CN106086191B - 用于海南鲤种质鉴定的sine介导的indel标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲤鱼反转录转座子标记，包括鲤鱼反转录转座子序列的预测，鉴定；筛选并开发了以SINE元件介导的INDEL标记。本发明可应用于海南鲤的种质鉴定。

Description

用于海南鲤种质鉴定的SINE介导的INDEL标记
技术领域
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及评估海南鲤的种质鉴定的以SINE元件介导的INDEL标记。
背景技术
鲤鱼(Cyprinus Carpio)是我国最主要的淡水养殖品种之一，在我国培育有近千年的历史，通过多年的人工培育，已培育成多个品系，但是对不同品系的鲤鱼如何进行有效的种质区分，对于保护和鉴定鲤鱼种质资源是非常必要的。第四纪冰期冷暖交替后，我国形成了许多地理隔离的种群。海南岛是在第四纪时期，由于地壳断裂才与大陆分离形成了独立的半岛，半岛上的内陆湖泊河流与大陆板块的河流形成了地理隔离，独立进化。关于海南鲤鱼的种群研究，并未找到合适的分子标记，能够显示出岛内的鲤鱼地理种群是否独立进化成亚种。
SINE是一种段散在重复序列，是近年来新开发的短分子标记，因在基因组中广泛分布，鉴定效率高等优点而被广泛使用。SINE能用作种质鉴定研究的标记，是因为它们不可逆的***到基因的新位置，并且这个过程是随机独立发生的。因为目前还没有固定的SINE座位丢失掉(被剪除)的报道，并且两个基因组中两个SINE精确的***到基因组的同一个座位或者从同一座位被移除掉的可能性极小，因此，两个不同物种基因组中共有同一个SINE座位可以作为一种单向的标记，它可以用来定义一个支系或者单系类群。根据共同离征，共有或者起源性状来构建***发育关系。目前，SINE技术仅在植物中常见，但在鱼类中研究很少。目前能够用于快速检测鲤鱼种质特异性的引物较少，常用的微卫星和AFLP存在着特异性标记少，而SNP标记则存在检测麻烦等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：开发鲤鱼SINE标记，提供种质特异性引物，建立鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的开发体系，为鲤鱼的遗传背景分析提供更多新的分子标记，提高种质资源鉴定的效率。
本发明所要解决技术问题的技术方案：通过454高通量测序仪对鲤鱼所获得的序列，进行长片段拼接，利用生物信息学的方法鉴定SINE序列，筛选出以SINE元件介导的INDEL引物，并对鲤鱼的INDEL位点进行遗传多态性检测，开发出1个海南种质特异的以SINE元件介导的INDEL标记，SL1,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的SL1的引物序列为：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA
利用该引物扩增鲤鱼海南地里种群和我国其他水系，发现该标记在鲤鱼的海南地理种群为INDEL标记，而在其他水系的基因组中具有扩增稳定，标记特异性显著等优点，该标记能够对鲤鱼的海南地理种群的种质特异性进行有效评估，因此将该引物开发成试剂盒，用于检测鲤鱼的海南地理种群的的种质鉴定研究。
本申请涉及如下技术方案：
1.从鲤鱼基因组序列，挖掘鲤鱼反转录转座子SINE序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所述。
SEQ ID NO:1
AACGACGACACATGGACATCAAGGAACCATCTGCCTTTAAAGCACCATAATGTTTGGTTTATGCTTGACAGCTCACACAAACATGAGAGTGTGGATGAGCAGATGCACTTCTAAGCCGCAAGCTTTCAGAAGAACTAAAGCACGACGTTGTAAAAGCACTGTTGGATCTTCTGTTATTTGGTTGATCAGTTGTTTCTGTTATTAAACATCTTGCACTGTTATTATGTCTTGTTCCTGTGGCTCAGTGGTAGAGCATTGCATTAGCAGCGCAAAAGGTCATGGGTTCAATTCCCAGGGAACACACATACTGGTAAAAAAAAATGTGTAGCCTGAATGCACTGTAAGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCTGCTAAATGCATAAATGTAAATGTTATTAAAATTCGGTCTAATAATGGTTGCTAAATGTGAATTCAGGCATCACAACCTTAAAATGCACATTATTCATTTTGAGATAAGCTAAAGATTACATTTTAAAGTCTTACTAAATAATAAGTGTATTAAAGATTCTACATTTGGAAAAATCTAAATATGAAAATATAGGAAACAAGCACACAGTTACATATATCCAATACTGACCGACTGAAC
2.根据鲤鱼的SINE序列，开发反转录转座子SINE标记的引物SL1，其引物序列为：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
3.利用该引物扩增黑龙江鲤、长江鲤、海南鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤五种鲤，共130个DNA样本，该引物除了在海南鲤群体，没有阳性扩增外，在其他群体的603bp上均产生阳性扩增。
4.避开变异位点，重新设计引物，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样性。
附图说明
图1：5个地理种群的SL1-SINE介导的INDEL标记的遗传多样性电泳图。
左1：DL2000 Marker；左2-3：黑龙江鲤；4-5：长江鲤；6-7：海南鲤；8-9：月亮湖鲤；10-11：俄罗斯鲤。
图2:SL1-SINE序列在5个鲤鱼地理种群中所产生的6个单倍型序列。
具体实施方式
1鲤鱼SINE序列的获得
利用454高通量测序仪对鲤鱼基因组进行测序，获得0.01X覆盖，测序深度为1。
鲤鱼SINE序列的鉴定流程：
1从鲤鱼基因组中的片段序列中，鉴定转座子分类
利用Repeat masker软件的RepeatModeler(http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler.html)，进行denovo的重复序列鉴定，通过与斑马鱼基因组比对，挖掘鲤鱼基因组内的SINE元件。在基因组内部得到所有SINE序列，通过分类整理成不同的亚家族类别,针对不同亚家族内部拷贝序列进行分析,找寻SINE拷贝多，序列之间极度相似的分支群。对于候选的分支群,两端各延长600bp。
2基因组提取
利用QIAGEN基因组试剂盒提取黑龙江鲤(HLJ)、长江鲤(CJ)、海南鲤(HN)、月亮湖鲤(YLH)、俄罗斯鲤(RUS)的基因组DNA。除俄罗斯鲤仅收集到10份样品外，其余每个地理种群各采样30尾，共130个样品。
3多态性引物设计
SINE引物从SIEN保守区域设计P1：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
4 REMAP分子标记PCR反应技术体系的建立
利用得到的引物进行PCR扩增。扩增反应体系为25uL：基因组DNA40ng,2.5mmol/LMgCl2 1.5uL,dNTps2.0 uL，10XBuffer2.5 uL，TaqDNA聚合酶1.5U，10umol/L SL1-F引物1.0uL，10umol/L SL1-R引物1.0uL，加ddH2O至25uL。反应程序：4℃预变性4min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用3％Q琼脂糖凝胶分离。
5 INDEL引物检测
该引物在黑龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤和俄罗斯鲤鲤鱼基因组中只有唯一扩增清楚的扩增产物，扩增片段为603bp，但在海南鲤无扩增产物，图1。
6 INDEL位点确认及其序列遗传多样性分析
改变引物位置，重新设计引物T1，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样性。
T1-F:AACGACGACACATGGACATCAA；
T1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
该序列在50个个体成功扩增出并进行测序，为603bp，经多重序列比对分析表明，共有68个变异位点，其中含有简约信息位点55个，变异率为11.03％。平均碱基含量分别为：T 29.4％，C 17.4％，A 34.3％，G 19.0％。在5个群体中，共发现6个单倍型(表1，SEQ2)，黑龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤共享4个，海南鲤有2个特有单倍型。所有样本间平均序列分歧距离Da为0.1282。5个地理种群的遗传多样性和遗传距离见表2和表3。
表1单倍型在5个地理种群中的分布
表2 5个地理种群鲤鱼的遗传距离
表3 SINE序列的遗传参数.N:群体数量；n:单倍型数量；π:核酸多态性；h^单倍型多样性。
本发明开发出了一段特异序列能够鉴定海南鲤的种质特异性，且该发明将该特异序列转化为这个特异等位基因，降低了检测难度，减少了检测成本，为鲤鱼的种质鉴定的工厂化奠定了研究基础。

Claims (4)

1.鲤鱼反转录转座子SINE标记，其特征在于：所述的SINE标记CS1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所述。
2.权利要求1所述的鲤鱼反转录转座子SINE标记的引物，其特征在于：其为
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
3.一种试剂盒，其包含权利要求2所述的引物。
4.权利要求1所述的标记或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在区分海南鲤的种质特异性方面的用途。
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