CN104046646A

CN104046646A - 一种利用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法

Info

Publication number: CN104046646A
Application number: CN201410271256.6A
Authority: CN
Inventors: 葛文松; 陈颖伟; 范建高
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN104046646B

Abstract

本发明涉及一种利用SUMO***表达HMGB1A-box蛋白的方法，包括以下步骤：以包含HMGB1的质粒为模板，设计引物扩增A-Box结构域，将扩增后的目的基因A-Box亚克隆进pSumo-Mut表达载体的StuI和HindIII之间，获得pSumo-Mut-A-Box质粒；使用重组质粒转化ArcticExpress^TM(DE3)原核宿主菌，使用IPTG诱导表达目的蛋白；sumo蛋白酶酶解，获得高纯度的A-Box蛋白。本发明优点在于：应用SUMO表达***高效稳定、可溶性地表达了HMGB1A-box融合蛋白，经过SUMO蛋白酶I切割后可以获得纯度较高的成熟蛋白，且无氨基酸残基残留。

Description

一种利用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，是一种利用SUMO***高效可溶性表达HMGB1 A-box蛋白的技术。

背景技术

HMGB1 A-box的生产目前主要利用蛋白质工程技术和融合技术。

1.利用蛋白质工程技术，使用大肠杆菌作为以重组技术工业生产蛋白质的优选宿主细胞生产HMGB1 A-box。尽管大肠杆菌表达***具有表达量高、易于培养和操作以及生产成本低等优点，但是，使用该表达***仍难以直接获得大量可溶性的HMGB1 A-box，其原因在于HMGB1 A-box分子量小，极容易形成“包涵体”，即无生物学活性的不溶性聚合体。此外，即使获得大量的包涵体，为了得到有生物学活性的蛋白，还必须对包涵体进行变性—复性处理，这个过程往往损失大量的蛋白。

2. 采用传统的融合技术，将HMGB1 A-box基因与具有协助蛋白质正确折叠的融合蛋白如谷胱甘肽硫转移酶(GST)等进行融合表达。尽管蛋白的可溶性及收率有所提高，但是，耗时、昂贵的蛋白酶费用以及存在的蛋白酶水解靶蛋白的风险，常常不能获得令人满意的HMGB1 A-box产量。

但是关于利用SUMO***高效可溶性表达HMGB1 A-box蛋白的技术目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种利用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法，包括以下步骤：

a、以包含HMGB1的质粒为模板，设计引物扩增A-Box结构域，将扩增后的目的基因A-Box亚克隆进pSumo-Mut表达载体的Stu I 和Hind III之间，目标基因N端融合了Sumo标签蛋白，获得pSumo-Mut-A-Box质粒；

b、使用重组质粒转化ArcticExpress^TM (DE3)原核宿主菌，使用IPTG诱导表达目的蛋白，将诱导条件调整至11度，通过Ni亲和纯化获得sumo-A-Box融合蛋白；

c、再通过sumo蛋白酶酶解，将sumo融合蛋白与A-Box分离，再进行Ni柱亲和纯化，去除残留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合标签以及sumo蛋白酶，最终获得高纯度的A-Box蛋白。

所述的步骤a中扩增A-Box结构域的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

所述的步骤a中获得的pSumo-Mut-A-Box序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明优点在于：

1、通过在表达载体中引入SUMO融合标签，显著提高了外源蛋白的可溶性表达水平，促进其正确折叠，保证其生物学活性；

2、通过SUMO蛋白酶I对目标蛋白和融合标签进行分离，并且由于融合标签和蛋白酶都具有组氨酸标记，在通过层析柱时两者均可被吸附，达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了研究的时间和成本。

附图说明

图1. pSumo-Mut-A-Box测序验证序列。

图2. pSumo-Mut-A-Box质粒酶切验证结果。

图3. pSumo-Mut-A-Box质粒构建图谱。

图4.融合蛋白A-BOX-SUMO 的电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1:未诱导菌体；Lane 2, 3: IPTG诱导后菌体。

图5. A-BOX-SUMO融合蛋白纯化电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1: 0.2mM IPTG、11℃诱导后沉淀液；Lane 2: 0.2mM IPTG、11℃诱导后上清液；Lane 3:流出液；Lane 4:洗脱液；Note:红色箭头指示目标蛋白。

图6.Ni柱亲和纯化A-BOX-SUMO蛋白电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1: sumo融合蛋白；Lane 2:酶解混合物；Lane 3:流出液:目标蛋白；Lane 4:洗脱液: sumo标签。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、实验设计

以包含HMGB1的质粒为模板，设计引物扩增A-Box结构域，将扩增后的目的基因A-Box亚克隆进pSumo-Mut表达载体的Stu I 和Hind III之间，目标基因N端融合了Sumo标签蛋白，获得pSumo-Mut-A-Box质粒。使用重组质粒转化ArcticExpress^TM (DE3)原核宿主菌，使用IPTG诱导表达目的蛋白。优化表达条件，将诱导条件调整至11度，经检测sumo-A-Box融合蛋白分布于上清，通过Ni亲和纯化获得sumo-A-Box融合蛋白，再通过sumo蛋白酶酶解，将sumo融合蛋白与A-Box分离，再进行Ni柱亲和纯化，去除残留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合标签以及sumo蛋白酶，最终获得高纯度的A-Box蛋白。

二、试剂和耗材

pSumo-Mut质粒（诺百生物改造构建），

DH5α 菌株（诺百生物保种），

ArcticExpress^TM (DE3) （购自安捷伦公司，诺百实验室保种），

Protein Marker(诺百生物自制)，

Sumo蛋白酶（诺百生物），

IPTG、Acr、Bis、Tris(购自Sigma公司)，

SDS(购自Amresco公司)，

TEMED(购自BIO-RAD公司)，

Tyrptone、Yeast Extract(购自 OXOID公司)，

PCR反应管(购自Fisher公司)，

0.22 μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司)，

Ni2+IDA亲和层析胶购买于Novagen公司，

Agarose(购自上海基因公司)，

DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司)，

其它试剂均为国产分析纯。

三、主要实验仪器

Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 (美国BECKMAN公司)，

台式高速离心机(德国SORVAL公司)，

Biologic LP层析***、Mini Protean II垂直平板电泳***、Gel Doc2000成像***、水平电泳***(美国BIO-RAD公司)，

PTC-200基因扩增仪(美国MJ Research公司)，

320-S pH计(美国Mettler Toledo公司)，

AR5120电子天平(美国AHOM S公司)，

MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪(美国Amersham Pharmacia公司)，

雪花状制冰机(日本SANYO公司)，

JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所)，

超净工作台(中国苏净集团)，

NANODROP2000（Thermo公司）。

四、实验方法及结果

1、以HMGB1质粒为模板设计如下引物

F>5' GGAGGTATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAG 3'（SEQ ID NO.1）；

R>5' AAGCTTTGTTTCCCCTTTAGGAGGGATATAG 3'（SEQ ID NO.2）。扩增条件见下表1。

表1

使用Taq酶扩增，产物连接pSumo-Mut载体的Stu I和Hind III，获得pSumo-Mut-A-Box序列，pSumo-Mut-A-Box测序验证序列如SEQ ID NO.3和图1所示，其中第39位-第677位为目标基因区域，第416- 418位和第678-683位为设计的酶切位点，序列中第419位的T为在PCR扩增中额外增加的T，防止蛋白移码。

pSumo-Mut-A-Box质粒酶切验证如图2所示。

Marker:250,500,750,1000,1500,2000,3000,5000

基因名称:A-Box

酶切鉴定: Xba I/Xhol I

OD260/OD280: 1.85。

pSumo-Mut-A-Box质粒构建图谱如图3所示。

翻译后蛋白序列如SEQ ID NO.4所示，其中第1-127位为Sumo蛋白，第128-212位为目的蛋白A-Box，融合蛋白SUMO-A-Box理论分子量为24.08KD，A-Box蛋白理论分子量为9.91KD。

2、pSumo-Mut-A-Box载体转化至大肠杆菌ArcticExpress^TM (DE3)

(1)将质粒1 μl(约5ul)加入100 μl ArcticExpress^TM (DE3) 感受态细菌中，置冰上20min；

(2) 42℃热激90 sec，迅速置冰中5 min；加入600 μl 37℃预热的LB培养液；

(3) 37℃，220 rpm振摇1 h，离心后全部涂布于含50 μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

3、IPTG诱导pSumo-Mut-A-Box载体融合蛋白的表达

(1) 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培养液的试管中，37℃ 220 rpm振摇过夜；

(2) 次日按1：100接种于50 μg/ml Kan的30 ml LB培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体OD600为0.4 (约2h)；

(3) 取出1 ml培养物，10000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

(4) 向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM，11℃ 220 rpm振摇4 h，诱导A-Box融合蛋白表达；

(5) 取出1 ml培养物，12000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。

4、A-Box-Sumo融合蛋白的纯化

(1) 将15L诱导表达的培养菌体沉淀用600 ml Ni2+-IDA Binding-Buffer重悬后，超声破碎，4℃ 12000g离心20 min，取上清；

(2) 利用Biologic LP层析***，上清液上样至Ni2+-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱(0.8 cm，2 cm)；

(3) 用Ni2+-IDA Binding-Buffer冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(4) 用Ni2+-IDA Washing-Buffer(160 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH7.9)冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(5) 用Ni2+-IDA Elution-Buffer(160 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH7.9)，至流出液OD280值到达基线，分布收样；

(6) 取步骤5所收各管样品10 μl，进行18% SDS-PAGE分析。

5、A-Box-Sumo融合蛋白酶切

将所收集的目的融合蛋白于装入透析袋中，于20mM Tris-HCl（pH8.0）透析液透析过夜；SUMO酶对融合蛋白进行酶切，具体条件如下：按50 ug融合蛋白加入2U SUMO酶，30℃酶切30min，18% SDS-PAGE分析。

6、目的蛋白的进一步纯化

由于SUMO标签和SUMO蛋白酶的N-端均含有6个组氨酸蛋白标签，所以继续利用Ni2+-IDA亲和层析来分离SUMO标签、SUMO蛋白酶及目的蛋白，得到目的蛋白。

(1) 利用低压层析***，酶切后的蛋白混合液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱，收集流出液；

(2) 用Ni-IDA Elution-Buffer冲洗，至流出液OD280值到达基线，收集洗脱液。PBS7.4透析过夜。

(3) 18% SDS-PAGE分析。

7、SDS-PAGE鉴定结果

说明，由于Sumo蛋白是泛素蛋白，其本身会形成三级结构域，其表观分子量会稍微大于理论分子量，这种情况在我们的实验中会经常遇到，同时也有文献报道。

7.1 A-box-SUMO融合蛋白诱导表达鉴定

挑选了2个克隆子分别进行诱导表达鉴定分析，实验结果表明，在IPTG诱导后，两个克隆子的目的蛋白均产生了明显的表达，见图4。

7.2 A-box-SUMO融合蛋白亲和纯化

进一步对诱导后的产物进行分析，A-BOX-SUMO融合蛋白在上清中和沉淀中均有表达，选取上清进行Ni柱亲和纯化，获得的sumo-A-Box融合蛋白，纯度在90%以上，见图5。

7.3 Sumo 酶解及回收A-Box 蛋白

经过sumo蛋白酶酶解，Sumo标签蛋白与A-Box蛋白分离，通过Ni柱进一步纯化，去除Sumo标签、剩余的sumo-A-Box融合蛋白以及残余的sumo蛋白酶，流出液即为目的蛋白A-Box，18% SDS-PAGE电泳分析后，以薄层扫描和BandScan软件分析确定目的蛋白占总蛋白的百分比以计算其纯度，并用紫外分光光度计检测其浓度。其纯度达到90%以上，浓度为0.72mg/ml，见图6。

结论：纯化后获得纯度大于90%，浓度为0.72mg/ml的纯化蛋白。

SUMO(Small ubiquitin—like modifier)是一种小分子泛素样修饰蛋白，是一种分子伴侣，广泛存在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、信号转导、DNA复制与修复、RNA转录、蛋白的核质运输、细胞周期及多种炎症反应过程的调控等多种生理进程。近年来，SUMO作为融合标签和分子伴侣用于外源重组蛋白的表达，可明显提高外源蛋白的稳定性和可溶性。SUMO具有较高的热稳定性并能够抵抗蛋白酶的水解作用，同时SUMO蛋白具有一个高度疏水的核心，可能为目的蛋白的折叠提供成核位点，这些可能是SUMO能够提高外源蛋白稳定性和可溶性的原因。利用SUMO标签表达融合蛋白的另一个优点是利用SUMO蛋白酶可以识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来，不会影响目的蛋白的活性。本研究应用SUMO表达***高效稳定、可溶性地表达了HMGB1 A-box融合蛋白，经过SUMO蛋白酶I切割后可以获得纯度较高的成熟蛋白，且无氨基酸残基残留。此外，在表达水平和产物的可溶性方面SUMO表达***明显优于传统表达***，是表达重组蛋白的理想工具。

本发明在研究过程中通过构建SUMO原核表达载体与SUMO蛋白酶，解决了融合蛋白表达的两大关键性技术问题：一是表达外源蛋白的溶解性问题。通过在表达载体中引入SUMO融合标签，显著提高了外源蛋白的可溶性表达水平，促进其正确折叠，保证其生物学活性。二是融合标签的去除问题。本发明通过SUMO蛋白酶I对目标蛋白和融合标签进行分离，并且由于融合标签和蛋白酶都具有组氨酸标记，在通过层析柱时两者均可被吸附，达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了研究的时间和成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属新华医院

<120> 一种利用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaggtatgg gcaaaggaga tcctaagaag 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagctttgtt tcccctttag gagggatata g 31

<210> 3

<211> 712

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaattggagc cacccgcagt 60

tcgaaaaaag cagcggcagc agcggcggtc atcaccatca tcatcacggc ggcagcggcg 120

gcagcgggtc ggactcagaa gtcaatcaag aagctaagcc agaggtcaag ccagaagtca 180

agcctgagac tcacatcaat ttaaaggtgt ccgatggatc ttcagagatc ttcttcaaga 240

tcaaaaagac cactccttta agaaggctga tggaagcgtt cgctaaaaga cagggtaagg 300

aaatggactc cttaagattc ttgtacgacg gtattagaat tcaagctgat caggcccctg 360

aagatttgga catggaggat aacgatatta ttgaggctca ccgcgaacag attggaggta 420

tgggcaaagg agatcctaag aagccgagag gcaaaatgtc atcatatgca ttctttgtgc 480

aaacttgccg ggaggagcac aagaagaagc acccagatgc ttcagtcaac ttctcagagt 540

tttctaagaa gtgctcagag aggtggaaga ccatgtctgc taaagagaaa ggaaagtttg 600

aagatatggc aaaggcggac aaggcccgtt atgaaagaga aatgaaaacc tatatccctc 660

ctaaagggga aacataaaag cttgcggccg cactcgagca cctgagatcc gg 712

<210> 4

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Ser Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Gly His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp

20 25 30

Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys

35 40 45

Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile

50 55 60

Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala

65 70 75 80

Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr

85 90 95

Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met

100 105 110

Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Met

115 120 125

Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala

130 135 140

Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp

145 150 155 160

Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp

165 170 175

Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys

180 185 190

Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro

195 200 205

Lys Gly Glu Thr

210

Claims

1.一种利用SUMO***表达HMGB1 A-box蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

再通过sumo蛋白酶酶解，将sumo融合蛋白与A-Box分离，再进行Ni柱亲和纯化，去除残留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合标签以及sumo蛋白酶，最终获得高纯度的A-Box蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中扩增A-Box结构域的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中获得的pSumo-Mut-A-Box序列如SEQ ID NO.3所示。