CN111635957A

CN111635957A - 一种检测小麦抗条锈病qtl的分子标记及其在抗病育种中的应用

Info

Publication number: CN111635957A
Application number: CN202010697215.9A
Authority: CN
Inventors: 朱展望; 贾梦洁; 王文学; 李君辉; 刘易科; 佟汉文; 陈泠; 张宇庆; 何伟杰; 邹娟; 高春保
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111635957B

Abstract

本发明公开了一种检测小麦抗条锈病QTL的分子标记及其在抗病育种中的应用。本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas‑4BL.2，解释表型变异4.0％～5.1％，其关联SNP IWB63337为二等位多态性SNP位点，为A或G，携带A的AA基因型小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB63337携带G的GG基因型小麦，该标记可用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas‑4BL.2的基因型，并用于抗条锈病分子育种。

Description

一种检测小麦抗条锈病QTL的分子标记及其在抗病育种中的应用

技术领域

本发明涉及生物农业领域中，一种检测小麦抗条锈病QTL的分子标记及其在抗病育种中的应用。

背景技术

小麦条锈病是一种真菌病害，由小麦条锈菌(Puccinia striiformisWestend.f.sp.tritici)引起，危害世界小麦生产。小麦条锈病的主要危害部位是叶片，在病害流行年份平均造成小麦减产20％-30％，严重时可达50％以上，甚至绝收。选育并合理利用抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效的方法。依据田间病原菌侵染植株发病时反应型和发病时期，将抗病性类型分为两类，全生育期抗性(SR)和成株抗性(APR)。全生育期抗性，又称小种专化抗性，此类抗性品种受特定毒性小种侵染后，可产生过敏性坏死反应，坏死叶片无法为病原菌提供营养，进而遏制病原菌进一步扩展，最终表现出高抗或免疫。成株抗性又称非小种专化抗性，这类抗性通常由微效多基因所控制，一般在苗期表现感病，成株期表现抗病。这类抗性基因对病原菌无小种专化性，不易引起生理小种的变异，抗性表现持久且稳定。迄今，已正式命名的小麦条锈病抗性基因有83个。其中Yr5/YrSP、Yr7、Yr10、Yr15、Yr18、Yr28、Yr36和Yr46已经克隆。但由于小麦条锈菌生理小种复杂多变，新生毒性小种可导致当前利用的抗病基因丧失抗病，因此发掘新的抗病基因并开发其连锁标记对丰富条锈病抗源、更好进行抗病育种意义重大。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性。现阶段，可用电泳、直接测序、DNA芯片、竞争性等位基因特异性PCR(KASP)等对SNP进行检测，电泳方法效率较低，其他方法对设备和技术要求高、成本较高。PARMS(Penta-primer amplification refractory mutationsystem)检测技术，是一种基于扩增受阻突变体系PCR(ARMS PCR)的检测技术，与常规ARMSPCR不同的是，PARMS检测技术增加了两条带有不同荧光的检测引物，可以分别检测两条等位基因正向引物5’端的互补序列，经过与同一条反向引物PCR扩增以后，待检测位点的多态性即可通过不同的荧光信号得以检测出来。PARMS已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测小麦抗病分子标记的物质在检测小麦条锈病抗性中的应用。

本发明首先提供了小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记为名称为IWB63337的SNP，为对应于小麦基因组中序列表中序列4的第51位所示的核苷酸，所述小麦抗病分子标记为A或G。

所述小麦抗病分子标记位于小麦染色体4BL上，物理位置为558.1Mb的位点。

上述应用中，所述检测所述小麦抗病分子标记的物质可为PARMS_IWB63337引物组，所述PARMS_IWB63337引物组由名称分别为PARMS_IWB63337A、PARMS_IWB63337B和PARMS_IWB63337C的单链DNA组成；

所述PARMS_IWB63337A为(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1的第22-46位所示的单链DNA；

(b2)将序列1的第22-46位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；

所述PARMS_IWB63337B为(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2的第22-46位所示的单链DNA；

(b4)将序列2的第22-46位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的单链DNA；

所述PARMS_IWB63337C为序列表的序列3所示的单链DNA。

上述应用中，(b2)可为序列表中序列1所示的单链DNA；(b4)可为序列表中序列2所示的单链DNA。

本发明还提供了小麦基因型的检测方法，所述基因型为AA基因型、AG基因型和GG基因型，所述方法包括：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为GG基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测小麦为AG基因型小麦；

g1)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为A；

g2)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为G。

上述方法可采用90K SNP芯片进行分析确定待测小麦基因型。

上述方法中，检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸可采用所述PARMS_IWB63337引物组进行。

上述方法具体可包括：采用所述引物组PARMS_IWB63337进行PARMS反应，得到反应产物，检测所述反应体系的荧光信号，仅有FAM荧光信号的待测小麦为AA基因型小麦(即IWB63337标记为A的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为GG基因型小麦(即IWB63337标记为G的纯合型)，有FAM与HEX荧光信号的待测小麦为AG基因型小麦(即IWB63337标记为A和G的杂合型)。

所述小麦抗病分子标记，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述PARMS_IWB63337引物组：

Y1)检测小麦抗病分子标记；

Y2)制备检测小麦抗病分子标记的产品；

Y3)检测或辅助检测小麦条锈病抗性；

Y4)制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品。

所述物质还可包括进行PARMS反应所需的其他试剂，如2×PARMS master mix(武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。

所述物质可为试剂盒。所述物质可仅为所述PARMS_IWB63337引物组，还可为由所述PARMS_IWB63337引物组与所述进行PARMS反应所需的其他试剂组成的成套试剂。

本发明还提供了下述任一应用：

H1)所述小麦抗病分子标记在小麦育种中的应用；

H2)检测所述小麦抗病分子标记的物质在小麦育种中的应用；

H3)检测所述小麦抗病分子标记的物质在制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用；

H4)所述小麦基因型的检测方法在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用。

本发明还提供了检测小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法检测待测小麦的基因型，AA基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于GG基因型小麦。

上述方法中，所述待测小麦可为纯合系小麦。所述待测小麦具体可为AA基因型小麦或GG基因型小麦。

本发明还提供了小麦育种方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法检测小麦的基因型，选择AA基因型或AG基因型小麦作为亲本进行育种。

上述小麦育种方法还可包括选择后代为AA基因型或AG基因型的小麦作为抗条锈病的目的小麦，实现小麦育种。

本发明中所述小麦可为表1中240份小麦中的任一种或多种，但不限于表1中240份小麦。

在本发明的实施例中，所述条锈病由条锈菌生理小种CYR32、CYR33和和CYR34引发。

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦4B染色体长臂上抗条锈病位点QYr.hbaas-4BL.2，解释表型变异4.0％～5.1％，其关联SNP IWB63337为二等位多态性SNP位点，为A或G，携带A的AA基因型小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB63337携带G的GG基因型小麦，该标记可用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.2的基因型，并用于抗条锈病分子育种。

附图说明

图1为引物组PARMS_IWB63337对待测小麦基因型的检测结果。左上方为IWB63337基因型为GG的小麦，右下方为IWB63337基因型为AA的小麦。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的铭贤169记载在“黄亮,刘太国,肖星芷,等.中国79个小麦品种(系)抗条锈病评价及基因分子检测[J].中国农业科学,2017,50(16):3122–3134.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

条锈菌生理小种CYR32、CYR33和CYR34记载在“张怀志,谢菁忠,陈永兴,刘旭,王勇,闫素红,杨兆生,赵虹,王西成,贾联合,曹廷杰,刘志勇.利用BSR-Seq定位小麦品种郑麦103抗条锈病基因YrZM103[J].作物学报,2017,43(11):1643-1649.”一文中，公众可以从中国农业科学院院植物保护研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、IWB63337标记可以用于检测小麦条锈病

供试材料：国内外小麦品种(系)240份组建的GWAS群体，见表1。

表1、GWAS群体品种(系)及其来源

表1中，^a为引物组PARMS_IWB63337的检测结果；^b为90K SNP芯片分型结果；^c为5个环境下条锈病MDS BLUP值(Best linear unbiased prediction)，“NN”为数据缺失。

表1中材料记载于文献(Zhu Z,Chen L,Zhang W,Yang L,Li J,Liu Y,Tong H,FuL,Liu J,Rasheed A,Xia X,He Z,Hao Y,Gao C,2020.Genome-wide associationanalysis of Fusarium head blight resistance in Chinese elite wheatlines.Frontiers in Plant Science,11:206)中，公众均可以从申请人处获得。其中，14FHBSN6402为文献中CROC_1/AE.SQUARROSA(205)//KAUZ/3/SASIA/4/TROST；14FHBSN6404为文献中MONARCA F2007/KRONSTAD F2004；14FHBSN6405为文献中PBW343*2/KUKUNA//PBW343*2/KUKUNA/3/PBW343；14FHBSN6408为文献中KS82W418/SPN//WBLL1/3/BERKUT；14FHBSN6409为文献中CNDO/R143//ENTE/MEXI75/3/AE.SQ/4/2*FCT/5/KAUZ*2/YACO//KAUZ/6/BERKUT；14FHBSN6411为文献中T.DICOCCON PI94625/AE.SQUARROSA(372)//TUI/CLMS/3/2*PASTOR/4/EXCALIBUR；14FHBSN6418为文献中NG8675/CBRD//MILAN/3/SAUAL/6/CNDO/R143//ENTE/MEXI_2/3/AEGILOPS SQUARROSA(TAUS)/4/WEAVER/5/2*PASTOR。

一、IWB63337标记的发现

1、条锈病抗性鉴定

2015-2016年度在四川郫县和四川新都，2013-2014年度、2016-2017年度和2018-2019年度在湖北武汉对GWAS群体条锈病抗性进行田间接种鉴定。试验采用完全随机区组设计，两次重复。每小区2行，行长1m，行间距25cm。小区周围种植条锈病高感品种铭贤169作为诱发行，2013-2014年度用条锈菌生理小种CYR32和CYR33混合接种铭贤169，其余年份用CYR32和CYR34混合小种接种。当铭贤169的条锈病严重程度达到最高时，调查各小区条锈病最大严重度(MDS)，即发病最严重时叶片上条锈病孢子堆面积占总叶片面积的百分数，然后用R程序包lme4计算5个环境下表型BLUP值作为平均值，结果见表1。

2、基因型分析

GWAS群体用90K SNP芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的SNP用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余14577个SNP用于GWAS。

3、GWAS分析

采用Tassel v5.2.53和GAPIT软件kinship(K)+PCA方法的混合线性模型进行关联分析。当P≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。

4、QYr.hbaas-4BL.2及其连锁SNP标记

关联分析发现位于4BL上的抗条锈病位点，在武汉2016-2017、新都2015-2016两个环境下以及五个环境下的BLUP值与条锈病抗性显著相关，解释表型变异4.0-5.1％，代表性关联标记为IWB63337，IWB63337标记为二等位多态性SNP位点，为A或G，其侧翼序列为：5′-GCTCTTCGGGCTCCTCGCTCTTCGCTTTGCCCGGAAGCATGATATACTTA[A/G]CGGCTGCTTAAATGCGTA TTCTGAAGCATCAGAACCATCTTCTGCCAACA-3′(序列4，SNP位点在括号内，序列表中序列4的r表示a或g)。在小麦品种中国春参考基因组序列(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)上物理位置为558.1Mb(表2)。

表2、QYr.hbaas-4BL.2及其连锁SNP标记

^a代表性SNP标记，^b下划线所示为抗病等位基因，^c中国春参考基因组物理位置(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)，^d解释表型变异。

二、利用检测IWB63337标记专用引物检测小麦IWB63337标记与条锈病

1、基因组特异引物设计

用PolyMarker(www.polymarker.tgac.ac.uk)设计IWB63337标记的染色体特异引物PARMS_IWB63337(序列1、序列2和序列3)，由生工生物工程股份有限公司合成。

鉴定SNP位点IWB63337的PARMS引物为PARMS_IWB63337引物组，具体如下：

PARMS_IWB63337A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGCCCGGAAGCATGATATACTTAA-3’(序列1)；

PARMS_IWB63337B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTGCCCGGAAGCATGATATACTTAG-3’(序列2)；

PARMS_IWB63337C：5’-TTCAGAATACGCATTTAAGCAGCCG-3’(序列3)。

PARMS_IWB63337A中下划线序列为FAM结合序列；PARMS_IWB63337B中下划线序列为HEX结合序列。

上述序列1与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB63337的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB63337处的核苷酸为A，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与FAM结合序列结合的荧光基团FAM的荧光信号；

上述序列2与序列3所示的单链DNA分子可以扩增包括SNP位点IWB63337的DNA片段，所得PCR产物中SNP位点IWB63337处的核苷酸为G，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到PARMS master mix中与HEX结合序列结合的荧光基团HEX的荧光信号。

2、检测基因型

提取待测小麦的基因组DNA，加ddH₂O溶解作为模板，采用引物组PARMS_IWB63337进行PARMS反应，检测SNP位点IWB63337的核苷酸。

上述PARMS反应体系如表3所示；

表3、引物组PARMS_IWB63337的PARMS反应体系

其中，2×PARMS master mix为武汉市景肽生物科技有限公司产品，货号为E001-2。PARMS反应程序如表4所示：

表4、引物组PARMS_IWB63337的PARMS反应程序

PARMS反应结束后将所得产物用利用酶标仪或荧光定量PCR仪对PARMS反应产物进行荧光数据读取，用在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行荧光信号处理，并确定待测小麦SNP位点IWB63337的基因型：仅有FAM荧光信号的待测小麦为AA基因型小麦(即IWB63337标记为A的纯合型)，仅有HEX荧光信号的待测小麦为GG基因型小麦(即IWB63337标记为G的纯合型)，有FAM与HEX荧光信号的待测小麦为AG基因型小麦(即IWB63337标记为A和G的杂合型)。

待测小麦的基因型检测结果如表1和图1所示，表明利用上述方法可以用于检测小麦的检测IWB63337标记。

3、基因型与表型分析

进一步，根据步骤2的基因型分型结果，计算各基因型条锈病MDS的BLUP平均值，见表5。

表5、不同基因型小麦条锈病MDS的BLUP平均值

PARMS_IWB63337基因型	品种个数	条锈病MDS BLUP(％)
			AA	209	47.96
GG	28	63.46

从表5的结果可以看出，SNP位点IWB63337为AA基因型待测小麦条锈病MDS的BLUP平均值显著低于SNP位点IWB63337为GG基因型的待测小麦，说明SNP位点IWB63337为AA基因型待测小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB63337为GG基因型的待测小麦，SNP位点IWB63337携带A的小麦的条锈病抗性显著高于SNP位点IWB63337携带G的小麦。

因此，SNP位点IWB63337可用于辅助检测待测小麦是否抗条锈病，并用于抗条锈病分子育种。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 一种检测小麦抗条锈病QTL的分子标记及其在抗病育种中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tttgcccgga agcatgatat acttaa 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tttgcccgga agcatgatat acttag 46

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ttcagaatac gcatttaagc agccg 25

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 4

gctcttcggg ctcctcgctc ttcgctttgc ccggaagcat gatatactta rcggctgctt 60

aaatgcgtat tctgaagcat cagaaccatc ttctgccaac a 101

Claims

1.小麦抗病分子标记或检测所述小麦抗病分子标记的物质在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用；所述小麦抗病分子标记为对应于小麦基因组中序列表中序列4的第51位所示的核苷酸，所述小麦抗病分子标记为A或G。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述小麦抗病分子标记的物质为PARMS_IWB63337引物组，所述PARMS_IWB63337引物组由名称分别为PARMS_IWB63337A、PARMS_IWB63337B和PARMS_IWB63337C的单链DNA组成；

所述PARMS_IWB63337A为(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1的第22-46位所示的单链DNA；

所述PARMS_IWB63337B为(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2的第22-46位所示的单链DNA；

所述PARMS_IWB63337C为序列表的序列3所示的单链DNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：(b2)为序列表中序列1所示的单链DNA；(b4)为序列表中序列2所示的单链DNA。

4.小麦基因型的检测方法，所述基因型为AA基因型、AG基因型和GG基因型，所述方法包括：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸，如所述待测小麦两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为GG基因型小麦；如所述待测小麦两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测小麦为AG基因型小麦；

g1)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为A；

g2)对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸为G。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：检测待测小麦染色体中对应于序列表中序列4的第51位的核苷酸采用权利要求2或3中所述PARMS_IWB63337引物组进行。

6.权利要求1中所述小麦抗病分子标记。

7.具有如下Y1)-Y4)中任一用途的物质，包括权利要求2或3中所述PARMS_IWB63337引物组：

Y1)检测小麦抗病分子标记；

Y2)制备检测小麦抗病分子标记的产品；

Y3)检测或辅助检测小麦条锈病抗性；

Y4)制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品。

8.下述任一应用：

H1)权利要求1中所述小麦抗病分子标记在小麦育种中的应用；

H2)检测权利要求1中所述小麦抗病分子标记的物质在小麦育种中的应用；

H3)检测权利要求1中所述小麦抗病分子标记的物质在制备检测或辅助检测小麦条锈病抗性产品中的应用；

H4)权利要求4或5所述的方法在检测或辅助检测小麦条锈病抗性中的应用。

9.检测小麦条锈病抗性的方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测待测小麦的基因型，AA基因型待测小麦的条锈病抗性高于或候选高于GG基因型小麦。

10.小麦育种方法，包括：按照权利要求4或5所述的方法检测小麦的基因型，选择AA基因型或AG基因型小麦作为亲本进行育种。