGCCTGCCAGCATCTTTTATATCTACTTCTATACATGTAACTGTTCAGTATTTTTCCCAGTGGTCGCAGGATACATATATAAATGTTCTGCATTTCTCCTACTGATTACATTTGTATCATTCTGGAAAGCTCTGGAAGTTTCTCCGGTGTTGCATTATTTGTATAGGGGCTATCTGATTGGTTGACTCTTATCTACAGATTTGAATGAAATGTTCCTCATCTATGGGGGTTCAAAAAGCTCCTTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTGCCCCTCTTACTGCCGGATTTCAATTTTCTTTCTTTCATTAGTGCTCCATAAAATGACAGGGAGGCAAGAAGTTTTGTGCCTCTTCCTGACTTCCGAAAGAATCTTGGATAAAATATATCAGAGTCCACGTGACACTGTCTGAGCGGAGCTTGTGCGTCCCCCCCAGGACCACGACGGTTCCCTCTGGGTTCTCTGGATCGCCCCTACTTCCGAAGACATACGGATTCAAGTTGGTCCGGTGGCATTGTGAACATTCTTTGCTGTGATTCGCCCTCCGAACAGTCTGTGTCAGTGGTGACTCACCGAGTGCCTCCTCCATTCATCCCTGTCGGT
10个位点的引物序列如下表1所示：
表110个位点的引物序列
10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果如下表2所示：
表210对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果
样品ID DzuI25 DzuI45 DzuI31 DzuI46 DzuI51 DzuI57 DzuI71 DzuI82 DzuII15 DzuII64
DZR01 198 201 218 375 386 250 236 174 270 304
198 213 272 381 386 252 258 184 288 306
DZR02 216 233 238 365 386 230 244 184 178 234
220 237 244 379 386 230 246 194 226 234
DZR03 198 233 206 381 386 230 242 144 182 256
216 245 282 385 386 256 244 148 226 256
DZR04 218 219 206 375 386 230 238 138 182 256
218 243 266 391 386 250 244 148 276 256
2010G1 184 211 208 369 386 230 240 170 184 276
192 261 264 387 388 246 246 178 192 272
2010G2 184 233 206 373 388 240 250 136 188 272
188 243 208 397 396 242 258 144 260 276
2010G3 142 211 238 403 386 230 244 174 194 274
166 223 274 485 396 230 246 178 218 280
2010G4 142 211 218 373 386 230 236 160 184
166 261 220 373 396 236 244 168 218
2010G5 144 187 206 379 386 236 236 144 196 280
148 211 274 373 388 244 244 162 268 274
2010B3 211 373 242 242 160 182 248
243 379 246 246 166 202 268
2010B4 178 201 214 383 386 228 240 130 258 248
178 201 244 391 386 228 250 146 262 268
2010B5 196 211 220 391 386 230 242 200 190 344
196 243 274 395 396 248 248 202 206 356
2010B6 164 211 242 383 396 230 246 178 180 280
164 243 242 387 396 248 248 180 192 308
2010B7 174 187 230 373 386 230 238 178 214 344
184 223 250 401 386 254 242 204 306 356
2010B8 202 187 222 389 386 246 250 154 256 250
230 221 256 389 386 252 258 182 278 280
分型数据经分析后，等位基因数为3-24个，平均等位基因数为13.6个。期望杂合度He为0.5-0.984，观测杂合度Ho为0.429-1，这表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。具体结果如下表3所示：
表3
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示。
2.根据权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ IDNO：11-SEQID NO：30所示。
3.权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点或者权利要求2所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
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