CN104055800A - 土鳖虫蛋白酶酶解物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土鳖虫蛋白酶酶解物及其用途，具体步骤为A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；B、将土鳖虫细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心；C、取上清液，干燥，得到土鳖虫胃蛋白酶酶解物；D、取残渣转入人工肠液，加入胰蛋白酶水解，得到土鳖虫胰蛋白酶酶解物；步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。土鳖虫蛋白酶酶解物具有抗凝血或溶栓的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药制药领域，具体涉及土鳖虫酶解物及其应用。
背景技术
土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker 或冀地鳖Steleophaga plancyi（Boleny）的雌虫干燥体；主产于江苏、湖北、河南、河北等地；味咸，寒；有小毒；归肝经。主要功能为破血逐瘀，续筋接骨。用于跌打损伤，筋骨骨折，血瘀经闭，产后瘀阻腹痛，癥瘕痞块。
土鳖虫目前报道的主要成分为挥发油和氨基酸。但具体活性成分未有文献报道，传统中药以土鳖虫全虫入药，存在着服用剂量大，易造成微生物污染等弊病。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发生药效，故生物酶仿生提取方法模拟体内消化过程，提取的有效成分治疗效果更佳。
发明内容
本发明公开了一种土鳖虫蛋白酶酶解物及其应用，具有很好的抗凝血和溶栓作用。
本发明所采用的技术方案：
土鳖虫蛋白酶酶解物，由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、将土鳖虫细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心；
C、取上清液，干燥，得到土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣转入人工肠液，加入胰蛋白酶水解，得到土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
土鳖虫蛋白酶酶解物，由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、将土鳖虫细粉置于人工胃液中，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，离心；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小时，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
土鳖虫蛋白酶酶解物，由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液，置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
土鳖虫蛋白酶酶解物，由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入3%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH=6.8，将胃蛋白酶酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入3%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
土鳖虫蛋白酶酶解物，由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH=6.8，将胃蛋白酶酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入2%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
所述土鳖虫胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制备抗凝血或溶栓的药物中的应用。
所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
本发明的有益效果：由于目前动物药多以全粉入药，存在着剂量大、易造成微生物污染、用药剂量不当而引起敏反应、急性肝肾功能损害、溶血反应、中枢抑制和致畸等毒副作用。本发明提供了土鳖虫进行抗凝、抗血栓活性成分的分离纯化方法，可以有效的解决以上问题。
鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发挥药效，故本实验模拟胃和小肠的环境及消化过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生提取土鳖虫，使药材中的大分子蛋白水解为小分子肽类以利于人体吸收。APTT法、纤维蛋白原平板法为较常用的体外抗凝，溶纤试验方法，本实验以其为考察指标，证明酶解工艺的可行性。具体为以水解度为指标，单因素考察了仿生酶解法提取土鳖虫的工艺条件；以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标，对仿生酶解法提取土鳖虫的工艺进行验证。结果证实，仿生酶解法凝血时间长，抗血栓效果明显。
具体方法和结果通过以下实验证实：
1 材料
1.1 药材 土鳖虫（由石家庄以岭药业股份有限公司提供）
1.2 试剂 牛血清白蛋白（Sigma A7906，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；牛纤维蛋白原（Sigma F8630，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；胰蛋白酶1：250（Amresco0458，购自北京华美转导科技有限公司）；胃蛋白酶1：10000（Sigma P7000，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；医用注射性尿激酶（购自北京市望京医院）；凝血酶（Sigma T4648，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；APTT试剂10*1.5ml（购自上海太阳生物试剂公司）；Protein Assay Dye Rgnt（Bio-red 5000006，北京泽平科技有限责任公司）；三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯）；屈臣氏纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
生理盐水（称取氯化钠9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得）；人工胃液（取盐酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得）；人工肠液（取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得）。
1.3 仪器 UV-2000型分光光度计；800B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；ES-120型电子分析天平（长沙湘平科技发展有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.4 动物 健康的雄性日本大耳白兔，体重约2Kg（均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），符合国家健康一级动物标准。
2 方法与结果
以血浆凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）为活性指标，对仿生酶解工艺的酶底比和酶解时间进行考察。
考察指标
2.1.1 血浆凝血酶原时间（PT）测定法
样品制备：取适量土鳖虫提取物，配制成浓度为10mg/ml溶液，备用。
血浆的制备：取健康家兔（雌雄各半，产地北京）耳缘静脉注射乌拉坦麻醉后，颈动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝（1∶9），混匀后以3000r/min，离心10min，取上清液，分离出贫血小板血浆（PPP）。
取PPP100μl于测试杯中，加样品液10μl，37℃，预温3min，加入PT试剂200μl（预温3min），开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间。以生理盐水或90%乙醇为阴性对照（每个样品平行测定5份）。
凝血酶原时间比值（PTR）= 待测血浆PT/ 空白PT
2.1.2 活化部分凝血活酶时间（APTT）测定法
样品和血浆的制备：同PT法。
取PPP100μl于测试杯中，加样品液10μl（预温5min）和APTT试剂100μl（预温5min），孵育5min后加入CaCl2 100μl（预温15min），开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间。以生理盐水或90%乙醇为阴性对照（每个样品平行测定5份）。
2.2 工艺步骤如下：
2.2.1胃蛋白酶酶解工艺筛选
2.2.1.1 酶底比考察
称取5g土鳖虫药材细粉于250ml圆底烧瓶，加入人工胃液（固液比1∶20），密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，分别加入酶底比为2%、3%与4%的胃蛋白酶水解3h，将各酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液水浴挥干，得到不同酶底比的土鳖虫胃蛋白酶酶解物，每种提取物平行5份。
对不同酶底比的提取物进行PT与APTT药效考察，结果见表1和图1、2。
表1 胃蛋白酶不同酶底比提取物PT和APTT考察结果（ ）
注：与空白对照组比较，有抗凝效果，*P<0.05，**P<0.01。
结论：由SPSS17.0统计软件分析结果显示，2%和3%酶底比的胃蛋白酶酶解物与对照组有显著差异（P<0.01）。
2.2.1.2 酶解时间考察
对不同提取时间的提取物进行PT与APTT药效考察，结果见表3和图3、4。
表2 胃蛋白酶不同酶解时间提取物PT和APTT考察结果（）
注：与空白组比较，有抗凝效果，*P<0.05，**P<0.01。
结论：以生理盐水为对照，对不同提取时间的提取物进行PT和APTT检测，由SPSS统计软件分析结果显示，2h和3h的胃蛋白酶酶解物与对照组有显著差异（P<0.01）。
胰蛋白酶酶解工艺筛选
2.2.2.1 酶底比考察
称取土鳖虫药材100g，置于3000ml圆底烧瓶中，加入人工胃液（固液比1∶20），密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入酶底比为3%的胃蛋白酶，水解3h，抽滤，取残渣，烘干备用。
称取上述残渣1g于250ml圆底烧瓶，加入人工肠液（固液比1∶20），密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，分别加入酶底比为2%、3%与4%的胰蛋白酶水解3h，将各酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液水浴挥干，得到不同酶底比的土鳖虫胰蛋白酶酶解物，每种提取物平行5份，见表3、图5、6。
表3 胰蛋白酶不同酶底比提取物PT和APTT考察结果（）
注：与空白组比较，有抗凝效果，*P<0.05，**P<0.01。
结论：由SPSS17.0统计软件分析结果显示，以PT为指标时，三种酶底比的提取物均与生理盐水有差异（P<0.05）；以APTT为指标时，三种酶底比的提取物均与生理盐水有显著差异（P<0.01），且均以4%时药效最佳。
2.2.2.2 酶解时间考察
称取胃蛋白酶酶解残渣1g于250ml圆底烧瓶，加入人工肠液（固液比1∶20），密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入酶底比为3%的胰蛋白酶分别水解2h、3h与4h，将各酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液水浴挥干，得到不同提取时间的土鳖虫胰蛋白酶酶解物，每种提取物平行5份。见表4，图7、8。
表4 胰蛋白不同酶解时间提取物PT和APTT考察结果（）
注：与空白组比较，有抗凝效果，*P<0.05，**P<0.01。
3 仿生酶解法提取工艺药效验证
3.1 血小板聚集率（比浊法）
3.1.1样品制备：土鳖虫药材细粉加入人工胃液（固液比1∶20），密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入2%胃蛋白酶水解3h，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；取胃蛋白酶酶解液离心后的残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴作用30min后，加入4%胰蛋白酶水解2h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得土鳖虫胰蛋白酶酶解物。
取适量土鳖虫提取物，配制成浓度为10mg/ml溶液，即得。
血浆制备：取健康家兔（雌雄各半，产地北京）耳缘静脉注射乌拉坦麻醉后，颈动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝（1∶9），将抗凝的全血以1000r/min，离心10min，取上层血浆，即为富血小板血浆（PRP），剩余血液以3000r/min，离心10min，取上清液，分离出贫血小板血浆（PPP）。
血小板聚集率测定法：PPP调零后，将PRP 150μl与样品液10μl置于测试杯中37℃预温10min，加入诱导剂ADP(1mmol/L)10μl，测定10min内血小板最大聚集率。以生理盐水为阴性对照（每个样品平行测定5份）。计算公式如下：
血小板最大聚集率=PRP最大聚集时与基线之间的距离/90×100%
血小板聚集抑制率=（对照管血小板聚集率%-给药管聚集率%）/对照管血小板聚集率%×100%
表5 土鳖虫胃/胰蛋白物血小板聚集率、抑制率药效考察（）
| 血小板最大聚集率(%) | 血小板抑制率(%) | |
| 胃蛋白酶解物 | 20.5±4.5**Δ | 69.72 |
| 胰蛋白酶解物 | 29.8±4.3** | 58.03 |
| 生理盐水 | 71.0±4.9 | -- |
注：*与空白组比较，有显著差异，*P<0.05，**P<0.01。Δ与胰蛋白酶解物比较，有显著差异，Δ P<0.05， ΔΔ P<0.01。
结果表明：由SPSS17.0统计软件分析结果显示，土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物与生理盐水相比，均有显著的抑制血小板聚集作用（P<0.01）。而胃蛋白酶酶解物抑制作用强于胰蛋白酶酶解物（P<0.05）。
血凝-纤溶动态图
样品和血浆的制备：同PT法。
血凝-纤溶动态图试验：取PRP 200μl与样品液10μl 混匀，37℃预温10min，PPP调零，同时加入0.1mol/L CaCl2 50μl，搅动10s，平衡记录仪记录动态图，直至图形峰值持续稳定2min为止，以生理盐水为阴性对照（每个样品平行测定5份）。所得曲线即为血凝-纤溶动态图。根据动态图观察以下三个参数：
凝固启动时间(CST)；凝固时间(CT)； 相对凝固程度(RCE)；
表6 土鳖虫胃/胰蛋白物血凝-纤溶药效考察（）
| CST(s) | CT(s) | RCE(%) | |
| 胃蛋白酶解物 | 233.31±18.31**ΔΔ | 35.10±4.65**ΔΔ | 42.10±3.56ΔΔ |
| 胰蛋白酶解物 | 322.8±19.53** | 12.90±2.27** | 15.86±4.16 |
| 生理盐水 | 163.5±23.95 | 49.50±4.11 | 100 |
注：*与空白组比较，有显著差异，*P<0.05，**P<0.01。Δ与胰蛋白酶解物比较，有显著差异，Δ P<0.05， ΔΔ P<0.01。
结果表明：由SPSS17.0统计软件分析结果显示，土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物与生理盐水相比，均可延长CST，并显著降低最大凝固程度（RCE<50%）。但二者同时也使CT减少。提示土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物可能通过抑制凝血酶原转化为凝血酶而达到抗凝效果，RCE减少则表明其具有溶解纤维蛋白酶原的作用。胰蛋白酶酶解物与胃蛋白酶酶解物相比，可更显著的延长CST，并降低RCE（P<0.01）。
表7 土鳖虫胃/胰蛋白物抗凝纤溶活性指标综合结果分析
| PT | APTT | 血小板聚集率% | CST | CT | RCE | |
| 胃蛋白酶解物 | ↑** | ↑** | ↓** | ↑** | ↓** | ↓** |
| 胰蛋白酶解物物 | ↑** | ↑** | ↓** | ↑** | ↓** | ↓** |
注：↑表示延长，↓表示降低，*表示作用显著，*P<0.05，**P<0.01。
PT/APTT实验结果表明，土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物有显著的抗凝效果；血小板聚集率试验结果则显示两种酶解物均有抑制血小板聚集的作用，在上述三种指标的比较中，胃蛋白酶酶解物均优于胰蛋白酶酶解物；血凝-纤溶动态图试验显示胃/胰蛋白酶酶解物均具有溶解纤维蛋白酶原的作用，且胰蛋白酶酶解物活性更强。
本研究以PT/APTT实验结果均为阳性，表明土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物可能通过内源性及外源性两种凝血途径达到抗凝目的，由此确定土鳖虫酶解工艺参数；用血小板聚集率、血凝-纤溶动态图等指标评价该工艺提取物的作用，结果也均为阳性，表明采用仿生酶解法提取土鳖虫的工艺可行。由凝血-纤溶动态图中CST延长、CT减短结果，提示土鳖虫胃/胰蛋白酶酶解物可能通过抑制凝血酶原转化为凝血酶而延长凝血启动时间，而凝血启动后，两种酶解物均无法抑制纤维蛋白酶原转化为纤维蛋白，但可通过溶解纤维蛋白酶原而降低血浆最大凝固程度（RCE<100%）。
结论：由SPSS统计软件分析结果显示，以PT为指标时，三种酶解时间的提取物均与生理盐水有差异（P<0.05）；以APTT为指标时，三种酶解时间的提取物均与生理盐水有显著差异（P<0.01），为节约成本，确定酶解2h。
附图说明
图1是不同酶底比胃蛋白酶酶解物PT药效图；
图2是不同酶底比胃蛋白酶酶解物APTT药效图；
图3是不同提取时间胃蛋白酶酶解物PT药效图；
图4是不同提取时间胃蛋白酶酶解物APTT药效图；
图5是不同酶底比胰蛋白酶酶解物PT药效图；
图6是不同酶底比胰蛋白酶酶解物APTT药效图；
图7是不同提取时间胰蛋白酶酶解物PT药效图；
图8是不同提取时间胰蛋白酶酶解物APTT药效图。
具体实施方式
实施例1：
（1）：称取2g土鳖虫药材，粉碎成细粉。
（2）：将土鳖虫细粉置于50ml圆底烧瓶，然后向圆底烧瓶加入40ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入40mg的2%胃蛋白酶水解3h，得到胃蛋白酶酶解液，将酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min。
（3）取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物。
（4）取残渣加入40ml的 人工肠液，密闭于45℃恒温水浴30min，再加入100mg的 4%胰蛋白酶酶解2h，于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物。所得胃蛋白酶酶解物与胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
实施例2
（1）：称取5g土鳖虫药材，粉碎成细粉。
（2）：将土鳖虫细粉置于250ml圆底烧瓶，然后向圆底烧瓶加入100ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入40mg的3%胃蛋白酶水解2h，得到胃蛋白酶酶解液，将酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min。
（3）取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物。
（4）取残渣加入100ml 人工肠液，密闭于45℃恒温水浴30min，再加入100mg的 3%胰蛋白酶酶解3h，于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物。所得胃蛋白酶酶解物与胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
实施例3
（1）：称取5g土鳖虫药材，粉碎成细粉。
（2）：将土鳖虫细粉置于250ml圆底烧瓶，然后向圆底烧瓶加入100ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入40mg的2%胃蛋白酶水解2h，得到胃蛋白酶酶解液，将酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，
（3）取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物。
（4）取残渣加入100ml 人工肠液，密闭于45℃恒温水浴30min，再加入100mg的 2%胰蛋白酶酶解4h，于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物。所得胃蛋白酶酶解物与胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
Claims (7)
1.土鳖虫蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、将土鳖虫细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心；
C、取上清液，干燥，得到土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣转入人工肠液，加入胰蛋白酶水解，得到土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
2.根据权利要求1所述的土鳖虫蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、将土鳖虫细粉置于人工胃液中，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，离心；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小时，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
3.根据权利要求1所述的土鳖虫蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液，置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
4.根据权利要求1所述的土鳖虫蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入3%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH=6.8，将胃蛋白酶酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入3%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
5.根据权利要求1所述的土鳖虫蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备：
A、净选土鳖虫，粉碎成细粉；
B、向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1：20的人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH=6.8，将胃蛋白酶酶解液置于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min；
C、取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物；
D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45℃恒温水浴30min后，加入2%胰蛋白酶水解2-4h，将酶解液于85℃恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物；
步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。
6.根据权利要求1-5任一项所述的土鳖虫蛋白酶酶解物的应用，其特征在于：所述土鳖虫胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制备抗凝血或溶栓的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
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