CN104045823A - 一种甘草次酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草次酸修饰的硬脂酸-聚乙二醇两亲性化合物及其制备方法和应用。本发明利用酰化反应对甘草次酸C3位的羟基进行保护，聚乙二醇一端的羟基和甘草次酸C30位羧基反应生成酯，而聚乙二醇的另一端的羟基则与硬脂酸反应生成酯，得到乙酰甘草次酸、聚乙二醇、硬脂酸共价键合的乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸。该化合物合成、纯化方法简单，能与常规磷脂、胆固醇等采用通用的方法形成脂质体，含有这种化合物的脂质体具有肝实质细胞主动靶向和长循环作用，可以作为各种药物或影像增强剂或示踪物质的载体，可用于肝脏疾病的诊断、治疗。

Description

一种甘草次酸衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种肝靶向长循环脂质体及其制备方法和用途，具体涉及一种两亲性甘草次酸衍生物的合成方法，以及含有这种衍生物的脂质体(liposome)及其作为药物、生物活性物质、示踪物、诊断试剂或影像增强剂的肝靶向长循环载体的应用。

背景技术

我国是世界上肝脏疾病的高发区，癌症发病率处于世界前列，特别是肝癌、食道癌和胃癌的发病率为世界第一。当前，据血清流行病学调查，我国人群的乙肝表面抗原(HBsAg)携带率为10％，约1.3亿人，其中1/4的人最终将发展为慢性肝病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝癌，丙肝病毒感染者也已超千万人。然而，面对如此庞大的患者人群，治疗现状却不容乐观。肝脏的病变不仅危害肝脏，同时也会因代谢和解毒功能受损而影响心脏、大脑、消化***、内分泌和免疫力，引发各种心脑血管疾病和肿瘤，因此预防和治疗肝脏病变对于人体极其重要。对于早期肝癌患者来说癌细胞并未扩散到***和身体的其它部位，手术切除治疗是最为有效的治疗手段。然而肝癌的发病较隐匿，早期患者无明显症状，一旦出现症状前往医院就诊时，其病程大多已进入中、晚期，错过了手术治疗的最佳时期。此时即使手术切除，治疗成功率也仅为20％～30％。因此，实现肝癌的早期高灵敏检测是手术治疗能否成功的关键因素。这对于显像学的发展提出了更高的要求。而对于肝炎、肝硬化以及中晚期肝癌患者：非手术治疗，尤其是药物治疗就成为了综合治疗的重要手段之一。化疗是目前除了手术治疗之外最主要的治疗方法。但传统的化疗方式是通过常规途径给药，当达到一定的血药浓度后药物在全身分布，缺乏选择性，在杀伤癌细胞的同时还会对其它正常脏器产生严重的毒副作用，不仅影响疗效也给病人带来巨大痛苦。由此可见传统治疗方法滞后，治疗效果不好，不少治疗方法甚至是边治肝边伤肝，使肝病治疗陷入了一个久治不愈、久药不果的怪圈。

因此改变化疗的给药途径、变换药物剂型等各种各样的尝试势在必行，也从未间断。靶向给药***可以将药物运送到指定的靶器官或靶组织释放，与传统的化疗相比，可以提高药物在靶部位的药理作用强度，明显降低药物毒副作用，提高治疗效果。

随着对细胞表面结构功能认识的不断深入，近年来受体介导的肝靶向递送***成为研究热点。它是采用物理或化学的方法将特定的配基引入药物载体，通过配基与肝脏细胞膜上的受体发生特异性相互作用，将药物、基因等化学物质选择性地输送至肝脏，提高负载物在肝脏部位的浓度，延长其半衰期，从而达到减少用药剂量和给药次数，降低药物毒副作用，减少对其它脏器的损伤，提高药效。

纳米颗粒和细胞的相互作用包括细胞吞噬、被动靶向、主动靶向等。被动靶向指的是载药微粒进入体内后，由于肿瘤与正常组织间血管密度及渗透性的差异或被巨噬细胞作为外界异物吞噬的自然倾向而产生的体内分布特征。一般认为：被动靶向的微粒经静脉注射后其在体内的分布首先取决于粒径的大小：小于100nm的纳米囊或纳米球可缓慢积集骨髓；100～200nm的纳米粒子可富集于实体肿瘤部位；0.2～0.3μm的粒子一般被肝脾中的巨噬细胞摄取；大于7μm的微粒通常被肺毛细血管床截留进入肺组织或肺气泡。

肝脏拥有人体内数量最多的吞噬细胞——枯否细胞(KCs)，约占吞噬细胞总数的80％。研究表明，具有以下特征的颗粒会被迅速清除，并在肝脾等器官累积，从而产生一定被动靶向功效：①拥有较大的粒径(直径>200nm)；②非球形颗粒；③表面具有较强疏水性；④表面具有高密度电荷。由此可见，被动肝靶向给药体系主要依赖于体内的单核吞噬细胞***(MPS)。因此利用MPS的吞噬功能就成为了肝靶向给药的有效途径。尽管MPS靶向对于治疗肝肿瘤具有一定的促进作用，但众所周知，恶性肝肿瘤往往发生在肝实质细胞，而MPS会将大量药物聚集在枯否细胞中，这就造成大量药物无法直接作用于肿瘤部位，影响治疗效果。因此开发肝实质细胞靶向给药***就显得尤为重要(王蔚，袁直，“肝靶向纳米给药***的最新研究进展”，高分子通报，2013，1：137～154)。

主动靶向给药***主要包括三个部分：靶向基团、载体以及药物。主动靶向给药就是载体将药物通过局部给药或全身血液循环选择性地富集于靶器官、靶组织、靶细胞或细胞内结构中。为了降低MPS***对主动靶向效率的影响，首先应保证药物载体能逃离MPS的吞噬，并实现在血液内的长效循环。因此，一般均需对纳米粒子表面进行亲水改性并控制其粒径在100～200nm之间(亦有文献报道为50～150nm)。由于PEG具有高亲水性、高体积排阻效应以及低毒性已经成为目前最常用的亲水改性试剂。

脂质体作为一种抗肿瘤化疗药物的载体，也是最理想的非病毒基因载体，是一类由两亲性分子(多为磷脂)形成的具有类似细胞膜双分子层结构的囊泡，可以将多种物质(药物、核酸等)转运至动物、植物和微生物等多种类型的细胞中，使被包载物的生物学活性不被破坏，而且还可以提高传递效率，因而在生物、化学、医药等领域得到广泛研究和应用。脂质体本身具有被动靶向的性质，经静脉注射给药之后能选择性地分布于肝脏、脾脏、骨髓等内皮网状***(RES)丰富的组织器官中。但脂质体在肝脏中主要是被肝脏的非实质细胞组织所内化吞噬入细胞内而吸收，只有少量能够被肝脏实质细胞所吸收。肝实质细胞是肝脏中数量最多的细胞，约占肝脏总细胞数的60％～70％，有关肝的大多数病变如肝癌、肝炎、肝硬化等多发生于此，是肝靶向给药***理想的靶标之一，因此只有有效提高药物对病灶组织的靶向性，才能提高载药脂质体在肝脏实质细胞中的吸收量，从而真正发挥药效。

肝实质细胞表面含有多种受体：如去唾液酸糖蛋白受体可以识别半乳糖乳糖等配体，甘草酸、甘草次酸受体可以识别甘草酸以及甘草次酸等。利用这些受体配体间特异性的相互作用，研究人员研发出一系列高效的肝靶向给药***。目前已见报导的配基有去唾液酸糖蛋白、乳糖酸、半乳糖化配体、无唾液酸胎球蛋白以及豆甾醇糖苷等。其中去唾液酸糖蛋白受体能专一识别末端带有半乳糖残基或乙酰半乳糖胺残基的寡糖或寡糖蛋白。胆酸是胆汁的主要成分，在体内具有特殊的转运***，可被肝脏特异性吸收。胆酸盐介导的肝靶向给药***是通过肝细胞膜上的Na⁺依赖性转运***(NTCP)及Na⁺非依赖性转运***(OATP)来实现的，以胆酸为药物载体，不但能够实现药物的肝靶向性，减少毒副作用，还能够提高药物的口服生物利用度。甘露糖受体是分子量为175000的跨膜蛋白，能与含有甘露糖配基的物质特异性识别结合，广泛存在于肝细胞表面。此外研究比较多的还有透明质酸受体、胰岛素受体等。与这些配体物质相比，能与甘草酸、甘草次酸受体特异性作用的甘草酸和甘草次酸配体有着独特的优势。

甘草是中国自古以来就应用广泛的一种重要传统中药，根据现代的甘草药理学、体内代谢学研究可知，当甘草酸口服之后，经胃酸水解或者由肝脏中β-葡萄糖醛酸酶酶解可以得到甘草酸类药物中主要发挥药力活性作用的五环三萜类化合物——甘草次酸，所以甘草次酸是甘草中最终起作用的成分。甘草次酸来源于豆科植物甘草的根及根茎，廉价易得，安全性高，具有多种药理活性，如抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒性肝炎及保肝护肝等。除了较强的治疗炎症的效果外，还具有激活免疫***活性、抑制肿瘤细胞增殖和转移、抗心律失常、抗病毒、提高内耳听力抗缺氧等多种治疗作用。研究表明，肝细胞表面存在大量甘草次酸受体，甘草次酸对肝细胞有特异识别和吸附能力，与该位点的结合呈可饱和性、高度特异性，能有效的发挥其在肝脏疾病中的治疗作用，目前在临床上较多的用于慢性肝炎以及肝癌的治疗，例如甘草次酸修饰的纳米粒子用于肝靶向药物传递【TIAN Q，ZHANG C N，WANG X H，et al.“Glycyrrhetinic acid-modified chitosan/poly(ethylene glycol)nanoparticles for liver-targeteddeliver”[J]Biomaterials，2010，31(17)：4748-4756】。

近年来，已有有关表面经甘草次酸修饰的脂质体用于药物肝靶向的传输以及治疗的报道【Mao SJ，Bi YQ，Jin H，et al.“Preparation，characterization and uptake by primary culturedrat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid”.Die Pharmazie，2007，62：614-619】。Chen ZP等人【Chen ZP，Xiao L，Liu D，et al.“Synthesis of a novel polymercholesterol-poly(ethylene glycol)2000-glycyrrhetinic acid(Chol-PEG-GA)and its application inbrucine liposome”[J].Journal of Applied Polymer Science，2012，124(6)：4554-4563】将胆固醇、聚乙二醇和甘草次酸偶联以得到两亲性化合物Chol-PEG-GA，并将其用于制备甘草次酸修饰的长循环脂质体(Chol-PEG-GA Liposome，CPGL)来包载二甲马钱子碱，再将该载药脂质体静脉注射入小鼠体内进行组织分布研究，以传统脂质体为对照。实验结果显示，载药CPGL脂质体的药时曲线下面积(Area Under Curve，AUC)以及平均驻留时间(MeanRetention Time，MRT)分别为传统脂质体的2.31倍和2.11倍；另外，使用甘草次酸修饰的载二甲马钱子碱脂质体CPGL注射后，药物在小鼠肝脏组织中的浓度要比使用传统脂质体的小鼠肝脏组织浓度高七倍左右，这表明甘草次酸修饰的长循环脂质体具有显著的肝靶向性和延长药物释放时间的效果。

中国专利CN200810156141.7公开了甘草次酸前体脂质体及其制备方法，该专利是将甘草次酸直接作为药物包载在脂质体脂双层中，并引入了聚乙二醇以起到长循环作用。

中国专利CN201010228799.1公开了甘草次酸修饰磷脂和胆固醇作为脂质体膜材使用，合成肝靶向脂质体、胶束和复合物的制法，期望达到肝靶向长循环的作用；但是该专利可能存在的问题：一是在合成其中一个物质甘草次酸修饰聚乙二醇化胆固醇时，先将甘草次酸与聚乙二醇反应而未对甘草次酸上的羟基进行保护，这样反应结束后两端都有羟基，之后再与胆固醇反应，这样就存在以下两种可能：(1)反应可能生成胆固醇-甘草次酸-聚乙二醇，甘草次酸的两端均被键连，这样作为膜材组成脂质体时，甘草次酸很可能被埋在了脂双层中，很难真正起到肝靶向作用；(2)该反应也可能生成甘草次酸-聚乙二醇-胆固醇，这个物质才能真正起到肝靶向作用。但是该专利中并没有具体说明制备肝靶向脂质体所用的是哪一种化合物。二是该专利实施例5在制备脂质体时是先制备空白肝靶向脂质体，然后再与绿荧光蛋白质粒溶液孵育，虽然脂质体具有一定的流动性，也很可能导致大量质粒游离在脂质体之外，很多肝靶向脂质体还是空白脂质体，治疗效果会大打折扣。实施例6中是先制备空白载基因脂质体，再加入甘草次酸修饰聚乙二醇化的胆固醇进行孵育，以起到肝靶向作用，这同样存在甘草次酸修饰聚乙二醇化的胆固醇无法顺利嵌入脂双层中的问题，很难真正合成肝靶向脂质体。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明采用甘草次酸作为肝实质细胞的靶向配体，共价连接具有长循环作用的聚乙二醇，并在聚乙二醇另一端共价连接可以定位在脂双层中的硬脂酸，制备一种两亲性甘草次酸衍生物——乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)，含有该化合物的脂质体同时具备了肝实质细胞靶向和长循环作用，采用常规的脂质体组分和制备方法可得到包载药物或造影剂、临床所用试剂的脂质体，可望应用于临床。

本发明的目的是合成一种经济、稳定、实用性强的肝靶向长循环脂质体分子构件，以用作一系列亲疏水药物、基因、造影剂、示踪物、诊断试剂等的载体，由于采用本发明提供的分子构件所制备的脂质体具有长循环肝靶向的性质，从而可以提高包载物对肝脏实质细胞的靶向性，降低毒副作用，提高疗效。

本发明利用酰化反应对甘草次酸C3位的羟基进行保护，聚乙二醇一端的羟基和甘草次酸C30位羧基反应生成酯，而聚乙二醇的另一端的羟基则与硬脂酸反应生成酯。具体地，首先，由甘草次酸(GA)与乙酰氯(摩尔比为1：5～10)反应，以与甘草次酸1～2倍摩尔量的碳酸钾或三乙胺作为缚酸剂，得到乙酰甘草次酸(AGA)；接着乙酰甘草次酸在脱水剂二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下，控制反应条件，与聚乙二醇单端反应，得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇；然后将硬脂酸用过量的二氯亚砜进行酰氯化，产物纯化后，与乙酰甘草次酸-聚乙二醇进行反应，得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸。

本发明所提供的技术方案具体如下：

一种甘草次酸衍生物，具有式I所示的结构：

乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸

一种制备上述甘草次酸衍生物的方法，包括以下步骤：

(1)乙酰甘草次酸的合成：将甘草次酸溶解在二氯甲烷中，然后加入缚酸剂，在冰浴条件下缓慢滴加乙酰氯，然后室温搅拌反应8～24小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草次酸；所述缚酸剂为碳酸钾或三乙胺，所述缚酸剂的摩尔量为甘草次酸的1～2倍，所述乙酰氯的摩尔量为甘草次酸的5～10倍；

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：将步骤(1)中得到的乙酰甘草次酸溶解在二氯甲烷中，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；同时将聚乙二醇、二环己基碳二亚胺、二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，搅拌回流18～30小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇；其中，所述聚乙二醇的摩尔量为乙酰甘草次酸的1～1.25倍，所述二环己基碳二亚胺的摩尔量为乙酰甘草次酸的1～1.2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸的0.02～0.1倍；

(3)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向硬脂酰氯中加入二氯甲烷、二甲氨基吡啶、三乙胺；同时将乙酰甘草次酸-聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶，搅拌回流18～30小时，纯化，干燥，即得到上述甘草次酸衍生物；所述硬脂酰氯的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的1～2倍，所述三乙胺的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的1～2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇摩尔量的0.02～0.1倍。

步骤(2)所述聚乙二醇的摩尔量为乙酰甘草次酸的1.25倍。

步骤(2)所述的搅拌回流时间为24小时。

步骤(3)所述硬脂酰氯的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的2倍。

步骤(3)所述的搅拌回流时间为24小时。

所述的甘草次酸衍生物在制备甘草次酸受体介导的肝靶向脂质体中的应用。

本发明提供的两亲性化合物——乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)位于分子链一端的甘草次酸提供了肝实质细胞靶向性，聚乙二醇片段则为脂质体提供了长循环性，疏水性的硬脂酸长烷烃链则作为锚定片段***脂质体的脂双层中，能够赋予脂质体同时具备长循环和肝实质细胞靶向的性质，且易于***脂质体脂双层。

本发明将乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)作为构成脂质体的组分，其中，乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸占总脂质的摩尔百分含量为0.9％～27.5％，其余组分为磷脂或磷脂衍生物、胆固醇或胆固醇衍生物以及其他可构成脂质体的两亲性化合物。本发明含有AGA-PEG₂₀₀₀-ST的脂质体通过通用的技术包载化合物制备肝靶向长循环脂质体载体，所包载的化合物包括临床上应用的药物、诊断试剂、影像学造影剂、生物活性物质等，可包载其中单一化合物或它们的组合物，实现单独给药或联合给药或同时给药与示踪。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明先将甘草次酸的羟基进行保护，再依次与聚乙二醇、硬脂酸进行反应，产物比较单一，操作步骤简单易行，后处理方便，有利于工业化生产；

(2)本发明所使用的硬脂酸是动植物油脂的主要成分，廉价易得，安全性很高，作为疏水长链能很轻易***脂质体的脂双层中；而现有的技术以磷脂为***片段，则存在着合成、分离、纯化较繁琐、稳定性低以及原料昂贵的问题；

(3)本发明所合成的化合物中，甘草次酸和硬脂酸分别位于聚乙二醇的两端，有利于甘草次酸与肝细胞表面的甘草次酸受体相互作用，提高了靶向效率；

(4)本发明合成的肝靶向长循环隐形脂质体稳定性好，分散均匀集中，粒径均在100～200nm之间，能轻易躲过体内单核吞噬细胞***(MPS)的吞噬，而到达肝实质细胞；

(5)采用本发明提供的甘草次酸衍生物，与常规的脂质体组分一起，采取通用的制备方法可得到包载药物或造影剂或临床试剂的脂质体，合成的脂质体作为一种纳米药物载体，既可以单独给药，也可以联合给药，可用于临床上肝脏疾病的早期诊断、治疗、示踪、药效监测等。

附图说明

图1为乙酰甘草次酸的核磁共振图谱。

图2为乙酰甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀的核磁共振图谱。

图3为乙酰甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-硬脂酸的核磁共振图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，下列具体实施方式并非用于对本发明技术方案的限制。

下述实施例中所使用的聚乙二醇为市售聚乙二醇，标号分子量为2000。

实施例1

(1)乙酰甘草次酸的合成：称取10mmol的甘草次酸(GA)置于50mL的烧瓶中，加入10ml二氯甲烷(DCM)进行溶解；然后加入10mmol的碳酸钾(K₂CO₃)作为缚酸剂，放入磁子，接干燥管，在冰浴条件下缓慢滴加50mmol乙酰氯(AC)，然后室温下搅拌反应8h；反应结束后，过滤除去缚酸剂；然后加入等体积的冰水，充分振摇后静置分层，收集有机层——二氯甲烷(DCM)层溶液；将有机层依次用等体积的饱和食盐水、二次蒸馏水(DDI)各洗三次，以除掉部分溶解的缚酸剂；最后加入适量的无水硫酸镁进行干燥，常压过滤除去无水硫酸镁，收集滤液，将滤液减压旋干，油泵抽2h后，放入真空干燥箱干燥，即得到乙酰甘草次酸(AGA)。图1为乙酰甘草次酸的核磁共振图谱；其中，δ(ppm)＝5.71(s,1H,-CO-CH＝C，f)处为甘草次酸多元环上的不饱和双键峰，4.50(t,1H,-CO-O-CH,a)处的峰为与酯键相邻的甘草次酸环上的氢峰,δ(ppm)＝2.350(s,1H,e)，2.816(d,1H,b)，2.072(q,1H,c)，1.832(t,3H,d)，δ(ppm)＝0.684～1.624处的峰均为甘草次酸上的特征峰。

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：取4mmol步骤(1)中合成的乙酰甘草次酸(AGA)置于50ml烧瓶中，放入磁子，加入适量的二氯甲烷溶解，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；将4mmol聚乙二醇(PEG₂₀₀₀)、4mmol二环己基碳二亚胺(DCC)、0.4mmol二甲氨基吡啶(DMAP)一同溶解在少量的二氯甲烷(DCM)中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，油浴搅拌回流24小时，反应过程中用薄层色谱监测实验进程；反应结束后，首先用少量饱和食盐水洗三次，以除掉多余的二甲氨基吡啶(DMAP)；然后加入适量无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，收集滤液；滤液减压浓缩到2ml，在不断搅拌下，将浓缩液缓慢滴加到10倍体积量的冷***中，放入冰箱中静置沉降24小时后，过滤，收集固体物；将固体物用少量二氯甲烷溶解后用冷***沉降，重复该步骤，直至薄层层析检测无原料为止。将所得固体减压抽滤，常温油泵抽除溶剂2h后，真空干燥，即得到浅黄色粉末状乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)。图2为乙酰甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀的核磁共振图谱。其中，δ(ppm)＝5.71(s,1H,-CO-CH＝C，f)，δ(ppm)＝2.350(s,1H,e)，2.816(d,1H,b)2.072(q,1H,c)，1.832(t,3H,d)处的峰均为乙酰甘草次酸上的峰，这些峰均未消失。并且在δ(ppm)＝3.65(s,192H,-O-CH2-CH2-O)处出现一个新的强峰，为聚乙二醇链上的亚甲基氢峰。δ(ppm)＝4.240(-CO-O-CH,-CO-O-CH2-a)处的峰为与酯键相邻的甘草次酸环上的氢峰和与酯键直接相连的聚乙二醇上的亚甲基的氢峰，二者部分重合。

(3)硬脂酰氯的合成：称取2mmol硬脂酸置于50mL烧瓶中，加入3mL无水二氯亚砜(SOCl₂)，放入磁子，接回流冷凝管、干燥管；然后将烧瓶置于磁力搅拌器上，60℃油浴搅拌回流反应4小时；反应结束后，将反应液减压旋蒸1小时后再用油泵抽气1小时，以除掉未反应完全的二氯亚砜(SOCl₂)，烧瓶中剩余浅黄色固体即为制得的硬脂酰氯(STC)。

(4)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向步骤(3)反应生成的硬脂酰氯(STC)(也可由市售硬脂酰氯替代)中加入20ml二氯甲烷(DCM)、0.02mmol二甲氨基吡啶(DMAP)、1mmol三乙胺(Et₃N)；将1mmol乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)溶解在5ml二氯甲烷中后，冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶，油浴搅拌回流24小时后，将反应液过滤，除掉沉淀三乙胺盐酸盐(Et₃N·HCl)，然后用5ml0.1mol/L的稀盐酸洗三次，以除掉多余的三乙胺和二甲氨基吡啶，少量二次蒸馏水(DDI)洗至水相pH为中性，收集有机相；有机相溶液减压旋蒸浓缩后，边搅拌边缓慢滴加到8倍体积量的冰***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集滤出物；重复二氯甲烷溶解、***沉淀三次后，减压抽滤，油泵抽干后，放入真空干燥箱干燥，即得到浅黄色粉末状的乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)。图3为乙酰甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-硬脂酸的核磁共振图谱；其中，δ(ppm)＝5.70ppm(s,1H,-CO-CH＝C,f)处为甘草次酸多元环上的不饱和双键峰，δ(ppm)＝4.240(-CO-O-CH,-CO-O-CH₂-,a)处的峰为与酯键相邻的甘草次酸环上的氢峰和与酯键直接相连的聚乙二醇上的亚甲基的氢峰，δ(ppm)＝3.65(s,192H,-O-CH₂-CH₂-O)强峰，为聚乙二醇链上的亚甲基氢峰，这些特征峰都未消失。并且在δ(ppm)＝1.252(m,32H,-CH₂-CH₂-)处出现了强峰，是硬脂酸中亚甲基重复单元的峰，在δ(ppm)＝2.20(t,2H,-CH₂-CH₂-CO-O-)处的峰为与酯键相邻的硬脂酸上的氢峰，与甘草次酸酸上的e峰部分重合。

实施例2

(1)乙酰甘草次酸的合成：称取10mmol的甘草次酸(GA)置于50mL的烧瓶中，加入10ml二氯甲烷(DCM)进行溶解；然后加入10mmol三乙胺(Et₃N)作为缚酸剂，放入磁子，接干燥管，在冰浴条件下缓慢滴加60mmol的乙酰氯(AC)，然后室温搅拌反应16h；反应结束后，过滤除去缚酸剂，然后加入等体积的冰水，充分振摇后静置分层，收集有机相，有机相依次用等体积的饱和食盐水、二次蒸馏水(DDI)各洗三次，以除去部分溶解的缚酸剂，最后加入适量的无水硫酸镁进行干燥，常压过滤，收集滤液，将滤液减压旋干，油泵抽1.5h后，放入真空干燥箱干燥，即得到乙酰甘草次酸(AGA)。

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：取4mmol步骤(1)中合成的乙酰甘草次酸(AGA)于50ml烧瓶中，放入磁子，加入适量的二氯甲烷进行溶解，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；将5mmol的聚乙二醇(PEG₂₀₀₀)、4.8mmol二环己基碳二亚胺(DCC)、0.08mmol二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在二氯甲烷(DCM)中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，油浴搅拌回流18小时，反应过程中不断用薄层色谱监测实验进程；反应结束后，首先用少量饱和食盐水洗三次，以除掉多余的二甲氨基吡啶(DMAP)，然后加入适量无水硫酸镁进行干燥，过滤除去无水硫酸镁，收集滤液，滤液减压浓缩到1.5ml，在不断搅拌的情况下，缓慢滴加到8倍体积量的冷***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集固体物。重复少量二氯甲烷溶解、***沉降，直到薄层层析检测无原料点为止；将所得固体减压抽干，油泵抽2h后，真空干燥，即得到浅黄色粉末状乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)。

(3)硬脂酰氯的合成：称取1mmol硬脂酸置于50mL烧瓶中，加入3mL无水二氯亚砜(SOCl₂)，放入磁子，接回流冷凝管、干燥管。置于磁力搅拌器上，60℃油浴搅拌回流反应4小时。停止反应，将反应液减压旋蒸1小时后再用油泵抽气1小时，以除掉未反应完全的二氯亚砜(SOCl₂)，烧瓶中剩余浅黄色固体即为制得的硬脂酰氯(STC)。

(4)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向步骤(3)反应生成的硬脂酰氯(STC)中加入20ml二氯甲烷(DCM)、0.1mmol二甲氨基吡啶(DMAP)、1mmol三乙胺(Et₃N)；将1mmol乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)溶解在5ml二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶，油浴搅拌回流30小时后，将反应液过滤，除掉沉淀三乙胺盐酸盐(Et₃N.HCl)，然后用5ml0.1mol/L的稀盐酸洗三次，以除掉多余的三乙胺和二甲氨基吡啶，少量二次蒸馏水(DDI)洗至水相pH为中性，收集有机相；有机相溶液减压旋蒸浓缩后，边搅拌边缓慢滴加到10倍体积量的冰***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集滤出物；重复二氯甲烷溶解、***沉淀三次后，减压抽滤，油泵抽干后，放入真空干燥箱干燥，即得到浅黄色粉末状的乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)。

实施例3

(1)乙酰甘草次酸的合成：称取10mmol的甘草次酸(GA)溶解在10ml二氯甲烷(DCM)于50mL烧瓶中，加入20mmol的碳酸钾(K₂CO₃)作为缚酸剂，放入磁子，接干燥管，在冰浴条件下缓慢滴加100mmol的乙酰氯(AC)，然后室温搅拌反应24h；反应结束后，过滤除去缚酸剂，然后加入等体积的冰水，充分振摇后静置分层，收集二氯甲烷(DCM)层溶液，并依次用等体积的饱和食盐水、二次蒸馏水(DDI)各洗三次，以除去部分溶解的碳酸钾，最后加入适量的无水硫酸镁进行干燥，常压过滤，收集滤液，将滤液减压旋干，油泵抽1h后，放入真空干燥箱干燥，得到乙酰甘草次酸(AGA)。

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：取4mmol步骤(1)中合成的乙酰甘草次酸(AGA)于50ml烧瓶中，放入磁子，加入20ml二氯甲烷溶解，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；将4.5mmol的聚乙二醇(PEG₂₀₀₀)、4.5mmol二环己基碳二亚胺(DCC)、0.1mmol二甲氨基吡啶(DMAP)一同溶解在二氯甲烷中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，油浴搅拌回流30小时，反应过程中不断用薄层色谱监测实验进程；反应结束后，首先用少量饱和食盐水洗三次，以除掉多余的二甲氨基吡啶(DMAP)，然后加入适量无水硫酸镁进行干燥，然后过滤除去无水硫酸镁，收集滤液，将滤液减压浓缩到1ml；然后在不断搅拌的条件下，将滤液浓缩液缓慢滴加到10倍体积量的冷***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集固体物；重复少量二氯甲烷溶解、***沉降，直到薄层层析检测无原料点为止；将所得固体减压抽干，油泵抽2h后，真空干燥，即得到浅黄色粉末状乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)。

(3)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向2mmol硬脂酰氯(STC)(市售，阿拉丁)中加入20ml二氯甲烷(DCM)、0.08mmol二甲氨基吡啶(DMAP)、2mmol三乙胺(Et₃N)；将1mmol乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)溶解在5ml二氯甲烷中，冰浴条件下将其缓慢滴入烧瓶中，油浴搅拌回流18小时后，将反应液过滤，除掉沉淀三乙胺盐酸盐(Et₃N.HCl)，然后用5ml0.1mol/L的稀盐酸洗三次，以除掉多余的三乙胺和二甲氨基吡啶，少量二次蒸馏水(DDI)洗至水相pH为中性，收集有机相。有机相溶液减压旋蒸浓缩后，边搅拌边缓慢滴加到6倍体积量的冰***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集滤出物；重复二氯甲烷溶解、***沉淀三次后，减压抽滤，油泵抽干后，放入真空干燥箱干燥。得到浅黄色粉末，即为乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)。

实施例4

(1)乙酰甘草次酸的合成：称取10mmol的甘草次酸(GA)溶解在10ml二氯甲烷(DCM)于50mL烧瓶中，加入15mmol三乙胺(Et₃N)作为缚酸剂，放入磁子，接干燥管，在冰浴条件下缓慢滴加80mmol的乙酰氯(AC)，然后室温搅拌反应16h；反应结束后，过滤除去缚酸剂，然后加入等体积的冰水，充分振摇后静置分层，收集二氯甲烷(DCM)层溶液，并依次用等体积的饱和食盐水、二次蒸馏水(DDI)各洗三次，以除去部分溶解缚酸剂，最后加入适量的无水硫酸镁干燥，常压过滤，收集滤液，将滤液减压旋干，油泵抽1.5h后，放入真空干燥箱干燥，即得到乙酰甘草次酸(AGA)。

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：取4mmol步骤(1)中合成的乙酰甘草次酸(AGA)于50ml烧瓶中，放入磁子，加入适量的二氯甲烷进行溶解，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；将4.3mmol的聚乙二醇(PEG₂₀₀₀)、4.6mmol二环己基碳二亚胺(DCC)、0.2mmol二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在二氯甲烷(DCM)中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，油浴搅拌回流24小时，反应过程中不断用薄层色谱监测实验进程；反应结束后，首先用少量饱和食盐水洗三次，以除掉多余的二甲氨基吡啶(DMAP)，然后加入适量无水硫酸镁进行干燥，过滤除去无水硫酸镁，收集滤液，滤液减压浓缩到1.5ml，在不断搅拌的情况下，缓慢滴加到8倍体积量的冷***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集固体物。重复少量二氯甲烷溶解、***沉降，直到薄层层析检测无原料点为止；将所得固体减压抽干，油泵抽2h后，真空干燥，即得到浅黄色粉末状乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)。

(3)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向2mmol硬脂酰氯(STC，阿拉丁)中加入20ml二氯甲烷(DCM)、0.05mmol二甲氨基吡啶(DMAP)、1.5mmol三乙胺(Et₃N)；将1mmol乙酰甘草次酸-聚乙二醇(AGA–PEG₂₀₀₀)溶解在5ml二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶，油浴搅拌回流30小时后，将反应液过滤，除掉沉淀三乙胺盐酸盐(Et₃N.HCl)，然后用5ml0.1mol/L的稀盐酸洗三次，以除掉多余的三乙胺和二甲氨基吡啶，少量二次蒸馏水(DDI)洗至水相pH为中性，收集有机相；有机相溶液减压旋蒸浓缩后，边搅拌边缓慢滴加到10倍体积量的冰***中，放入冰箱中静置冷藏沉降24小时后，冷过滤，收集滤出物；重复二氯甲烷溶解、***沉淀三次后，减压抽滤，油泵抽干后，放入真空干燥箱干燥，即得到浅黄色粉末状的乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸(AGA-PEG₂₀₀₀-ST)。

实施例5：传统脂质体的制备(对照试验)

称取卵磷脂(PC)20mg和胆固醇(CHO)2mg，用2ml氯仿和无水乙醇的混合溶液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃水浴真空旋转蒸干，并在40℃下真空干燥6小时以除去残留溶剂，得到均一分散的脂质薄膜；向其中加入5mL空白Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转水合2h后，将所得脂质体液通过高压挤出器用氮气挤出，在此过程中，多室脂质体混悬液依次经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别挤出10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为161.2nm～165.6nm，粒径分布蛋白质分散指数(PDI)为0.219～0.224。

实施例6：含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的肝靶向长循环脂质体的制备

(1)称取卵磷脂(PC)20mg、胆固醇(CHO)2mg和乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸7.2mg，用2ml氯仿和无水乙醇的混合溶液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃真空旋转蒸发以得到均匀分散的脂质体薄膜；然后向其中加入5mL空白Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转水合1h～2h后，将所得脂质体液通过高压挤出器用氮气压滤，在此过程中，多室脂质体混悬液依次经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别挤出10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为137.4nm～139.9nm，粒径分布PDI为0.095～0.133。

(2)称取卵磷脂(PC)20mg、胆固醇(CHO)2mg和乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸0.72mg，用2ml氯仿和无水乙醇的混合溶液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃真空旋转蒸发以得到均匀分散的脂质体薄膜；然后向其中加入5mL空白Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转水合1h～2h后，将所得脂质体液通过高压挤出器用氮气压滤，在此过程中，多室脂质体混悬液经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别压滤10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为156.2nm～161.6nm，粒径分布PDI为0.209～0.214。

(3)称取卵磷脂(PC)20mg和胆固醇(CHO)2mg、乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸21.6mg，用2ml氯仿和无水乙醇的混合溶液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃真空旋转蒸发以得到均匀分散的脂质体薄膜；然后向其中加入5mL空白Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转水合1h～2h后，将所得脂质体液通过高压挤出器用氮气压滤，在此过程中，多室脂质体混悬液依次经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别挤出10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为170.3nm～173.6nm，粒径分布PDI为0.210～0.223。

实施例7：长循环阴离子脂质体制备(对照试验)

为了更好地包载阳离子亲水药物，如顺铂、基因、蛋白质等带有正电荷的大分子，本发明还引入了5-胆甾烯-3β-琥珀酸单酯(CHO-HS)。

具体制法如下：称取硬脂酸-聚乙二醇单甲醚5.93mg、卵磷脂(PC)20mg和5-胆甾烯-3β-琥珀酸单酯2.5mg，用氯仿和无水乙醇的混合液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃真空旋转蒸发以得到均匀分散的脂质体薄膜；然后向其中加入5mLTris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转充分水合，将所得脂质体液体通过高压挤出器用氮气挤出，在此过程中，多室脂质体混悬液经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别挤出10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为164.8nm～167.1nm，粒径分布PDI为0.179～0.186。

实施例8：含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的肝靶向长循环阴离子脂质体制备

称取甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸7.2mg、磷脂20mg、5-胆甾烯-3β-琥珀酸单酯2.5mg，用氯仿和无水乙醇的混合液(1：1)溶解在250ml茄形瓶中，将溶液以每分钟40转的速度在35℃真空旋转蒸发以得到均匀分散的脂质薄膜；然后向其中加入5mL Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，并在55℃水浴中，以每分钟120转的速度常压旋转充分水合，将所得脂质体液体通过高压挤出器用氮气挤出，在此过程中，多室脂质体混悬液依次经过一系列孔径为800nm、450nm、220nm的滤膜分别挤出10次后，粒径大小分布变得更均一集中。得到的脂质体的粒径为147.9nm～149.3nm，粒径分布PDI为0.156～0.164。

实施例9

为了研究含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸脂质体的肝靶向性，将不含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的脂质体(记作mPEG-ST lipos)和含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的脂质体(记作AGA-PEG₂₀₀₀-ST lipos)分别包载模型药物——钙黄绿素(以游离的钙黄绿素溶液为对照)，然后将它们分别与HepG2细胞和A549细胞共同孵育8h，钙黄绿素的最终浓度为2μg/mL。然后用PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液漂洗细胞3次，以除去未被细胞摄取的钙黄绿素脂质体；用4％多聚甲醛溶液在室温下避光固定15min后，用PBS缓冲液漂洗3次。用Hoechst33258(5μg/mL)在37℃下对细胞核染色10min后用PBS缓冲液再漂洗3次。通过共聚焦荧光显微镜对处理好的共聚焦培养皿进行观察。结果显示，经载有钙黄绿素的AGA-PEG₂₀₀₀-ST lipos作用后的HepG2细胞的荧光强度明显强于载有钙黄绿素的mPEG-STlipos作用后的HepG2细胞的荧光强度；而对于A549细胞，二者的荧光强度没有明显差别。实施例10

为了更进一步的研究细胞对包载有钙黄绿素脂质体的内吞作用，将不含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的脂质体(记作mPEG-ST lipos)和含有乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的脂质体(记作AGA-PEG₂₀₀₀-ST lipos)分别包载模型药物——钙黄绿素，将它们分别与HepG2细胞和A549细胞共同孵育8h(空白细胞作为对照)，钙黄绿素的最终浓度为2μg/mL。然后吸出培养液，用PBS(0.01M，pH＝7.4)缓冲液清洗培养板三遍后，加入胰蛋白酶消化使细胞脱壁，用不含血清的培养基终止消化，消化液转移到离心管中短时低速离心，然后用PBS离心洗涤两遍，并用500μL PBS重悬，使用流式细胞分析仪进行检测，测试前要将细胞吹打均匀。对于HepG2细胞：空白细胞的荧光吸收强度为1.32％，经包载钙黄绿素的mPEG-ST lipos作用后的细胞荧光吸收强度为1.88％，经包载钙黄绿素的AGA-PEG₂₀₀₀-ST lipos作用后的细胞荧光吸收强度为20％。对于A549细胞：空白细胞的荧光吸收强度为11.5％，经包载钙黄绿素的mPEG-ST lipos作用后的细胞荧光吸收强度为28.9％，经包载钙黄绿素的AGA-PEG₂₀₀₀-STlipos作用后的细胞荧光吸收强度为35.0％。

Claims (7)

1.一种甘草次酸衍生物，其特征在于，具有式I所示的结构：

2.一种制备权利要求1所述的甘草次酸衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乙酰甘草次酸的合成：将甘草次酸溶解在二氯甲烷中，然后加入缚酸剂，在冰浴条件下缓慢滴加乙酰氯，然后室温搅拌反应8～24小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草次酸；所述缚酸剂为碳酸钾或三乙胺，所述缚酸剂的摩尔量为甘草次酸的1～2倍，所述乙酰氯的摩尔量为甘草次酸的5～10倍；

(2)乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：将步骤(1)中得到的乙酰甘草次酸溶解在二氯甲烷中，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；同时将聚乙二醇、二环己基碳二亚胺、二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，搅拌回流18～30小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇；其中，所述聚乙二醇的摩尔量为乙酰甘草次酸的1～1.25倍，所述二环己基碳二亚胺的摩尔量为乙酰甘草次酸的1～1.2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸的0.02～0.1倍；

(3)乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向硬脂酰氯中加入二氯甲烷、二甲氨基吡啶、三乙胺；同时将乙酰甘草次酸-聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶，搅拌回流18～30小时，纯化，干燥，即得到上述甘草次酸衍生物；所述硬脂酰氯的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的1～2倍，所述三乙胺的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的1～2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇摩尔量的0.02～0.1倍。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述聚乙二醇的摩尔量为乙酰甘草次酸的1.25倍。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的搅拌回流时间为24小时。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述硬脂酰氯的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的2倍。

6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的搅拌回流时间为24小时。

7.权利要求1所述的甘草次酸衍生物在制备甘草次酸受体介导的肝靶向脂质体中的应用。