CN103088030B

CN103088030B - 一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途

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Publication number: CN103088030B
Application number: CN201210518226.1A
Authority: CN
Inventors: 华卫建
Original assignee: JIANGSU INSTITUTE OF EDUCATION
Current assignee: JIANGSU INSTITUTE OF EDUCATION
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-12-06
Also published as: CN103088030A

Abstract

本发明属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。利用本发明获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。

Description

一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途

技术领域

本发明属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。

背景技术

蜈蚣（centipede）是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有3300种（Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann. Rev. Entomol. 2007. 52, 151-170.）。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣（以下所称蜈蚣皆为此类）为其中最凶猛的捕食性动物，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食；大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液***发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz, C.B.F.Mourao, K.G.Moreira, T.S.Camargos, M.R.Mortari, Pept Sci. 2012. 98(4):385–405.) ，迄今未见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达。

最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素（E.A.B.Undheim等，Toxicon 57 (2011) 512–524），包括多种离子通道毒素（Yang等，Mol Cell Proteomics. 2012;11(9):640-50.），因而被学界称为“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒液中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。

具体来说，本发明提供了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，其具体序列为：CAG GTG CTG GTT GAA GAC GAT GTC CCG TTC CCG GAA AAG AAG TTC GCC GAC CGT GGT GAA TGT ATC CGT GCG TGT GCT GCC AAG TTT ACC GAT GGC GAC CTG AGC AAA ATC AAA GAT GTG CTG CCG CGT TAC TAC AAG TGT GTG TGT TGG TAT TAT CCG ACC TCG TAA。

同时，本发明还公开了重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因突变形成至少含有64%的与SEQ ID NO1中的密码子相同的突变体基因。

根据本发明的发明目的，发明人对预测的少棘蜈蚣天然毒素Scolotoxin-Ssm2a成熟肽的55个氨基酸残基序列按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用频率作优化设计，改造了其中36个密码子（占55个密码子的65.5%）的42个位点，使改造后的Scolotoxin-Ssm2.1更适于在大肠杆菌中表达。同时根据重组克隆的需要，在该基因的末端加上限制性内切酶XhoI的识别序列，采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.1成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。

进一步地，本发明公开了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，包括如下步骤：

A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1突变体基因的重组质粒pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1;

B，将重组质粒pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；

C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体；

D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；

E，将上清液反复通过Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；

F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a。

特别地，本发明还公开了上述步骤c的具体步骤为：将重组质粒的工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6~0.8时，逐步加入IPTG至终浓度0.5mol/L，于18℃表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。

进一步地，本发明还公开了所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

利用本发明所公开的表达纯化方法，可以获得重组蜈蚣抗昆虫毒素，根据SDS-PAGE和胶图扫描灰度分析，蛋白表达量占菌体总蛋白的24.79%。

更进一步地，本发明还公开了由重组蜈蚣抗昆虫毒素基因表达得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a。

以及上述毒素rScolotoxin-Ssm2a在制备神经毒性类制剂中的应用，特别是在制备杀虫剂中的应用。

利用本发明获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。

最后，本发明还公开了所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a中含有两对正确连接的共价二硫键，这一高活性重组蜈蚣抗昆虫毒素的蛋白结构形式。

本发明实施中对昆虫神经毒性的活性检测采用昆虫整体活性测定法，对三种不同昆虫作腹腔注射鉴定，结果（见表1、2和图9）表明基因工程产生的重组多肽rScolotoxin-Ssm2a具有明显的昆虫神经毒性和杀虫效果。

附图说明

图1 少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列测定图谱。

图2 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1与天然Scolotoxin-Ssm2.1基因及其编码的氨基酸序列比对图；其中

第一行为少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列，为了方便标示，仅给出与人工设计序列不同的碱基，其余未标出部分与第二行中的碱基相同；第二行为重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列；第三行为对应的重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2a的多肽序列。

图3 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列测定图谱。

图4 表达载体pSUMO-Mutant的物理图谱和多克隆位点示意。

图5 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1的构建流程

图6 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图

图中M: 分子量标记，1: 重组质粒XhoI/XbaI酶切结果， 2:空载质粒XhoI/XbaI酶切结果。

图7 经过IPTG诱导的工程菌表达融合蛋白的SDS-PAGE分析图谱

图中M：分子量标记；1：未诱导菌总蛋白；2、3：诱导菌总蛋白；4：诱导菌超声沉淀；5：诱导菌超声上清。

图8 重组融合蛋白与目标多肽rScolotoxin-Ssm2a分离的SDS-PAGE分析图谱

图中M：分子量标记；1：超声上清；2：镍柱纯化上样流出液；3：镍柱纯化洗脱液；4：酶切混合液；5：酶切液再过柱的流出液（目标肽）；6：酶切液再过柱的洗脱液（标签蛋白）。

图9 重组少棘蜈蚣抗昆虫神经毒素rScolotoxin-Ssm2a对家蝇的毒性鉴定实验结果图

图中 A:10ug/ml组，B:1ug/ml组，C: 0.1ug /ml组，D: 0.01ug /ml组，E :0.001ug /ml组，F:对照组。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

在本实施例中，选用少棘蜈蚣的天然毒素基因作为原料。

实施例1 ：蜈蚣毒腺总RNA的提取与少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1 cDNA克隆及序列测定

活体解剖分离蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol 试剂（Invitrogen公司）试剂盒提取总RNA，按SMART^TM cDNA Library Construction Kit 说明书操作进行cDNA第一链合成，LD- PCR扩增合成第二链，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA，与载体λTriplEx2连接、包装。带有***片断的载体通过电转化倒入E.coli DHl0B感受态细胞，SOC培养基37℃ lh100rpm恢复，涂于带有诱导剂IPTG和X-Gal显色剂的琼脂培养基上培养过夜。挑取白斑，PCR快速鉴定***片断大小。检验合格的cDNA文库大规模培养，标准碱裂解法提取模板，ABI 3730测序仪测序，获得少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin- Ssm2.1cDNA序列，测序结果参见附图1。

实施例组2

实施例2-1 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1的构建

（1）重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的优化与合成

按照大肠杆菌的密码子偏好将少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的cDNA序列优化，并在该基因的末端加上限制性内切酶Xho I的酶切位点，合成出全长的重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1，其核苷酸序列与天然毒素的核苷酸序列比对参见附图2。

（2）重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1的构建：

将合成的Scolotoxin-Ssm2.1 DNA经限制酶XhoI酶切后连接到表达载体pSUMO- Mutant中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序。结果正确，说明克隆成功，得到重组表达载体质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1，重组基因序列参见附图3。

实施例2-2 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a 的高效原核表达

（1）重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的表达

制备大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将测序正确的重组表达载体pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1 利用热休克法（42℃热激45秒）转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株，其构建基础及构建流程参考图4与图5，构建结果检测参见图6。

挑取工程菌株单菌落接种于Kan + LB液体丰富培养基中，37℃振荡培养过夜。次日取该过夜菌按1∶100 体积比接种于新鲜的Kan + LB丰富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L，于18℃诱导表达6h。诱导结束后，4℃、10,000rpm离心10min，收菌。

所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4) 洗涤一次，离心，再用预冷的Lysis Buffer (50mmol/L NaH₂PO4，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0) 以1∶10的比例重悬。以200W功率在冰浴下超声20 min破碎细菌细胞。超声结束后，用4℃、 12,000g离心20 min，收集含重组融合蛋白的上清液。含空载质粒pSUMO-M的对照菌株BL21(DE3) 同样处理，收集含标签蛋白的上清液。SDS-PAGE电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的24.79%，电泳结果见附图7。

（2）重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a的制备

(2.1) 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的亲和层析

采用Biologic LP 层析***对重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白进行层析。

首先采用20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L imidazole， 6 mol/L guanidine-HCl,，pH8.0的缓冲液预平衡Ni²⁺-IDA Sepharose CL-6B亲和层析柱(0.8 cm×2 cm)。

将含重组融合蛋白的上清液以0.5 ml/min 流速上样至上述已经预平衡的Ni²⁺-IDA Sepharose CL-6B亲和层析柱；

用Ni²⁺-IDA Binding Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L imidazole， 6 mol/L guanidine-HCl,，pH8.0）以0.5 ml/min 流速洗脱，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样留以电泳，参看附图8中的第一泳道；

用Ni²⁺-IDA Washing Buffer(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min 流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样留以电泳，参看附图8中的第二泳道；

用Ni²⁺-IDA Elution Buffer(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min 流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样。

通过上述亲和层析步骤对上述重组融合蛋白作进一步纯化，收集，多次纯化后产品参看附图8中的第三泳道。对照样品同样处理获得纯化后的标签蛋白——SUMO蛋白。

(2.2) 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a的制备

取上述收集的纯化后重组融合蛋白按20：1（V/V）比例加入SUMO蛋白酶，30℃切割半小时，混合液参看附图8中第四泳道，获得目标蛋白——重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a多肽（附图8中的第五泳道）与标签SUMO蛋白的混合物（见附图8中的第六泳道）。对照样品同样处理，仅含标签SUMO蛋白。

实施例3 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对鳞翅目模式昆虫家蚕的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对鳞翅目模式昆虫家蚕幼虫的体腔注射实验鉴定由重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1编码的多肽rScolotoxin-Ssm2a的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为鳞翅目模式昆虫家蚕多化性品种大造（由中国农业科学院蚕业研究所张国政研究员提供）的三龄幼虫,每组30头,重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2a多肽与SUMO标签蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2a的工作浓度为1 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从蚕体第8和第9腹节右侧的节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后2-10秒, 蚕体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，家蚕头胸伸出、躯体收缩、***拖粪、腹足失去抓握力而侧翻倒地、软瘫至死。10分钟内，3个给药组的死亡率皆达100%（表1）。而注射SUMO标签蛋白的对照组家蚕仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常爬动，无任何中毒症状；24小时内也无一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin-Ssm2a对鳞翅目模式昆虫家蚕具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

表1 rScolotoxin-Ssm2a对家蚕幼虫的神经毒性与致死性

实施例4 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对农业主要害虫斜纹夜蛾幼虫的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对农业主要害虫斜纹夜蛾幼虫的体腔注射实验来鉴定由重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1编码的多肽rScolotoxin-Ssm2a的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为农业主要害虫斜纹夜蛾的四龄幼虫（由北京中科白云绿色生物技术有限公司提供），每组30头,重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2a多肽与SUMO标签蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2a的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从虫体第8和第9腹节右侧的节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡的数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后2-10秒, 虫体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，棉铃虫头胸伸出、***拖粪、腹足失去抓握力而侧翻或仰翻倒地、软瘫至死。其中的多数个体于1小时内中毒死亡，24小时3个给药组的死亡率皆达100%（表2）。而注射SUMO标签蛋白的对照组棉铃虫仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常爬动，没有任何中毒症状；24小时内无一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin-Ssm2a对斜纹夜蛾幼虫具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究工具试剂及生物杀虫剂。

表2 rScolotoxin-Ssm2a对斜纹夜蛾幼虫的神经毒性与致死性

实施例5 重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对环境害虫家蝇的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对双翅目环境害虫家蝇的体腔注射实验来鉴定由重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1编码的多肽rScolotoxin-Ssm2a的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为家蝇成虫（由江苏省疾病预防控制中心消毒与媒介生物防制所提供），每组10头。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2a多肽与SUMO蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2a的工作浓度梯度为0.001ug-10ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO蛋白酶酶切的SUMO标签蛋白。从家蝇第3和第4腹节的节间膜处注入试药2μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡的数量，计算死亡率。

结果分析：注入最高浓度毒液后数秒, 家蝇即出现剧烈抖足和振翅痉挛、并于1分钟内全部死亡。注入浓度梯度毒液10秒后，中毒家蝇出现口器及产卵管伸出、剧烈抖足与振翅痉挛，数分钟后立足不稳、侧翻或翻转倒地，并于6小时内先后死亡（图6）。而注射SUMO标签蛋白的对照组家蝇仅在注射后数分钟内静伏，很快恢复正常的活动，没有任何中毒症状。由此可得，多肽rScolotoxin-Ssm2a对环境害虫家蝇具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏教育学院

<120> 一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 168

<212> DNA

<213> 中国江苏少棘蜈蚣（Scoropendra subspinipes mutilans）

<400> 1

caggtgctgg ttgaagacga tgtcccgttc ccggaaaaga agttcgccga ccgtggtgaa 60

tgtatccgtg cgtgtgctgc caagtttacc gatggcgacc tgagcaaaat caaagatgtg 120

ctgccgcgtt actacaagtg tgtgtgttgg tattatccga cctcgtaa 168

Claims

1.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，其特征是包括如下步骤：

A，构建权利要求1所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的重组质粒;

B，将重组质粒转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；

D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；

D，将上清液反复通过Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；

E，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素。

3.根据权利要求2所述重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，其特征是所述步骤c的具体步骤为：将重组质粒的工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L，于18℃表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。

4.根据权利要求2所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，其特征是：所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

5.根据权利要求2至4中任意一项所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素。

6.权利要求5中所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素在制备针对昆虫的神经毒性类制剂中的应用。

7.根据权利要求6中所述的应用，特别是重组蜈蚣抗昆虫毒素在制备杀虫剂中的应用。