CN104042612A - 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含位于微胶囊内的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂的微胶囊，以及包含所述微胶囊的医药组合物和试剂盒。还公开了用于治疗或预防受试对象的年龄相关性疾病、病症或紊乱的方法，其涉及对受试对象施用医药有效量的微胶囊，所述微胶囊包含位于微胶囊内的mTOR抑制剂。

Description

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制

本申请是申请日为2009年11月11日、发明名称为“哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制”的中国专利申请200980154352.X的分案申请。

本申请主张于2008年11月11日提交的美国临时专利申请第61/113,481号之申请日的权益，其内容以全文引用的方式并入本文。

根据美国国家卫生署(National Institutes of Health)的资金号AG029729和AG022307，美国政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明一般涉及药理学以及年龄相关性紊乱的治疗和预防领域。更具体地说，本发明涉及包含哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂的微胶囊，以及在受试对象中使用本发明的微胶囊来治疗或预防年龄相关性疾病、紊乱和病症的方法。

背景技术

因为在发达国家中大多数死亡是由发病率随年龄增长而迅速升高的疾病引起的，所以延缓衰老的干预措施远比预防措施更有益于人体健康，预防措施只对特定的晚年疾病有作用，例如心脏病、癌症或糖尿病。目前对用于延缓衰老和延长寿命的膳食添加剂的研发有着浓厚的兴趣。

mTOR和癌症.哺乳动物TOR是在与癌症相关联的失调的信号传导路径中的关键效应分子(Guertin和Sabatini,2007；Shaw和Cantley,2006)。tsc1或tsc2基因中的突变导致错构瘤性综合症结节硬化症(TSC)，表明在mTOR和癌症之间存在分子联系。mTORC1是癌症中两个主信号传导路径(Ras和PI3K)所共有的唯一所知的下游效应分子，同时也与营养信号传导相整合从而用于调节细胞生长(质量)(Shaw和Cantley,2006)。超活化AKT信号传导很可能通过mTOR来调节致癌性转化(Skeen等人,2006)。

已经表明，一种主要mTORC1效应分子，S6激酶1(S6K1)，调节有害效应，例如胰岛素抵抗和II型糖尿病(Patti和Kahn,2004；Tremblay等人,2005b；Tremblay等人,2005c；Um等人,2006)。与野生型相比，S6K1缺陷型小鼠显示了降低的生长速率，包括因细胞较小而引起的白色脂肪组织(WAT)较少(Shima等人,1998)。有趣的是，S6K1缺陷型小鼠的表型包括低胰岛素血症，同时胰岛素敏感性增加(Um等人,2004)。因为脂肪分解和代谢速率提高，所以这些小鼠显示不容易发生因饮食引起的肥胖(Um等人,2004)。在S6K1功能缺陷型肌细胞中，AMP和无机磷酸盐增加，而包括线粒体生物合成和脂肪酸氧化的活化AMPK和AMPK依赖性功能也随之增加(Aguilar等人,2007)。与此反应相对应的，细胞中脂质含量也随之降低。

雷帕霉素已被证实作为脂肪细胞分化(这是一种被高FK506浓度逆转的效应)的有效抑制物，表明了由亲免蛋白-雷帕霉素复合物所调节的有效的抑制作用(Yeh等人,1995)。已经提出了一种用于证明mTOR和其激酶活性在3T3-L1前脂肪细胞分化中的关键作用的模型，其中mTOR路径和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt路径在脂肪生成过程中分别通过调控营养有效性和胰岛素信号来平行地发挥功能(Kim和Chen,2004)。

因此，对于年龄相关疾病的更有效的治疗方法存在需求，同时也有必要对可延长寿命并延缓年龄相关疾病出现的药剂有更深的了解。

发明内容

本发明是部分基于以下发现，即通过用被胶囊化的制剂形式的mTOR抑制剂制剂长期阻断营养物感应和生长因子应答路径中被称为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的重要蛋白复合物，可在包括人在内的哺乳动物中实现与食物和/或生长因子限制类似的生理状态，其与延迟衰老和降低年龄相关性疾病的发病率有关。例如，发明人已经发现用微胶囊化的雷帕霉素对晚年的遗传异质小鼠进行喂养可以延长其寿命。此外，还发现微胶囊化的雷帕霉素可以使阿尔茨海默病(Alzheimer disease)小鼠模型恢复认知并使病理减弱。与未胶囊化的制剂相比，微胶囊化可以提高治疗功效。通过改善几种主要的年龄依赖性疾病，mTOR的长期抑制可被应用于提高包括成年人在内的个体的健康和康乐，从而提高生命中生育年龄的质量和数量，同时提供显著的经济效益。

本发明的一些实施方案涉及微胶囊，其包含含有mTOR抑制剂的核心组分，其中该核心组分裹有包衣。mTOR抑制剂可以是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)的抑制剂或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)的抑制剂。在具体的实施方案中，包衣在受试对象的肠道中提供mTOR抑制剂的延缓释放和/或治疗剂的优先释放(即肠溶衣)。肠溶衣可以是所属领域技术人员所知的任何此类包衣。所述包衣的非限制性实例包括Eudragit S100、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)或甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物。在一些具体的实施方案中，包衣包含EudragitS100。包衣可包含Eudragit S100、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)或甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物中一种或多种的混合物。

本文所使用的术语“微胶囊”被定义为用于将治疗剂递送至受试对象的运载体，其包含一个或多个核心，其中所述核心被包裹在上文所描述的包衣中。在具体的实施方案中，微胶囊包含包裹于包衣中的单核心。在进一步的实施方案中，微胶囊包含多个被包裹于包衣中的核心，其中周围具有包衣的核心聚集在一起，从而形成单药物递送结构。核心可以是固体或可以是液体，且其状态取决于环境温度。

微胶囊可以是任何大小或形状。基本的几何形状可以是例如球体、棒状、圆柱体、立方体、长方体、棱柱体、棱锥体、圆锥体、截锥体和截棱锥。此外，星形挤出物、十字挤出物、肋状挤出物和三叶形也是合适的。诸如纳入管的空腔可纳入微胶囊中。

微胶囊可以是规则形状或不规则形状。微胶囊的表面可以是平滑的、不平的或锯齿状的。微胶囊可以是无定形的、球形的或针形的，这取决于相应的制造方法。微胶囊可使用所属领域技术人员所知的任何方法来形成。此类方法的非限制性实例将在下文中更详细地讨论。在包含微胶囊的单一剂量中，微胶囊可以是均匀的大小和形状，或变化的大小和形状。

微胶囊可以是任何大小。例如，微胶囊的最大直径可以是约100nm、1μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5mm、1.0cm或以上，或从上述最大直径内可推导出的任何最大直径范围。例如，微胶囊的最大直径的范围可以是约100nm到约1.0cm。在更具体的实施方案中，平均直径的范围是约100μm到约1mm。在其它实施方案中，平均直径的范围是约100μm到约0.1mm。

按重量计算(w/w)，微胶囊可包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或以上的mTOR抑制剂。

mTOR抑制剂可以是雷帕霉素或雷帕霉素类似物。在具体的实施方案中，mTOR抑制剂是雷帕霉素。在更具体的实施方案中，mTORC1是雷帕霉素且包衣是Eudragit S100。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTOR激酶的竞争性抑制剂。这些mTOR抑制剂与mTOR激酶直接相互作用且不依赖于细胞内受体，如FKBP12。

所属领域技术人员所知的任何雷帕霉素类似物都被考虑包含于本发明的微胶囊中。雷帕霉素类似物的非限制性实例包括依维莫司(everolimus)、他克莫司(tacrolimus)、CCI-779、ABT-578、AP-23675、AP-23573、AP-23841、7-表-雷帕霉素、7-硫甲基-雷帕霉素、7-表-三甲氧基苯基-雷帕霉素、7-表-硫甲基-雷帕霉素、7-去甲氧基-雷帕霉素、32-去甲氧基-雷帕霉素、2-去甲基-雷帕霉素或42-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素。以下说明书讨论了雷帕霉素类似物的许多其它实例。本发明的微胶囊可包含雷帕霉素和一种或多种雷帕霉素类似物，或可包含一种以上的雷帕霉素类似物。

在一些实施方案中，本发明的微胶囊包含一种或多种医药或保健药剂。此类药剂的非限制性实例包括维生素、中草药剂(例如银杏叶或绿茶)、鱼油(Ω3脂肪酸)、抗菌剂、抗氧化剂、药物或消炎剂。例如，核心组分可包含第二化合物，该第二化合物是维生素E、维生素A、抗菌抗生素、抗氧化剂、L-肉碱、硫辛酸、二甲双胍、白藜芦醇、勒帕茄碱(leptine)、非类固醇消炎药、COX抑制剂、维生素D、矿物质(如镁、钙、锌或钾)、微量元素(如钼或碘)、类胡萝卜素(如维生素A)、酶(如脂肪酶或淀粉酶)或氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、牛磺酸或脯氨酸)。药物可以是已知或疑似对治疗或预防年龄相关疾病、紊乱或病症有效的药剂。例如，此药物可以是已知或疑似对治疗或预防神经退行性疾病、记忆丧失、葡萄糖代谢异常或癌症有效的药剂。以下说明书中讨论此类药剂的非限制性实例。本文阐述的微胶囊的核心和/或包衣可包含一种或多种的辅助物质，如载剂、粘合剂以及所属领域技术人员所熟知的类似物。

在一些实施方案中，微胶囊主要由包含雷帕霉素或雷帕霉素类似物的核心组分组成，其中核心组分被包裹于包衣中。此包衣可以是上文所讨论的任何包衣，且雷帕霉素类似物可以是上文所讨论的任何雷帕霉素类似物。包衣的非限制性实例包含Eudragit S100、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)或甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物。在具体的实施方案中，包衣是Eudragit S100。在更为具体的实施方案中，包衣是EudragitS100且核心包含雷帕霉素。微胶囊可包含上文所讨论的一种或多种的辅助物质。

除了一种或多种的mTOR抑制剂之外，核心还可包含一种或多种的附加组分。例如，核心可包含选自包括甘露醇、乳糖、微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、预胶化淀粉、山梨醇或其混合物的组的稀释剂。核心可包含崩解剂，如羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、淀粉或其混合物。核心可包含粘合剂，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素或其混合物。核心可包含润滑剂，如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂富马酸钠、滑石粉、胶体二氧化硅或其混合物。

本发明的其它实施方案涉及用于治疗或预防年龄相关性疾病、病症或紊乱的医药或保健组合物，其包含微胶囊，该微胶囊包含含有mTOR抑制剂的核心组分，其中此核心组分被包裹于包衣中。微胶囊可以是本发明的任何微胶囊。本文所阐述的医药组合物可包含一种或多种药学上可接受的药剂，其中许多药剂都是所属领域技术人员所熟知的。

在一些实施方案中，微胶囊与可食用物质一起配制。可食用物质可以是食物或食物添加剂。组合物可任选地包含一种或多种用于治疗或预防任何疾病、紊乱或健康相关性病症的附加药剂。例如，疾病可以是年龄相关性疾病，如神经退行性疾病、葡萄糖代谢异常或癌症。组合物可与一种或多种的保健药剂一起配制，其中许多药剂是所属领域技术人员所熟知的。例如，保健药剂可以是维生素、营养增补剂或源于药草或植物的药剂，它们是已知或疑似对促进受试对象的健康和康乐有益的。

本发明还涉及用于在受试对象中治疗或预防年龄相关性疾病、病症或紊乱的方法，其涉及对受试对象施用医药有效量的本发明的微胶囊。本发明还涉及本发明的微胶囊在受试对象中治疗或预防年龄相关性疾病、病症或紊乱中的用途。受试对象可以是任何受试对象，如哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、绵羊、马、山羊、灵长类动物和人。在具体的实施方案中，受试对象是人。人可以是已知或疑似患有年龄相关性疾病的人。在一些实施方案中，人是年龄大于50岁、大于55岁、大于60岁、大于65岁、大于70岁、大于75岁或大于80岁的人。

年龄相关性疾病、病症或紊乱可以是发病率随着年龄增长而升高的任何疾病、病症或紊乱。年龄相关性疾病的非限制性实例包括神经退行性疾病、与葡萄糖代谢异常相关的疾病、以及癌症。关于癌症，非限制性实例包括乳腺癌、肺癌、***癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、***、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。神经退行性疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化病(ALS)、早老性痴呆、老年性痴呆、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)和与衰老有关的记忆力丧失。

考虑使用本发明的微胶囊来治疗或预防的年龄相关性疾病、病症或紊乱的其它实例包括胰岛素抵抗、良性***增生症、听力丧失、骨质疏松、年龄相关性黄斑变性、皮肤病或皮肤老化、皮肤病、皮肤老化、肌肉减少症、心血管疾病、脂质/碳水化合物代谢、癌症和免疫疾病。可施用本文阐述的微胶囊以延长寿命、提高生活质量、降低氧化性损伤和细胞衰老的风险。

受试对象可患有已经存在的年龄相关性疾病、病症或紊乱，或者受试对象可处于患上年龄相关性疾病、病症或紊乱的风险。处于风险的受试对象可以是因以前患有年龄相关性疾病、病症或紊乱而接受过治疗的受试对象，其中疾病、病症或紊乱以前已被成功治疗。受试对象可因为其它风险因素而处于危险，如遗传风险因素或环境风险因素。

本发明还涉及一种延长哺乳动物受试对象寿命的方法，其涉及对受试对象施用有效量的本发明的微胶囊，其中寿命将得到延长。本文所使用的延长寿命是指受试对象的寿命将比在没有本发明的微胶囊的情况下生存的受试对象的寿命更长。在没有所述微胶囊的情况下生存的受试对象寿命的估算值可以通过以下途径得到，例如人口学研究、社会保障局寿命表和关于寿命的科学文献。本发明进一步涉及在哺乳动物受试对象中减轻年龄相关性认知衰退的方法，其涉及对受试对象施用有效量的本发明的微胶囊，其中年龄相关性认知衰退得到减轻。年龄相关性认知衰退的减轻可通过对受试对象的认知与从一个或一个以上对照受试对象所获得的已知认知指数进行对比而进行评估。

微胶囊可使用所属领域技术人员所知的任何方法来施用。给药途径的非限制性实例包括口服、通过鼻胃管、经直肠、腹膜内、局部、皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、通过灌洗和鞘内给药。在一些实施方案中，微胶囊是通过将微胶囊与包含可食用物质的组合物组合来进行施用的。

微胶囊所施用的剂量可由医师使用所属领域技术人员所知的任何方法来确定。在一些实施方案中，mTOR抑制剂的剂量是受试对象每千克体重中约1微克至约100毫克。关于给药方案的其它信息在以下说明书进行了讨论。

本发明的其它方面涉及制备包含mTOR抑制剂的微胶囊的方法，其涉及将药物包衣施加于包含mTOR抑制剂的核心颗粒，其中核心颗粒被包衣所包裹。包衣可以是肠溶衣。包衣可以是上文和本说明书其它地方所讨论的任何包衣。在具体的实施方案中，包衣是Eudragit S100。

所属领域技术人员所知的任何方法都可以用于将包衣施加于颗粒。在具体的实施方案中，施加肠溶衣涉及使用旋转盘雾化器，其它方法可包括锅包衣法、空气悬浮包衣法、离心挤出法、振荡喷管法、喷雾干燥法、界面聚合法、原位聚合法和基质聚合法。

本发明的其它方面涉及试剂盒，其包含含有一个或多个的本发明微胶囊的第一密封容器。试剂盒可包含含有本发明的任何微胶囊的第一密封容器。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含本发明的微胶囊的使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含第二化合物。该第二化合物可被包含于第一密封容器中，或可被单独包含于例如第二密封容器中。

应理解上述公开内容强调了本发明的一些具体的实施方案，且与其等同的所有修饰或替代处于如随附权利要求书中所阐述的本发明精神和范围之内。本文所引用的所有参考文献以全文引用的方式并入以用于所有目的。

应专门考虑到，所讨论的关于本发明的一个实施方案的任何限制可适用于本发明的任何其它实施方案。此外，本发明的任何组合物可被用于本发明的任何方法中，并且本发明中的任何方法可被用于制造或使用本发明的任何组合物。

除非明确地说明仅指选择对象或选择对象是相互排斥的，否则权利要求书中的术语“或”是用来表示“和/或”的意思，但本公开书也支持仅指选择对象和“和/或”的定义。

在本申请中，术语“约”被用于说明数值包括用于确定此数值的装置和/或方法的误差的标准偏差。

除非另外明确地说明，否则本说明书所使用的“一(a或an)”可表示一个(种)或多个(种)的意思。当与单词“包含”结合使用时，本文权利要求中所使用的单词“一”可表示一个(种)或多个(种)的意思。本文所使用的“另一个”可表示至少第二个或更多。

本文中的医疗装置、灌流***和试剂盒中任何一个的任何实施方案都可由或基本上由所描述的特征和/或步骤组成，而不是包含/包括/含有/具有所描述的特征和/或步骤。因此，在任何权利要求中，术语“由……组成”或“基本上由……组成”可用于替代上文所引用的任何开放式系动词，以便改变另外使用开放式系动词的指定权利要求的范围。

根据以下具体实施方式，本发明的其它目的、特征和优势将会变得明显。但是，应该了解到，表明本发明的优选实施方案的具体实施方式和具体实施例仅通过图解的方式在文中提供，因为在本发明的精神和范围之内的各种改动和修饰会通过此具体实施方式而使所属领域技术人员觉得浅显易懂。

附图说明

下列附图构成了本说明书的一部分，且用于进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文所提供的具体实施方式的详细描述而更好地得到理解。

图1.雄性(左)和雌性(右)小鼠的生存曲线，其将对照小鼠与那些用依那普利、CAPE或雷帕霉素喂养的小鼠进行对比，其中三个试验场的结果汇合到一起。依那普利和CAPE在4月龄时被加进食物中，雷帕霉素在20月龄时被加进食物中。P值通过对数秩检验来进行计算。

图2.雄性和雌性小鼠的生存曲线，其将对照小鼠与那些在600日龄开始喂食雷帕霉素食物的小鼠进行对比，三个试验场的结果汇合到一起。P值通过对数秩检验来进行计算。由于技术原因，对照小鼠的4％和分配雷帕霉素的小鼠的3％从实验中移除。在雷帕霉素治疗开始600天后，仅有5只动物(三只对照，两只雷帕霉素)被移除。因此，在检查中各组之间没有显著差异。

图3.三个试验场中单独每一个的雄性和雌性对照小鼠和用雷帕霉素治疗的小鼠的存活率。P值代表对数秩计算的结果。在600日龄处的垂直线说明在此年龄小鼠首次接触雷帕霉素。

图4A、4B、4C.从270日龄开始接受雷帕霉素的小鼠的表征。A，雄性和雌性小鼠的生存曲线，其将对照小鼠与单独(群组2006)群体中用雷帕霉素治疗的小鼠进行对比，其中从270日龄开始小鼠用雷帕霉素进行治疗。因为在中期分析时所有活小鼠的年龄都介于800日龄与995日龄之间，所以关于年龄在900天以上的小鼠的生存曲线的形状只有有限的信息，且在最大年龄时(>990天)斜率的显著改变反映了该实验的不确定性。P值通过对数秩检验进行计算。B，从750日龄到880日龄的雄性和雌性小鼠获得的内脏脂肪垫中，雷帕霉素食物对mTOR效应分子的影响。在组织裂解液中对核糖体亚单位蛋白S6(rpS6)以及其磷酸化状态(P-rpS6，双箭头)进行了免疫分析，所述组织裂解液由食用了含有微胶囊化的雷帕霉素的食物或对照食物的小鼠制备而来。所使用的抗体在左边显示。P-rpS6/rpS6的强度值比率显示在雌性和雄性小鼠的曲线图中。Pan-actin也在印迹中进行了免疫分析，从而提供每条泳道中蛋白质负荷的指示。C，在750日龄至880日龄的雄性和雌性小鼠中的全血雷帕霉素含量。在B和C中，误差线显示了平均值的标准误差。

图5.白色脂肪组织中减少的P-rpS6(Ser240/244)。

图6.肝中减少的P-rpS6(Ser240/244)。

图7.在大脑中对于P-rpS6(Ser240/244)无可检测到的作用。

图8.雄性小鼠白色脂肪组织中4E-BP1的增加。

图9.在肝中对于4E-BP1无可检测到的作用。

图10.雄性小鼠白色脂肪组织中Akt的活化。

图11.雄性小鼠肝中Akt的活化。

图12.大脑中Akt的活化。

图13.食物中雷帕霉素的稳定性。

图14.雷帕霉素的胶囊化可以提高其在实验室食物中的稳定性。将7ppm雷帕霉素添加到商业上制备的实验室食物中，然后分析食物中的雷帕霉素含量。雷帕霉素水平比预期的要低，暗示雷帕霉素在食物制备或储存过程中发生了降解(空心柱体)。雷帕霉素的微胶囊化作用可以减少其降解(阴影柱体)。

图15.在用含有胶囊化或未胶囊化的雷帕霉素的食物进行喂养后，全血中可以检测到雷帕霉素。用胶囊化和未胶囊化的雷帕霉素(7ppm)对小鼠喂养3周，并分析血液中的雷帕霉素水平。胶囊化作用导致血液中的雷帕霉素水平显著地高于使用未胶囊化的雷帕霉素时所观测到的水平。

图16.微胶囊化作用。

图17.血液中的雷帕霉素水平。

图18.在限制热量的小鼠中mTOR信号传导的减少。

图19.雷帕霉素对体重没有作用。

图20.雷帕霉素减弱了在一般运动活动中的年龄相关性衰退。

图21.在从9月龄时开始喂食雷帕霉素的小鼠中，对肥胖无显著影响。

图22.热量限制对寿命的影响。

图23.内脏脂肪垫P-Ser473Akt分析：20个月的治疗。

图24.腓肠肌P-Ser473Akt分析。

图25.高脂肪食物喂养12周，有或无雷帕霉素对小鼠的体重没有差异。

图26.雷帕霉素导致了在用高脂肪食物喂养的HET3小鼠中葡萄糖耐受不良。

图27.增加饮食脂肪或热量对雷帕霉素对于葡萄糖代谢的作用的影响。

图28A、28B、28C、28D.雷帕霉素消除在3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠AD模型中的记忆缺陷。A和C：相对于对照喂食Tg组，喂食雷帕霉素的3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠到达隐藏平台的平均等待时间得到显著降低(分别是*P＜0.004和*P＝0.036)。在hAPP(J20)和3xTg-AD两组中学***台位置的记忆被削弱[P＜0.01和P＜0.001，在单向ANOVA中Tukey多重对比检验被应用于基因型的显著效应(分别是P＝0.01和P＜0.0001)]，但是喂食雷帕霉素的3xTg-AD和hAPP(J20)动物的非Tg组没有显著差异。数据是平均值+SEM。

图29A、29B、30C、29D、29E、29F、29G、29H、29I.雷帕霉素降低了Aβ₄₂水平和沉积。A和B：分别从3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠大脑中所提取的蛋白质的代表性Western印迹。C、D和E：APP、C99和C83的定量分析(以β-肌动蛋白水平校准)显示出雷帕霉素对两个转基因株系中的APP加工无显著影响。F和G：ELISA测量表明雷帕霉素没有改变3xTg-AD(F；P＝0.89)或hAPP(J20)(G；P＝0.29)小鼠大脑中的As40水平。相比之下，雷帕霉素显著地降低了3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠中可溶性As42的水平(P值分别是0.02和0.04)。H和I：代表性显微照片，描绘了被抗As42抗体所感染的3xTg-AD小鼠的CA1锥体神经元。统计评估通过使用双尾非配对学生t检验来进行。

图30A、30B、30C、30D、30E、30F、30G、30H、30I.雷帕霉素的施用显著地减轻了3xTg-AD小鼠中的τ病理表现(tau pathology)。A和B：被抗τ抗体AT270(其可识别在Thr181经磷酸化的τ)所染色的CA1锥体神经元的代表性显微照片，明确地表明了用雷帕霉素治疗的小鼠的AT270免疫反应性降低。C和D：图A和B各自的高倍放大视图。E和F：上文显示的CA1锥体神经元的连续部分用构象特异性抗τ抗体MC1染色。当8月龄的3xTg-AD小鼠的一些海马神经元(E)中开始显示出MC1阳性包涵体(positive inclusion)时，我们无法在用雷帕霉素治疗的3xTg-AD小鼠的大脑中检测到任何MC1阳性包涵体。G：蛋白质的代表性Western印迹图，此蛋白质从3xTg-AD小鼠的大脑中提取，并用磷酸化的特异性抗τ抗体AT270和作为加样对照的β-肌动蛋白进行检测。H：图G上印迹的定量分析，表明雷帕霉素显著地降低了在Thy181经磷酸化的τ的稳态水平((P＝0.006))。I：ELISA测量显示出可溶性τ的水平在雷帕霉素治疗过的小鼠大脑中得到显著地降低(P＝0.01)。对于不溶性τ的水平没有检测到任何变化(Ｐ>0.05)。统计评估通过使用双尾非配对学生t检验和单向ANOVA来进行，以分别用于AT270免疫反应性水平和ELISA测定。图A、B、E和F的比例尺是12.5μm，图C和D的比例尺是100μm。

图31A、31B、31C、31D、31E、31F.施用雷帕霉素增强了hAPP(J20)和3xTg-AD小鼠大脑中的自噬作用。A：从3xTg-AD小鼠大脑中提取的蛋白质的代表性Western印迹图。B和E：定量分析(数据以s-肌动蛋白校准)表明雷帕霉素显著地增加了ATG7(B；P＝0.03)和ATG5/ATG12复合物(C；P＝0.04)的稳态水平，此说明用雷帕霉素治疗的小鼠的自噬水平的提高。虽然没有观察到LC3I的水平有显著变化(D；P＞0.05)，但雷帕霉素显著地提高了LC3II的大脑水平(E；P＝0.03)，此进一步说明自噬作用的提高。E和F：被抗LC3抗体所染色的对照喂养(E)和用雷帕霉素喂养(F)的hAPP(J20)小鼠大脑中海马CA1的代表性表面荧光图像。在施用雷帕霉素之后，在CA1投影区观察到LC3特异性免疫反应性有显著的提高。插图，来自同一区域的共焦图像的z堆叠。横切体积的代表性2D截面在此显示。

图32A、32B.用雷帕霉素治疗了5周的UM-HET3雄性小鼠的内脏脂肪中的Akt活化作用。A)利用所用抗体的免疫分析在每个印迹图的左边显示出来(P-Akt对Ser473具有特异性)。B)数据已被定量并以图表的方式显示。雌性小鼠#21的波段强度从统计分析中去除，因为它们在平均值的95％置信区间外。

图33.用雷帕霉素治疗了20个月的UM-HET3雄性小鼠的内脏脂肪中的Akt活化作用降低。也显示了雌性的数据。所使用的抗体在每个印迹图的左边显示出来(P-Akt对Ser473具有特异性)。数据已被定量且在免疫印迹图下方以图表的方式显示。

图34.腓肠肌中雷帕霉素的短期治疗与长期治疗的比较。显示了量化的强度值P-473Ser Akt/Akt比率的图表。A)治疗5周。B)治疗20个月。注意到用雷帕霉素治疗了5周的雌雄小鼠中Ser473磷酸化有显著提高，在雄性小鼠中也有相同的趋势。在20个月的治疗中，在雌性或雄性中Akt磷酸化没有提高。

图35.在群组3中雷帕霉素治疗组(R)和对照组(C)小鼠的肝肿瘤中S6K1的免疫印迹分析。这些小鼠用雷帕霉素食物喂养了20个月。P-Thr(389)p70是来自于与磷酸化依赖性抗体的信号，且p70是来自于与磷酸化非依赖性抗体的信号。

图36A、36B.雷帕霉素减弱了p70激酶的磷酸化作用。A：对照组或雷帕霉素治疗组小鼠的海马裂解液的印迹中p-P70免疫反应性的定量分析显示了雷帕霉素降低p70激酶的磷酸化作用，这与雷帕霉素对mTOR的抑制作用一致。B：从对照组或雷帕霉素治疗组hAPP(J20)小鼠(又名PDAPP小鼠)的海马中提取的蛋白质的代表性Western印迹图。统计评估通过使用双尾非配对学生t检验来进行。

具体实施方式

本发明利用了以下认知，即mTOR抑制剂的微胶囊化作用提高所述抑制剂的稳定性，因此增强了抑制剂在细胞衰老延缓、生物体长寿以及年龄相关性的衰老疾病方面的功效。例如，为了提高在饮食中药物的稳定性，发明人已经开发了一种微胶囊化程序，其使雷帕霉素在食物制备过程中稳定存在的部分增加了3至4倍。食用含有微胶囊化的雷帕霉素的食物的小鼠的血液浓度是那些食用含有未胶囊化的雷帕霉素的食物的小鼠的血液浓度的约10倍。雷帕霉素的微胶囊化作用最终使这个试验变得经济上可行，因为未胶囊化的雷帕霉素用于这个试验的预算费用是非常高的。在至少50％的小鼠死亡之后，雷帕霉素组的小鼠比对照组显示出更大的存活率(雄性小鼠的p值小于0.001，雌性小鼠的p值小于0.0007)。这些数据有力地支持以下概念，即通过任何途径递送雷帕霉素或其它已知或未知的mTOR抑制剂而对mTOR长期抑制可以改善年龄相关性疾病，如癌症、代谢综合症和神经退行性疾病，从而改善成年人的总体健康和康乐。

A.mTOR抑制剂和雷帕霉素

任何mTOR抑制剂都考虑包含在本发明的微胶囊和方法中。在具体的实施方案中，mTOR抑制剂是雷帕霉素或雷帕霉素类似物。雷帕霉素(又名西罗莫司(sirolimus)并且以商品名Rapamune.RTM.进行销售)是一种已知的大环内脂。雷帕霉素的分子式是C₅₁H₇₉NO₁₃。其化学名是(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂三十一环烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮。

雷帕霉素与FK结合蛋白(FKBP)家族的成员FKBP12相结合。雷帕霉素/FKBP12复合物与蛋白激酶mTOR相结合，以阻断信号转导路径的活性。因为mTOR信号传导网络包括多个肿瘤抑制基因(包括PTEN、LKB1、TSC1和TSC2)和多个原癌基因(包括PI3K、Akt和eEF4E)，所以mTOR信号传导在细胞存活和增殖中发挥核心作用。雷帕霉素/FKBP复合物与mTOR的结合导致细胞周期在G1期被阻遏(Janus等人,2005)。

mTOR抑制剂也包括雷帕霉素类似物。许多雷帕霉素类似物在所属领域中是已知的。雷帕霉素类似物的非限制性实例包括(但不限于)依维莫司、他克莫司、CCI-779、ABT-578、AP-23675、AP-23573、AP-23841、7-表-雷帕霉素、7-硫甲基-雷帕霉素、7-表-三甲氧基苯基-雷帕霉素、7-表-硫甲基-雷帕霉素、7-去甲氧基-雷帕霉素、32-去甲氧基-雷帕霉素、2-去甲基-雷帕霉素、前雷帕霉素(prerapamycin)、西罗莫司脂化物(temsirolimus)和42-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素。

雷帕霉素的其它类似物包括：雷帕霉素肟(美国专利第5,446,048号)、雷帕霉素氨基酯(美国专利第5,130,307号)、雷帕霉素二醛(美国专利第6,680,330号)、雷帕霉素29-烯醇(美国专利第6,677,357号)、O-烷基化雷帕霉素衍生物(美国专利第6,440,990号)、水溶性雷帕霉素酯(美国专利第5,955,457号)、烷基化雷帕霉素衍生物(美国专利第5,922,730号)、雷帕霉素脒基氨基甲酸酯(美国专利第5,637,590号)、雷帕霉素生物素酯(美国专利第5,504,091号)、雷帕霉素氨基甲酸酯(美国专利第5,567,709号)、雷帕霉素羟基酯(美国专利第5,362,718号)、雷帕霉素42-磺酸酯和42-(N-烷氧羰基)氨基磺酸酯(美国专利第5,346,893号)、雷帕霉素环氧己烷异构体(美国专利第5,344,833号)、咪唑烷基雷帕霉素衍生物(美国专利第5,310,903号)、雷帕霉素烷氧酯(美国专利第5,233,036号)、雷帕霉素吡唑(美国专利第5,164,399号)、雷帕霉素酰基衍生物(美国专利第4,316,885号)、雷帕霉素的还原产物(美国专利第5,102,876号和第5,138,051号)、雷帕霉素酰胺酯(美国专利第5,118,677号)、雷帕霉素氟化酯(美国专利第5,100,883号)、雷帕霉素缩醛(美国专利第5,151,413号)、氧杂雷帕霉素(美国专利第6,399,625号)和雷帕霉素硅醚(美国专利第5,120,842号)，上述每个专利都以引用的方式特别并入。

雷帕霉素的其它类似物包括下述专利中所描述的物质：美国专利第7,560,457、7,538,119、7,476,678、7,470,682、7,455,853、7,446,111、7,445,916、7,282,505、7,279,562、7,273,874、7,268,144、7,241,771、7,220,755、7,160,867、6,329,386、RE37,421、6,200,985、6,015,809、6,004,973、5,985,890、5,955,457、5,922,730、5,912,253、5,780,462、5,665,772、5,637,590、5,567,709、5,563,145、5,559,122、5,559,120、5,559,119、5,559,112、5,550,133、5,541,192、5,541,191、5,532,355、5,530,121、5,530,007、5,525,610、5,521,194、5,519,031、5,516,780、5,508,399、5,508,290、5,508,286、5,508,285、5,504,291、5,504,204、5,491,231、5,489,680、5,489,595、5,488,054、5,486,524、5,486,523、5,486,522、5,484,791、5,484,790、5,480,989、5,480,988、5,463,048、5,446,048、5,434,260、5,411,967、5,391,730、5,389,639、5,385,910、5,385,909、5,385,908、5,378,836、5,378,696、5,373,014、5,362,718、5,358,944、5,346,893、5,344,833、5,302,584、5,262,424、5,262,423、5,260,300、5,260,299、5,233,036、5,221,740、5,221,670、5,202,332、5,194,447、5,177,203、5,169,851、5,164,399、5,162,333、5,151,413、5,138,051、5,130,307、5,120,842、5,120,727、5,120,726、5,120,725、5,118,678、5,118,677、5,100,883、5,023,264、5,023,263、5,023,262号，所有专利都以引用的方式并入本文。其它雷帕霉素类似物和衍生物可见于以下美国专利申请公开案：20080249123、20080188511、20080182867、20080091008、20080085880、20080069797、20070280992、20070225313、20070203172、20070203171、20070203170、20070203169、20070203168、20070142423、20060264453和20040010002，所有公开案都以引用的方式特别并入本文。

雷帕霉素或雷帕霉素类似物可以从所属领域技术人员所知的任何来源获得。此来源可以是商业来源或天然来源。雷帕霉素或雷帕霉素类似物可使用所属领域技术人员所知的任何技术来进行化学合成。关于雷帕霉素合成的信息的非限制性实例可见于Schwecke等人,1995；Gregory等人,2004；Gregory等人,2006；Graziani,2009。

B.微胶囊的制备

本发明的微胶囊可以使用所属领域技术人员所知的任何方法来进行制备。可使用所属领域技术人员所知的任何方法来获得核心。然后使用所属领域技术人员所知的任何方法来包裹此核心。在具体的实施方案中，包衣是肠溶衣。包衣的一些实例在下文进行讨论。在具体的实施方案中，施加肠溶衣涉及使用旋转盘雾化器，其它方法可包括锅包衣法、空气悬浮包衣法、离心挤出法、振荡喷管法、喷雾干燥法、界面聚合法、原位聚合法和基质聚合法。

用于制备微胶囊的其它方法在以下美国专利申请公开案：20080022965、20080193653、20070138673、20070082829、20060234053、20060121122、20050113282、20040121155、20040074089和20020009473以及以下美国专利：7,576,903、7,037,582、6,936,644、6,653,256、6,592,916、6,486,099、4,460,722中进行了讨论，其皆以引用的方式特别并入本文。

C.核心

本文所使用的核心是指微胶囊中包含活性剂的部分，其中活性剂被包裹于包衣中。活性剂已经在上文和本说明书的其它地方进行了讨论。

核心可包含许多的其它治疗剂，或许多的其它辅助成分。例如，核心可进一步包含至少一种下列物质：吸收增强剂、粘合剂、硬度增强剂、任选的崩解剂和另一种赋形剂。粘合剂的实例包括聚维酮(PVP：聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量HPC(羟丙基纤维素)、低分子量HPMC(羟丙基甲基纤维素)、低分子量羧甲基纤维素、乙基纤维素、明胶聚环氧乙烷、***胶、糊精、硅酸镁铝、淀粉和聚甲基丙烯酸酯。核心可包含稳定剂，如丁基羟基茴香醚、抗坏血酸和柠檬酸中的至少一种。核心可包含选自由以下组成的组的崩解剂：交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(crospovidone)(交联聚乙烯吡咯烷酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、交联羧甲基纤维素钠(交联甲羧纤维素(Croscarmellose))、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝和其组合。

核心可包含填充剂，如一水合物、微晶纤维素、淀粉、乳糖醇、乳糖、合适的无机钙盐、蔗糖或其组合。

核心可包含选自由以下组成的组的抗氧化剂：4,4(2,3二甲基四亚甲基二邻苯二酚)、富含生育酚的提取物(天然维生素E)、α-生育酚(合成维生素E)、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、Butylhydroxinon、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟甲苯(BHT)、没食子酸丙酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二烷酯、叔丁基氢醌(TBHQ)、富马酸、苹果酸、抗坏血酸(维生素C)、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、抗坏血酸钾、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、柠檬酸、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、乳酸镁、阿诺克索默(Anoxomer)、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠、异抗坏血酸(Erythorbin acid)、异抗坏血酸钠(Sodium erythorbin)、乙氧基喹啉、甘氨酸、愈创树脂、柠檬酸钠(柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠)、柠檬酸钾(柠檬酸一钾、柠檬酸三钾)、卵磷脂、多聚磷酸酯、酒石酸、酒石酸钠(酒石酸一钠、酒石酸二钠)、酒石酸钾(酒石酸一钾、酒石酸二钾)、酒石酸钠钾、磷酸、磷酸钠(磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸三钠)、磷酸钾(磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸三钾)、乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA二钠钙)、乳酸、三羟基丁酰苯和硫代二丙酸。

核心可包含螯合剂，如抗氧化剂、依地酸二钾、依地酸二钠、依地酸二钠钙、依地酸、富马酸、苹果酸、麦芽酚、依地酸钠、依地酸三钠。

核心可包含润滑剂，如硬脂酸盐、硬脂酸、科罗拉油(corola oil)、硬脂酸棕榈酸甘油酯、氢化植物油、氧化镁、矿物油、泊洛沙姆(poloxamer)、聚乙二醇、聚乙烯醇、硬脂酸镁、苯甲酸钠、滑石粉、硬脂富马酸钠、compritol(山嵛酸甘油酯)和十二烷基硫酸钠(SLS)或其组合。根据本发明的制剂的一个优选实施方案优选提供含有亲水的、可溶胀的、水凝胶形成材料的核心，所述核心由包含水不溶性聚合物和亲水性水渗透性剂的包衣包裹，水通过所述包衣可以进入核心。核心中可溶胀的水凝胶形成物质然后溶胀并使包衣胀开，之后核心更优选缓慢崩解或以其它方式释放出活性成分。另一种可选的但是优选的实施方案涉及控释核心，其带有缓慢侵蚀型干燥包衣。

D.包衣

许多药物剂型由于其化学性质会对胃产生刺激作用，或由胃酸通过酶的作用而被降解，因此变得不太有效。包衣可以是肠溶衣，即一种在活性成分到达肠之前可以防止其释放和吸收的包衣。“肠”是指小肠，因此肠溶衣促进药剂递送至小肠。一些肠溶衣促进药剂递送至结肠。在一些实施方案中，肠溶衣是EUDRAGIT()包衣。Eudragit包衣包括Eudragit L100-44(用于递送至十二指肠)、Eudragit L30D-55(用于递送至十二指肠)、Eudragit L100(用于递送至空肠)、Eudragit S100(用于递送至回肠)和Eudragit FS30D(用于递送至结肠)。其它包衣包括Eudragit RS、Eudragit RL、乙基纤维素和聚乙酸乙烯酯。优点包括pH依赖型药物释放、保护对胃液敏感的活性剂、保护胃黏膜不受活性剂影响、增加药物有效性、良好的储存稳定性以及GI和结肠靶向。

肠溶衣组分的一些实例包括邻苯二甲酸乙酸纤维素、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸钠和硬脂酸。包衣可包含合适的亲水性胶凝聚合物，其包括(但不限于)纤维素聚合物，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素等；乙烯基聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等；丙烯酸聚合物和共聚物，如丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；天然和合成树胶，如瓜尔豆胶、***胶、黄原胶、明胶、胶原蛋白；蛋白质；多糖，如果胶、果胶酸、海藻酸、海藻酸钠、多聚氨基酸、多元醇、聚乙二醇等；及其混合物。所属领域技术人员所知的任何其它包衣剂都考虑包含在本文所阐述的微胶囊的包衣中。

包衣可任选地包含增塑剂，如癸二酸二丁酯、聚乙二醇和聚丙二醇、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰化单甘油酯、乙酰柠檬酸三丁酯、三乙酸甘油酯、邻苯二甲酸二甲酯、苯甲酸苄酯、脂肪酸的丁酯和/或乙二醇酯、精炼矿物油、油酸、蓖麻油、玉米油、樟脑、甘油和山梨醇或其组合。包衣可任选地包含树胶。树胶的非限制性实例包括同多糖，如刺槐豆胶、半乳聚糖、甘露聚糖、植物胶，如藻酸盐、梧桐胶、果胶、琼脂、黄芪胶、金合欢胶、卡拉胶、核聚糖、海藻酸、其它多糖胶(如水状胶质)、儿茶、salai guggal、indian bodellum、capaiba胶、阿魏胶、cambi胶、象耳豆、乳香树胶、安息香胶、山达脂、棕儿茶胶(gambier gum)、豆科紫矿树(Flame of Forest Gum)、没药树、魔芋甘露聚糖、瓜尔豆胶、文莱胶、结冷胶、他拉胶、刺槐豆胶、鹿角菜胶、葡甘露聚糖、半乳聚糖胶、海藻酸钠、黄芪胶、核聚糖、黄原胶、脱乙酰黄原胶、果胶、聚果胶酸钠、谷蛋白、卡拉牙胶、罗望籽果胶、印度树胶、禾木胶(Accaroid)/罗汉松胶/红胶、达玛胶、生达胶、酯树胶、伊皮尔-伊皮尔种子胶、塔拉胶(gum talha)(***胶)以及人工培养的植物细胞胶，其包括来自下列属的植物的那些：金合欢属植物、猕猴桃属、花蔓草属、carbobrotus、chickorium、黄瓜属、大豆属、木槿属、大麦属、letuca、番茄属、苹果属、苜蓿属、松叶菊属、稻属、黍属、虉草属、猫尾草属、poliathus、聚卡波非、sida、茄属、三叶草属、胡芦巴属、缅茄种子胶、非洲面包树胶、苏木胶(detarium gum)、肉桂胶、角豆树胶、非洲牧豆木胶(Prosopis africanagum)、芋头胶(Colocassia esulenta gum)、哈克木胶(Hakea gibbosa gum)、非洲楝胶(khaya gum)、硬葡聚糖、玉蜀黍属和上述任何物质的混合物，以及类似物。

E.应用

1.定义

本文所使用的术语“治疗”是指对受试对象施用或应用治疗剂，或对受试对象执行程序或物理疗法，以便获得疾病或健康相关性病症的治疗益处。例如，本发明的微胶囊可施用于受试对象以便治疗受试对象的神经退行性疾病。本文所使用的“治疗”是指治愈疾病的所有病征和症状，或降低疾病的病征或症状的严重程度。

本申请中所使用的术语“治疗益处”或“治疗上有效的”是指就此病症的医学治疗来说，促进或提高受试对象的健康的任何方面。其包括(但不限于)疾病的病征或症状在频率或严重程度上的降低。例如，施用本发明的微胶囊以减少神经退行性疾病的病征和症状。

“预防”的使用是根据其一般和普遍含义，意思是“在……之前采取行动”或诸如此类的行为。在特定疾病或健康相关性病症的上下文中，这些术语是指将药剂、药物或疗法施用或应用于受试对象，或对受试对象执行程序或物理疗法以便阻止疾病或健康相关性病症的发病。例如，施用本发明的微胶囊以阻止神经退行性疾病在老年人中的发病。

2.与TOR路径相关的年龄相关性疾病

本发明的方法可用于治疗或预防年龄相关性疾病、病症或紊乱。年龄相关性疾病、病症或紊乱的非限制性实例包括胰岛素抵抗(即，糖耐量受损)、良性***增生症、听力丧失、骨质疏松、年龄相关性黄斑变性、神经退行性疾病、皮肤病、皮肤老化或癌症。在本发明方法的一个实施方案中，年龄相关性疾病、病症或紊乱是皮肤病。可使用本发明的方法来治疗的皮肤病的实例包括脂溢性角化病、光化性角化病、瘢痕疙瘩、牛皮癣和卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)。

神经退行性疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默病、癫痫、亨廷顿氏病、帕金森氏病、中风、脊髓损伤、创伤性脑损伤、路易体痴呆、匹克氏病(Pick'sdisease)、尼曼-匹克病(Niewmann-Pick disease)、淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、***性淀粉样变性、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、包涵体肌炎、轻度认知功能损害、唐氏综合征(Down's syndrome)和神经肌肉紊乱，包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症和肌营养不良症，包括杜氏肌营养不良(Duchenne dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、面肩肱型(Landouzy-Dejerine)肌营养不良和肢带型肌营养不良(LGMD)。还包括由中风、头部创伤、脊髓损伤或其它脑、外周神经、中枢神经或神经肌肉***损伤所引起的神经退行性疾病。

在本发明方法的另一个实施方案中，年龄相关性疾病、病症或紊乱是皮肤老化病症。可用本发明的方法来治疗的皮肤老化病症的实例包括年龄相关性斑点、色斑、皱纹、光老化皮肤或血管生成斑。在本发明的方法的另一个实施方案中，TOR抑制剂的施用是为了延长个体的健康寿命。

本发明的方法可用于抑制细胞或机体事件。在本发明的一个实施方案中，被抑制的细胞事件是细胞衰老。在本发明的另一个实施方案中，被抑制的细胞事件是细胞肥大。在本发明的另一个实施方案中，被抑制的细胞事件是机体衰老。

涉及mTOR的年龄相关性疾病的其它实例已得到证明，包括：良性***增生(BPH)、良性***肥大、良性***肿大(BEP)、包括胰岛素抵抗和其并发症的代谢综合症、肥胖(尤其是腹部肥胖)、血压升高、血栓症、高血压和动脉粥样硬化、心肌肥厚和骨质疏松症。关于特定的神经退行性疾病，已经表明，mTOR路径通过增加τ蛋白合成而与阿尔茨海默氏症有关联(Li等人,2005)。另外，血液淋巴细胞中活化的mTOR与记忆力和认知下降之间的相互关系已经在罹患阿尔茨海默氏病的个体中得到了证明(Paccalin等人,2006)。

癌症的非限制性实例包括乳腺癌、肺癌、***癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、***、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤或白血病。癌症的其它具体实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤、腺癌、皮革胃、胰岛素瘤、胰高血糖素、胃泌素、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝癌、腺样囊性癌、类癌肿瘤、泌乳素、嗜酸细胞瘤、许尔特累氏细胞瘤、肾细胞癌、子宫内膜腺瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、华生氏瘤、胸腺瘤、泡膜细胞瘤、粒层细胞瘤、男性细胞瘤、卵巢含睾丸母细胞瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管球瘤、黑素瘤、软组织肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、黏液瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、多形性腺瘤、肾母细胞瘤、卵巢布伦纳氏瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、无性细胞瘤、生殖细胞肿瘤、胚胎癌、卵黄囊瘤、畸胎瘤、皮样囊肿、绒毛膜癌、透明细胞癌、血管瘤、血管瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、血管内皮细胞瘤、卡波济氏肉瘤、血管外皮细胞瘤、***瘤、囊状***瘤、骨瘤、骨肉瘤、骨软骨瘤、软骨外生骨疣、软骨瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、尤因氏肉瘤、牙源性肿瘤、牙骨质母细胞瘤、釉细胞瘤、颅咽管瘤、胶质瘤、混合性少突星形细胞瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、神精上皮肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、多发性神经纤维瘤、神经鞘瘤、神经鞘瘤、神经瘤、颗粒细胞瘤、腺泡状软肉瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病、小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、纵隔(胸腺)大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤黏膜相关淋巴组织(麦芽淋巴瘤)、***边缘区B细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、塞扎里综合征综合征、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、急NK细胞淋巴瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、肥大细胞瘤、肥大细胞肉瘤、肥大细胞增多症、肥大细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、组织细胞肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤树突状细胞肉瘤、滤泡树突细胞肉瘤、瓦尔登斯特巨球蛋白血症、淋巴瘤样肉芽肿、急性白血病、淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、浆细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、前体B淋巴细胞白血病、前体T淋巴细胞白血病、急性红白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、骨髓性白血病、髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、嗜碱性细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、急性嗜碱性白血病、急性髓系白血病、慢性髓细胞性白血病、单核细胞白血病、急性单核和单核细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性髓系白血病和骨髓增生异常综合症、绿色瘤或粒细胞肉瘤、急性全髓增生症伴骨髓纤维化、毛细胞白血病、少年粒细胞白血病、侵袭性自然杀伤细胞性白血病、真性红细胞增多症、骨髓增生性疾病、慢性特发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病/嗜酸细胞增多综合症、移植后淋巴组织增生性疾病、慢性骨髓增生性疾病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合症。在某些实施方案中，过度增生病变是可以影响受试对象口腔的疾病。实例包括粘膜白斑病、鳞状细胞增生性病变、上皮癌变前病变、上皮内瘤病变、局灶性上皮增生和鳞状细胞癌病变。

本发明的微胶囊可用于治疗考虑使用mTOR抑制剂的任何疾病。以下美国专利公开了雷帕霉素的各种性质和用途，且以引用的方式并入本文。美国专利第5,100,899号公开了雷帕霉素对移植排斥反应的抑制作用；美国专利第3,993,749号公开了雷帕霉素的抗真菌特性；美国专利第4,885,171号公开了雷帕霉素针对淋巴白血病、结肠癌和乳腺癌、黑素癌和室管膜母细胞瘤的抗肿瘤活性；美国专利第5,206,018号公开了雷帕霉素对恶性乳腺癌、皮肤癌和中枢神经***肿瘤的治疗；美国专利第4,401,653号公开了在肿瘤治疗中雷帕霉素和毕西巴尼(picibanil)的联合使用；美国专利第5,078,999号公开了用雷帕霉素治疗***性红斑狼疮的方法；美国专利第5,080,899号公开了用雷帕霉素治疗肺部炎症的方法，此方法可用于缓解肺部炎症作为组成部分的疾病(即哮喘、慢性阻塞性肺病、肺气肿、支气管炎和急性呼吸窘迫综合症)的症状；美国专利第6,670,355号公开了雷帕霉素在治疗心血管、脑血管或外周血管病上的使用；美国专利第5,561,138号公开了雷帕霉素在治疗免疫相关性贫血上的使用；美国专利第5,288,711号公开了用雷帕霉素预防或治疗过度增生血管疾病的方法，所述血管疾病包括内膜平滑肌细胞增生、再狭窄和血管堵塞；以及美国专利第5,321,009号公开了雷帕霉素在治疗胰岛素依赖型糖尿病上的使用。总的来说，可通过施用雷帕霉素或雷帕霉素衍生物而得到改善、治疗、治愈或预防的任何疾病都可通过施用本文中所述的微胶囊而得到治疗。此类疾病的非限制性实例包括器官或组织移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病和炎症性疾病、关节炎(例如类风湿关节炎、进行性慢性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)和关节炎畸形)和风湿性疾病、自身免疫性疾病、自身免疫性血液病、***性红斑狼疮、硬皮病、韦格纳肉芽肿(Wegener granulamatosis)、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、史蒂芬-约翰逊综合症(Steven-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎症性肠道疾病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn's disease))、内分泌眼病变、格雷夫斯病(Graves disease)、结节病、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、少年糖尿病葡萄膜炎、干燥性角结膜炎、春季角结膜炎、肺间质纤维化、牛皮癣关节炎、肾小球肾炎、常染色体显性多囊肾病、幼年皮肌炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺气肿、支气管炎和急性呼吸窘迫综合症、肿瘤、过度增生皮肤病、真菌感染、干眼症、血管疾病、糖尿病和眼部疾病(如由于年龄相关性黄斑变性而导致的眼部血管新生疾病)。

3.预防性治疗

本文阐述的方法的某些实施方案涉及预防受试对象的疾病或健康相关性病症的方法。预防策略在现代医学中至关重要。

根据剂量、治疗次数和治疗持续时间，欲施用的医药组合物的数量取决于欲治疗的受试对象、受试对象的状况、所要预防的疾病的性质和期望的保护措施。治疗组合物的精确用量也取决于医师的判断，并且是因人而异的。例如，组合物的使用频率可以是一天一次、一天两次、一周一次、一周两次或一个月一次。治疗持续时间可从一个月到一年或者更长。再者，精确的预防方案会高度依赖于受试对象、风险因素的性质和医师的判断。

F.组合物

本文阐述的某些方法涉及包括施用含有本发明微胶囊的组合物的方法。

本文所使用的“药学上可接受的载剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质和其组合，这将为所属领域技术人员所知(Remington’s1990)。除非与活性成分不相容，否则任何常规载剂在治疗或医药组合物中的使用都是可以考虑的。本发明中所使用的组合物可包含不同类型的载剂，取决于此组合物是以固体、液体还是气溶胶形式施用，以及所述施用途径是否像注射一样需要无菌。

所述介质和药剂关于医药活性物质的使用在所属领域中是众所周知的。除非与活性成分不相容，否则任何常规介质或药剂在治疗组合物中的使用都是可以考虑的。辅助活性成分也可以被并入到组合物中，并且将会在下文中进行详细讨论。对于人的施用，如FDA生物制品标准中所要求的，制剂应满足无菌、热原性、一般安全和纯度标准。

制剂可根据给药途径而进行变动。对于以水溶液形式肠外施用，例如，必要时溶液应该适当地进行缓冲，并用足量的盐水或葡萄糖首先使液体稀释剂变得等张。在这方面，根据本公开书，可以采用的无菌水性介质为所属领域技术人员所知。

在某些实施方案中，医药组合物包含至少约0.1重量％的活性化合物。在其它的实施方案中，医药组合物包含约2重量％至约75重量％的组合物，或介于约25重量％至约60重量％之间的组合物，和任何可自其引申的范围。

本发明的医药组合物可包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可用防腐剂预防微生物作用，如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括(但不限于)对羟基苯甲酸酯(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。组合物在制造和储存条件下必须稳定，并经历防腐操作以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

1.给药途径

可以使用所属领域技术人员所知的任何方法将微胶囊施用于受试对象。例如，医药有效量的组合物可在以如下途径施用的包含水性介质的组合物中施用：静脉内、脑内、颅内、鞘内、进入黑质或黑质区域、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、气管内、鼻腔内、局部、肌肉内、腹膜内、皮下、口服、局部、局地、吸入(如气溶胶吸入)、注射、输液、连续输液、直接局部灌注靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳剂形式、以脂质组合物形式(如脂质体)或通过其它方法或上述各种方法的任何组合，这将为所属领域技术人员所知(Remington’s,1990)。微胶囊的固体组合物可通过口服施用。

在具体的实施方案中，使用药物递送装置对受试对象施用组合物。任何药物递送装置都可以被考虑用于递送医药有效量的mTOR抑制剂。

2.剂量

mTOR抑制剂的医药有效量是基于预期目标来确定。根据治疗的次数和剂量，给药量取决于欲治疗的受试对象、受试对象的状态、期望的保护措施和给药途径。治疗剂的精确量也取决于医师的判断，并且也是因人而异的。

欲施用的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的量取决于所要治疗的疾病、期望持续时间的长度和植入物的生物利用率概况以及给药部位。一般来说，有效量是在病人主治医生的判断和学识范围之内的。给药指导包括雷帕霉素或雷帕霉素类似物的剂量是约0.01mg至约500mg。

例如，mTOR抑制剂的剂量可以是每次剂量约0.0001mg至约1.0mg，或约0.001mg至约0.1mg，或约0.1mg至约1.0mg，或甚至约10mg等。也可以施用多个剂量。在一些实施方案中，剂量是至少约0.0001mg。在其它实施方案中，剂量是至少约0.001mg。在其它实施方案中，剂量是至少0.01mg。在其它实施方案中，剂量是至少约0.1mg。在更具体的实施方案中，剂量可以是至少1.0mg。在甚至更具体的实施方案中，剂量可以是至少10mg。在其它实施方案中，剂量是至少100mg或更高。

在其它非限制性实例中，每次施用的剂量可还包括约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重至约1,000mg/kg/体重或以上，以及自其可引申的任何范围。在本文所列数字的引申范围的非限制性实例中，可以施用的范围是约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等，这基于上述数字。

当所属领域技术人员确定有需要时，剂量可以重复。因此，在本文所阐述的方法的一些实施方案中，可以考虑使用单剂量。在其它实施方案中，可以考虑使用两个或两个以上的剂量。在对受试对象施用一个以上的剂量时，剂量之间的时间间隔可以是所属领域技术人员所确定的任何时间间隔。例如，剂量之间的时间间隔可以是约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约10小时、约10小时至约24小时、约1天至约2天、约1周至约2周或更长，或在这些引用的范围的任一个内可引申的任何时间间隔。

在某些实施方案中，可能需要对病人连续提供医药组合物。此可以通过***导管，随后连续施用治疗剂来完成。给药可以在手术中或手术后。

3.次级治疗

本发明的某些实施方案提供一种或多种次级治疗形式的施用或应用。治疗类型取决于被治疗或预防的疾病的类型。次级治疗形式可以是施用一种或多种的次级药理剂，它可以被应用于治疗或预防与衰老相关的疾病，包括上述任何疾病。

如果次级治疗是药理剂，那么它可以先于、同时或接着mTOR抑制剂的施用而施用。

mTOR抑制剂和次级治疗之间的间隔可以是由所属领域技术人员所确定的任何间隔。例如，间隔可以是数分钟至数周。在药剂分开施用的实施方案中，一般应确保在每次递送时间之间不会间隔过长的时间，以便于每种治疗剂仍可以对受试对象发挥有利的联合作用。例如，治疗剂之间的间隔可以是相互间隔约12小时至约24小时；更优选相互间隔约6小时至约12小时。在一些情况中，可能需要显著延长治疗的时限，但是，在分别给药之间会间隔几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。在一些实施方案中，次级治疗剂的施用时机的确定是以受试对象对mTOR抑制剂的反应为依据。

实施例

以下实施例用于说明本发明的优选实施方案。所属领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表发明人所发现的在本发明实施中表现良好的技术，且因此可被视为构成其优选实施模式。但是，根据本公开书，所属领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在公开的特定实施方案中可以做许多修改，并且仍可获得相同或类似的结果。

实施例1

通过对20月龄的遗传异质小鼠喂食雷帕霉素来延长寿命

方法

小鼠的繁殖、喂养和寿命估算.在三个试验场的每个场中，通过将CB6F1雌鼠与C3D2F1雄鼠进行交配来繁殖小鼠，从而繁殖遗传异质群体。用于健康监测的方法的细节先前已有报道(Miller等人,2007)；简单地说，每年4次评估三个群体的每个中的传染性病原体(包括蛲虫)情况。在整个研究期间，所有此类试验都呈阴性。在六个月的试验期内，每个试验场每月都招收数量大致相同的19至21日龄的断奶幼鼠，每个笼子住3只雄鼠或4只雌鼠。每个场中制造者所要求使用的食物是以NIH-31标准为依据，此标准是关于养殖笼以及断奶和实验性食物开始之间的时间，具体如下：关于养殖笼，UM使用的是Purina5008，UT使用的是Teklad7912，TJL使用的是Purina5K52。关于在4月龄之前的断奶幼鼠，UM使用的是Purina5008，UT使用的是Teklad7912，且TJL使用的是Purina5LG6。当在4月龄开始时，所有三个场中对照组、依那普利(Enalapril)组和CAPE组的小鼠接受Purina5LG6，不使用添加剂(对照组)或使用测试剂。雷帕霉素组的小鼠仍然保持断奶饮食，直到在600日龄开始接受含有雷帕霉素的Purina5LG6。对照组小鼠和用雷帕霉素治疗的小鼠各自的群组在一年后以相同的方式进行确立，再次在每个试验场，但是雷帕霉素是从270日龄开始使用，而不是600日龄。其它的喂养细节(包括施加于每组中子集的T细胞亚群分布和活性的台账(accounts of tests)细节)已在其它文献中作出了说明(Nadon等人,2008)。主要终点是死亡时的年龄(在每天的检测中被发现死亡的小鼠)或安乐死时的年龄(被认为不可能再活48小时以上的小鼠)。

从长寿群体中移除小鼠.几乎平均分配在三个试验场中的群组2005研究群体最初由1960只小鼠组成，其中674只被分配给对照组，317只至328只被分配给四个治疗组中的每一组。在它们中，有51只小鼠从研究中被移除，原因是打架(31只小鼠)、意外死亡(如植入芯片或笼子进水；13只小鼠)或技术性失误(性别分配或饮食选择上的失误；7只小鼠)。为了进行生存分析，在这些小鼠从治疗方案中移除的日期，将它们作为活的小鼠来对待，且此后不再对其进行跟踪。这些被审查的小鼠不被纳入中位数寿命的计算中。

死亡时年龄的估算(寿命).至少每天对小鼠不健康的病征进行检查，如果它们是严重垂危的，且经验丰富的技术人员认为它们接下来不可能生存超过额外48小时，出于人道原因，对它们实施安乐死。如果小鼠表现出一种以上的下列临床病征，即被认为是严重垂危的：(a)没有能力吃喝；(b)严重的嗜睡，表现为缺乏反应，例如当用镊子轻刺时不愿意移动；(c)严重的平衡或步态失调；(d)在超过一周或更长的时期内体重迅速下降；或(e)严重的溃疡性或出血性肿瘤。垂危小鼠被实施安乐死时的年龄被视为其自然寿命最好的可用估计值。在每次的日检查中被发现死亡的小鼠也会被记录下来。尸体将被保存作为以后分析之用，将在别处报道。

对照和实验饮食.TestDiet公司(Richmond,IN)准备了多批含有每种测试物质的Purina5LG6食物和对照饮食，间隔大约120天，并将每批食物在同一时间运送到三个试验场中的每一个。依那普利是从Sigma(目录E6888-5G)购买，其用量是每千克食物120毫克；假设小鼠平均体重为30克且每天消耗5克食物，那么此剂量每天每千克体重供应20毫克依那普利。CAPE(即咖啡酸苯乙酯)是从Cayman购买(Ann Arbor,MI；目录70750)，其用量是以下两种剂量中的任一个：高剂量是每千克食物300毫克(每天每千克体重50毫克)，低剂量是每千克食物30毫克(每天每千克体重5毫克)。对依那普利进行试验是因为在高血压、肥胖、糖尿病以及充血性心力衰竭的老年人和啮齿类动物模型中，已经报道了依那普利可以改善这些病症中的许多病症。对CAPE进行试验是因为此药剂已被报道具有抗氧化性、抗炎性和免疫调节功能，同时对转化细胞和肿瘤细胞有特异性毒性。被喂食依那普利或CAPE的小鼠的寿命在图1中与对照组和被喂食雷帕霉素的小鼠进行了对比。雷帕霉素是从LC实验室(Woburn,MA)购买。雷帕霉素由Southwest Research Institute(San Antonio,TX)使用旋转盘雾化包衣工艺进行微胶囊化，肠溶衣材料是Eudragit S100(Pharma,Germany)。此甲基丙烯酸酯聚合物在pH值低于7时是稳定的，因此保护雷帕霉素在胃的酸性条件下不受损坏；此保护性包衣在小肠中溶解，从而允许对活性剂的吸收。此热塑性包衣材料使雷帕霉素耐受食物制备过程的部分提高了3至4倍。因为此包衣材料只有在非酸性条件下才溶于水，因此胶囊化的雷帕霉素是在小肠中被释放，而不是在胃中。先导研究表明胶囊化的雷帕霉素导致血浓度是同等剂量的未胶囊化的雷帕霉素所得到的血浓度的大约10倍。胶囊化的雷帕霉素的给药量是每千克食物14毫克(每天每千克体重2.24毫克雷帕霉素)。胶囊化的雷帕霉素接着被并入到5LG6小鼠食物中，并且被分配到所有三个试验场。

雷帕霉素的测量.雷帕霉素是从LC实验室(Woburn,MA)获得。32-去甲氧基雷帕霉素(32-RPM)是从Sigma化学品公司(St.Louis,MO)获得。HPLC级甲醇和乙腈是从Fisher(Fair Lawn,NJ)购买。所有其它试剂是从Sigma化学品公司(St.Louis,MO)购买。Milli-Q水被用于所有溶液的制备。HPLC***由Waters510HPLC泵、Waters717自动进样器、Waters2487紫外检测器和Waters Empower色谱软件组成(Waters,Milford,MA)。HPLC分析柱是从Alltech(Deerfield,IL)购买的Grace Alltima C18(4.6×150mm，5微米)。流动相是64％(v/v)乙腈和36％水。流动相的流速是1.5ml/min，且吸光度的波长是278nm。在色谱运行期间HPLC分析柱的温度维持在70℃，使用的是EppendorfCH-30柱加热器。将雷帕霉素和32-RPM粉末溶解于甲醇中，浓度为1mg/ml，并在80℃进行分装储存。每天用甲醇原液来制备浓度为1μg/ml的工作原液，并用于掺加校准样。每天所制备的校准样通过用原液掺加全血或小鼠食物而得到，且最终浓度为0、4、8、12、100和200ng/ml。

使用装有UV检测的HPLC对小鼠血液中的雷帕霉素进行定量。简单地说，将0.5mL校准样和未知样品与75μL的1.0μg/mL32-去甲氧基雷帕霉素(内标)、1.0mL ZnSO4(50g/L)和1.0mL丙酮进行混合。将这些样品剧烈涡旋振荡20秒后在2600g和23℃温度下离心5分钟(接下来的离心作用在相同条件下进行)。上层液被移至干净的试管中，然后加入200μL的100mM氢氧化钠，接着涡旋振荡。接着，加入2mL1-氯丁烷，将样品加盖，涡旋振荡(1分钟)并离心。上清液被移至10mL的玻璃管中，在环境温度下、氮气流中干燥得到残余物。将干燥提取物溶解在750μL流动相中，然后将2mL己烷加入到每个试管中。将试管加盖，涡旋振荡30秒，并离心2分钟。将己烷层移除并丢弃。剩余的提取物在氮气中干燥并在250μL流动相中进行重构，然后将200μL最终的提取物注射进HPLC。雷帕霉素的峰面积与每种未知样品的内标的峰面积(反应比)的比率与校准样反应比的线性回归进行对比，从而对雷帕霉素进行定量。雷帕霉素的浓度可表示为ng/mL全血。

小鼠食物中雷帕霉素的含量使用装有UV检测的HPLC进行鉴定。简单地说，对于掺加的校准样和未知样品，100mg食物用研钵和杵进行粉碎，然后与20μL的100μg/mL32-RPM(内标)和0.5mL甲醇一起剧烈涡旋振荡。然后将样品机械摇动10分钟。接着加入0.5mL Millipore水，并将样品剧烈涡旋振荡20秒。样品离心10分钟后，将40μL样品注射进HPLC。在食物中雷帕霉素浓度为0、2、4、8、10和20ng/mg时，将雷帕霉素的峰面积和内标的峰面积的比率(反应比)与校准样反应比的线性回归进行对比，从而对雷帕霉素进行定量。食物中雷帕霉素的浓度可以表示为ng/mg食物(百万分率)。

雷帕霉素的有效性.为了分析mTORC1下游效应分子的状态，在小鼠的内脏脂肪组织裂解液中，测量作为S6激酶1底物的核糖体蛋白S6(Ser240/244)的磷酸化作用，所述小鼠用胶囊化的雷帕霉素食物喂食了420天或用带有空微胶囊的对照食物喂食。解剖组织并在液氮中速冻后储存在-80℃下，在液氮中磨成粉并溶解于10倍体积的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、120mM氯化钠、1％NP-40、1mM EDTA、50mM NaF、40mM2-磷酸甘油、0.1mM原钒酸钠(pH10)、1mM苯甲脒和1X完整蛋白酶抑制剂混合液(Roche))中。经过超声处理和微量离心后，对裂解液定量，30。40μg来自每种提取物中的可溶性蛋白质被加样至4-12％梯度的PAGE上，并在5V下电泳过夜。接着将凝胶转移至硝酸纤维素膜中(干燥过程)，阻断并与一级抗体[S6核糖体蛋白(5G10)兔单克隆抗体，目录号2217；磷酸化S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体，目录号2215；和Pan-Actin抗体，目录号4968；Cell Signaling Technologies,Danvers MA]一起培养，接着与二级抗体[抗兔IgG，(H+L)，过氧化物酶结合抗体，目录号31460；Pierce,Rockford IL]一起培养，以便通过化学荧光进行检测。每个免疫印迹的信号强度使用柯达影像站(Kodak Image Station)来捕获，并使用柯达1D图像分析软件来分析。

结果

在位于三个协同研究场所中每个场所的雄性和雌性小鼠中，通过从600日龄开始喂食胶囊化的雷帕霉素，小鼠的中位数和最长寿命得到了延长(图2)。此数据组与2％(1,901中的38)还活着的小鼠一起进行了分析。对于场所间所汇总的数据，对数秩检验否定了治疗组和对照组没有差异的无效假设(P＜0.0001)；在雄性和雌性中，喂食雷帕霉素的小鼠都比对照组(P＜0.0001)活得更长。表示为平均寿命，在汇总的数据组中效应值是雄性为9％和雌性为13％。表示成在600日龄时(首次接触雷帕霉素的年龄)的寿命期望，效应值是雄性为28％和雌性为38％。平行评价的用其它药剂(依那普利和CAPE(咖啡酸苯乙酯))进行治疗的小鼠与使用同等剂量的对照组小鼠没有区别(图1)。

然后，喂食雷帕霉素的小鼠和对照小鼠就场所和性别的每个组合进行单独对比。相比于对照组，雷帕霉素组始终具有优势，P值在0.03至0.0001的范围内(图3)。在喂食雷帕霉素后，所有三个场所的雌性小鼠都提高了存活率(图3)。雌性小鼠的平均寿命提高了15％、16％和7％(分别是TJL、UM和UT)，且在三个场所中在600日时的寿命期望对于雌性提高了45％、48％和22％。雌性对照组的中位数寿命估算值在场所间保持一致(881天至895天)，且与2004群组中记录的值相似，其范围为858天至909天(Miller等人,2007)。因此，喂食雷帕霉素的雌性小鼠中所观察到的存活率提高对于雌性对照组的低存活率来说不是假象。所有三个场所的雄性小鼠在喂食雷帕霉素后也提高了存活率(图3)。雄性小鼠的平均寿命增加了5％、8％和15％(分别是TJL、UM和UT)，并且在600日时的雄性寿命期望分别增加了16％、23％和52％。解释由于各场所之间雄性对照组存活率的差异进行解释而复杂化，并且因为在UT以及可能在UM分配给喂食雷帕霉素组的小鼠在600日龄之前的死亡率比对照组低。在UT和UM，对照组小鼠与那些喂食雷帕霉素的小鼠有差异，不仅表现在从600日龄开始接触雷帕霉素，同时也表现在断奶和600日龄期间使用的具体配方的小鼠食物(所有食物都以NIH-31标准为依据)。因此，不能排除雷帕霉素提高了位于UT和UM的雷帕霉素组中雄性小鼠的存活率的可能性，其可能反应了在600天之前在营养或健康状态下对照组与雷帕霉素组之间的差异，而不仅仅是雷帕霉素的效应。显而易见的，雷帕霉素对在TJL的雄性(和雌性)存活率的显著效应不可能受到施用药物之前的食物的影响，因为在这段期间位于TJL中的对照小鼠和喂食雷帕霉素的小鼠都食用了同样的食物(Purina5LG6)。最长寿命通过喂食雷帕霉素而得到了提高。表1显示了对照小鼠和雷帕霉素治疗的小鼠中第90百分数的年龄，同时也显示了对照组95％的上置信界限。

表1雷帕霉素对最长寿命的作用

*对照组小鼠中95％的置信区间的上限显示在括号中。例如，在首行中，对于场所间所汇总的雌性，对照组中95％的置信区间都上升到1,136天，且对于雷帕霉素治疗小鼠的第90百分数的存活者的估计值是1,245天。这就为雷帕霉素治疗小鼠(1,245)的第90百分数的存活者远高于对照组(1,094)提供了很好的证据。

对于每个场所和每种性别，用雷帕霉素治疗的小鼠中第90百分数的年龄都高于相应的对照组的上限，这显示出雷帕霉素增加了第90百分数幸存者的年龄。

为了确定由于喂食雷帕霉素而导致的最长寿命增加是否具有统计学显著性，在联合生命表(joint life table)(Wang等人,2004)中90％的小鼠都死亡后，比较了每组中活小鼠的比例(表2)。

表2关于比较第90百分数年龄的小鼠存活比例的计算细节

关于场所、性别和治疗组的每种组合，本表列举了在90％联合分布(对照组加上雷帕霉素组，关于场所/性别的组合)的小鼠已经死亡时的年龄(第3列)下活小鼠的数目(和死亡数)。例如，对于TJL场所的雌性，在1167日龄时对照组(4/95)的4.2％和雷帕霉素治疗小鼠(11/48)的22.9％仍然活着。在分析时(2009年2月1日)，任何组中年龄在第90百分数年龄以下的对照组小鼠已经全部死亡。位于UM场所中，有一只雌性活小鼠，其年龄低于第90百分数阀值，但是此小鼠是雷帕霉素组中的，并且其死亡时的年龄因此对表中所列举的统计数字和P值无重大影响。

对三个场所进行总结，与21.5％的用雷帕霉素治疗的雌性小鼠相比，4.8％的雌性对照组小鼠在这些年龄是存活的(P＜0.0001)。关于雄性，相应的值是对照组为5.9％和雷帕霉素治疗小鼠为20.2％(P＜0.0001)。具体场所的计算值记录了位于TJL场所(P＜0.0006)和UM场所(P＜0.0001)中对雌性小鼠的显著效应；关于雄性小鼠，记录了位于TJL场所(P＜0.008)和UT场所(P＜0.0001)中的显著效应，以及UM场所(P＜0.07)中的边缘效应。从600日龄开始用雷帕霉素进行喂养，因此导致了最长寿命的显著增加。

为了测试一系列病变是否被雷帕霉素食物所改变，对31只对照组小鼠和40只雷帕霉素喂养的小鼠进行了完整的尸检，这些小鼠被发现死亡，或在垂危时被处死(表3)。虽然雷帕霉素可以延缓死亡，但是它不会改变假设死因的分布。

表3死亡时用雷帕霉素治疗的小鼠和对照组小鼠中的病变

死因	对照组	雷帕霉素组
			脓肿	1	1
肾上腺肿瘤	1
			癌(肠胃)	1
癌(肾)	1
			心肌变性		1
心肌病		1
			纤维肉瘤		2
胃溃疡	1
			心力衰竭	2	1
心脏纤维化
			血管肉瘤	3	5
肝癌	3	3
			平滑肌肉瘤		1
淋巴瘤	10	15
			乳腺癌		1
心肌梗死		1
			胸膜炎	1
***炎	2
			肺肿瘤	4	7
败血症	1
			可诊断的病例	31	40
自溶	17	12
			未知	2	1
共计	50	53

对照组小鼠(N＝31)的平均死亡年龄是977天，雷帕霉素治疗组小鼠(N＝40)的平均死亡年龄是1005天，从那些动物中可以推断出假设死因。在可能的情况下，以总体评估值为依据，死因的推断是通过一个经验丰富的兽医病理学家对每只小鼠的一套标准组织进行组织病理学检查。肿瘤被视为死因，其以肿瘤类型、大小、数量和分布为依据。患有炎症或退行性病变的小鼠的死因是以病变的位置和严重性为依据，以及此类病变已经足够严重从而导致发病和死亡的可能性。许多动物都有小且局部的肿瘤和各种退行性病变，其被认为是不可能导致死亡的。在29例中自溶阻碍了诊断，而在所显示的三个其它病例中死因不能被确定。

使用单独的小鼠群组来评价胶囊化的雷帕霉素的作用，此雷帕霉素在270日龄时开始使用(图4A)。在分析时，51％的雌性和68％的雄性已经死亡，且分级对数秩检验表明，雷帕霉素治疗的小鼠的死亡风险与对照组相比显著降低，这是汇总了三个试验场的结果得到的(雄性的P值＝0.0002，雌性的P值＜0.0001)。当单独对每个场进行评价时，雷帕霉素对位于每个场的雌性的有益效应是显著的(P＜0.005)；对于雄性，此效应在UM和UT是显著的(P<0.025)，但在TJL却不显著。当从270日龄开始使用雷帕霉素时，雷帕霉素显示可以降低中年死亡的风险，但是需要额外的数据为效应大小提供精确的估计值，并评价对最长寿命的作用。

为了证明雷帕霉素在寿命研究中所用剂量时的生化效应，在内脏白色脂肪组织中对核糖体蛋白亚单位S6(rpS6)(mTOR信号传导路径20中的S6激酶1的目标底物)的磷酸化状态进行了评价(活体内雷帕霉素治疗对mTOR的抑制作用的敏感性指示物)。图4B表明当从270日龄至大约800日龄用雷帕霉素进行喂养时，磷酸化rpS6的水平降低了4至5倍。用雷帕霉素治疗的雄性和雌性小鼠中雷帕霉素的血液水平是相当的，介于60ng/ml和70ng/ml之间。

关于TOR功能的降低可以延长寿命的起始证据最初来自于对酵母(Kaeberlein等人,2005；Powers等人,2006)和无脊椎动物(Jia等人,2005；Kapahi等人,2004；Vellai等人,2003)的研究。限食(Masoro,2005)和侏儒突变都可以在啮齿类动物中延长寿命，它们的有利作用可能在某种程度上是由于对mTOR复合物1(mTORC1)路径的抑制而产生的(Sharp和Bartke,2005；Hsieh和Papaconstantinou,2004)。

目前还不清楚mTOR的抑制作用将会重现与限食或侏儒突变相关的表型的其它方面达到何种程度。证明了即使在生命晚期开始用雷帕霉素进行喂养也可以延长寿命，同时体重没有改变，这使得这些研究结果与使用限食区别开：在所有的情况下限食都降低了体重，并且在大多数报道(Masoro,2005)中，虽然不是全部(Dhahbi等人,2004)，如果在大约550日龄开始限食，其只会产生很少(如果有的话)的效应。

为了说明此研究中所使用的雷帕霉素剂量的生化效应，在单独组的年轻成年UM-HET3小鼠的白色脂肪组织(WAT)中，对核糖体蛋白亚单位S6(rpS6)(mTOR信号传导路径中的S6激酶1的目标底物(Petroulakis等人,2007))的磷酸化状态进行了评价，所述UM-HET3小鼠用含有雷帕霉素的食物喂养了5周。相对于总rpS6，磷酸化rpS6显著减少，在用雷帕霉素喂养的小鼠中几乎检测不到(图5)。虽然在大多数的对照小鼠中有磷酸化rpS6的强烈信号，但一些对照小鼠中具有极少的这种改变。重要的是，所有喂食雷帕霉素的小鼠中都只有很少的磷酸化rpS6。

对肝和大脑进行分析，从而确定食物中此剂量的雷帕霉素是否会影响其它器官***中的rpS6磷酸化作用。图6显示了肝中rpS6磷酸化作用的免疫印迹分析。在此剂量的雷帕霉素下(见雌性、雄性和两者的图表)，磷酸化rpS6与总rpS6蛋白的比率的定量是雄性中比雌性中更显著，后者在此分析中达到了统计显著。合并的雄性和雌性磷酸化rpS6的分析结果表明，在治疗过的小鼠中的水平显著较低。对于肝中S6激酶1活性的结论是，在这个雷帕霉素剂量下两种性别都作出了反应，而雄性更为敏感。

图7显示了雷帕霉素治疗过的和未治疗过的UM-HET3小鼠大脑中S6K1活性的分析结果。与WAT和肝相比，在脑中由这种分析方法所测量的关于mTOR/S6K1的效应较不显著得多。因为雷帕霉素可以容易地穿过血脑屏障(Pong和Zaleska,2003)，所以这种反应令人感兴趣且在生物医学方面是有意义的。

当营养物、能量和生长因子的输入对mTORC1激酶活性的活化作用有帮助时，它的另一个目标底物是4E-BP1，即一种帽依赖性翻译的阻遏物(Gingras等人,2001)。4E-BP1的磷酸化作用抑制了其阻遏功能。雷帕霉素抑制了mTORC1介导的4E-BP1的磷酸化作用。长期用雷帕霉素进行治疗的UM-HET3小鼠的白色脂肪组织中4E-BP1的分析结果揭示了磷酸化4E-BP1的比率在雄性和雌性的合并分析结果中没有差异(图8)。相对于E-肌动蛋白，在食用雷帕霉素的雄性小鼠的脂肪中，总的4E-BP1蛋白质显著地提高。长期用雷帕霉素进行治疗的雌性小鼠的WAT显示出磷酸化的4E-BP1的比率相比于总4E-BP1没有差异，或4E-BP1蛋白质的水平相比于E-肌动蛋白没有差异。雄性对雷帕霉素治疗的敏感性增加；相对于对照组，磷酸化的4E-BP1与总蛋白质的比率在统计上是不同的。相比于E-肌动蛋白，4E-BP1总蛋白质也增加。这些数据与以细胞为基础的研究是相一致的，此研究显示了S6K1和4E-BP1的差异性抑制作用，其是细胞类型特异性的(Choo等人,2008)。当雷帕霉素在实验过程(24至48小时)中抑制S6K1的活性时，4E-BP1磷酸化作用将在6小时内恢复。

图9显示了长期用雷帕霉素治疗的小鼠的肝中4E-BP1磷酸化作用的免疫印迹分析结果。再次，与基于细胞的实验相一致，雄性或雌性中4E-BP1磷酸化作用的比率没有统计学差异，实际上在此实验中所分析的5只雌性中磷酸化作用适度提高。由于在这些实验中没有对E-肌动蛋白进行分析，因此没有分析4E-BP1的水平。

请注意，4E-BP2是大脑中表达的4E-BP蛋白质的主要形式(Banko等人,2005)。上文使用的免疫试剂对于4E-BP1具有特异性，因此大脑中这些翻译阻遏物的分析取决于4E-BP2特异性抗体的发展。

体内证据表明S6K1的活化作用是通过IRS1的调节来抑制胰岛素信号传导(Um等人,2006)。此预示着雷帕霉素治疗解除此信号传导的抑制，从而导致了Akt磷酸化作用的增加。在从食用含有雷帕霉素的食物的小鼠获得的WAT中，Akt磷酸化作用的分析的免疫印迹结果表明，作为对雷帕霉素治疗的反应，Akt磷酸化作用的水平在雌性中没有差异。与对照组相比，图10中雄性的结果表明Akt的磷酸化作用有明显提高。雄性和雌性的合并数据是极其显著的。

图11显示了食用含有雷帕霉素的食物的UM-HET3小鼠的肝中Akt活化作用的免疫分析数据。如上在WAT所记录的，我们观察到在雄性小鼠肝中Akt的磷酸化作用有显著的提高，但在雌性中则不然。

图12显示了食用含有雷帕霉素的食物的UM-HET3小鼠的脑中Akt活化作用的免疫分析数据。有趣的是，在用雷帕霉素治疗的雄性和雌性小鼠中Akt的磷酸化作用显示都有显著的提高。

总结这些免疫分析结果，从而确定了长期接触雷帕霉素食物的器官特异性效应，被测试的所有器官在上游和下游mTORC1效应分子上都显示出预期效应的证据。关于S6K1活性，与肝相比，WAT显示在7ppm剂量时是高度敏感的。雄性小鼠白色脂肪组织显示比雌性更为敏感。与对照组相比，在雷帕霉素治疗的小鼠的大脑中S6K1活性没有差异。关于4E-BP1磷酸化作用，在所分析的任何组织中只记录到很少效应，这与基于细胞的实验是相一致的，此实验显示出在6至24小时的治疗后，4E-BP1磷酸化作用得到恢复。记录了雄性小鼠WAT中4E-BP1水平的意外提高。在雄性小鼠WAT中观察到Akt活化作用，但在雌性小鼠WAT和肝中却没有观察到。在雄性和雌性中，大脑Akt通过雷帕霉素得到了提高。因此，对测试的雷帕霉素水平显示存在着器官和性别特异性反应，这再次与基于细胞的雷帕霉素效应的分析结果相一致。在这些结果的基础上所得出的结论是雷帕霉素食物对所测试的靶器官具有预期的生物学效应。

实施例2

用于检验食物中雷帕霉素稳定性的研究

进行研究以检验食物中雷帕霉素的稳定性。雷帕霉素被送至西南研究院(San Antonio)进行微胶囊化，这是通过将雷帕霉素溶解于含有已溶解的肠溶衣Eudragit S100的有机溶剂中来实现。如实施例1中所讨论的，此聚合物在pH低于7时是稳定的。胶囊化和未胶囊化的雷帕霉素样品以0.7ppm、7ppm和70ppm的浓度被掺入到市售小鼠食物中，并分析食物中雷帕霉素的水平(图13-14)。胶囊化的雷帕霉素比未胶囊化的雷帕霉素更经受得住掺入食物的过程，如用胶囊化的雷帕霉素所制得的食物中检测到的雷帕霉素浓度是用未胶囊化的雷帕霉素所制得的食物中检测到的雷帕霉素浓度的3倍所证明。用从胶囊化和未胶囊化的雷帕霉素所制得的食物喂养小鼠4至5周，并用带有紫外检测的HPLC测定200μl全血样品中的雷帕霉素浓度。在喂食胶囊化的雷帕霉素后所观测到的平均血液含量大于25ng/ml，这比在人的治疗方案中至少是12ng/ml的治疗含量有利(图15)。相比之下，用从未胶囊化的雷帕霉素制得的食物所喂养的小鼠只有不到2.5ng/ml，其是分析的检测极限。结果，食物中的剂量被增至14ppm，从而用于实施例1中的长寿研究。

实施例3

在阿尔茨海默病的小鼠模型中雷帕霉素恢复了认知并减弱了病理表现

方法

小鼠.在巴克研究所(Buck Institute)实施了涉及hAPP(J20)小鼠的雷帕霉素给药和行为实验。实验组是：对照组，非转基因，n＝10；雷帕霉素组，非转基因，n＝10；对照组，转基因，n＝12；雷帕霉素组，转基因，n＝12，所有的动物都是雄性和7月龄。涉及3xTg-AD小鼠的雷帕霉素给药和行为实验在UTHSCSA进行实施，实验组是：对照组，非转基因，n＝13；雷帕霉素组，非转基因，n＝14；对照组，3xTg-AD，n＝14；雷帕霉素组，3xTg-AD，n＝16；雄性和雌性的纳入比例相同。3xTg-AD小鼠和hAPP(J20)小鼠的起源和特征已经在其它文献(Hsia等人,1999；Mucke等人,2000；Oddo等人,2003)中进行了描述。hAPP(J20)小鼠通过与C57BL/6J小鼠进行杂交而维持(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)。hAPP(J20)小鼠是关于转基因的杂合体。非转基因的同窝出生仔畜被用作对照组。对于APP和τ转基因来说且对于敲入PS1基因中的M146V突变来说，3xTg-AD小鼠是纯合的。

雷帕霉素治疗.如实施例1所述用含有2.24mg/kg微胶囊化的雷帕霉素或对照食物的食物喂养小鼠。在治疗所持续的时间中，所有的小鼠都是随意地取用雷帕霉素或对照实物和水。

行为测试.使用莫里斯水迷宫(在附加信息中有详细的方案)来测试空间学***台方面没有表现出任何缺陷，并且通过测试前所执行的一系列的神经行为任务确定它们没有感觉运动缺陷。所有组在测试前两天会通过含有水下(1cm)平台(12×12cm)的直水巷(15×200cm)来评价它们的游泳能力。Morris等人,2006所述的程序根据文献中所述来实施(Galvan等人,2006；Galvan等人,2008)。简单地说，J20小鼠在24.0±1.0℃的温度下，在装满通过加入无毒涂料而染白的不透明水的浅色桶中进行了一组6次试验，每次间隔1小时。试验方案的可见部分被用于测试非空间学***台(在水面以下1cm)，此平台以作为地标且位于水池的不同象限的彩色标杆进行标记。将动物放入水池中，使其面对水池的墙壁，每次试验中在不同的位置将其释放。每只动物被给予最长60秒去找到水下平台。如果在这段时间内没有找到平台，将会轻轻地引导此动物去找到平台。在平台上停留20秒后，将动物从水中取出并放置在干的笼子中。20分钟后，每只动物进行第二次试验，使用不同的释放位置。此过程重复进行直至每只小鼠都试验了6次，每次试验间隔大约20分钟。在试验方案中无提示的部分，离水池边缘大约30cm处用不透明的黑色板将水桶包围。四个带有黑白色几何设计的矩形图案被均匀地放置在面板上作为远端提示。如对于上述的提示训练所描述，动物每天在相同的程序下被训练去游6次，持续两天，从而通过训练去找到水下平台。在这6次试验之后紧接着进行1次探查试验，即将平台从水池中移走。在探查试验中，在被移走之前，每只小鼠都被允许游30秒。在原先含有平台的区域中所用的时间百分数，以及每只小鼠穿过平台原先位置的次数被确定为对平台位置记忆力的一个衡量标准。因为啮齿类动物善于游泳，且在水中时受到监视，因此他们不会溺水，并且从这个测试没有受到显著的不利影响。在测试过程中，每天都对小鼠进行监视，且每周记录它们的体重。在所有任务中的表现都通过基于计算机的视频跟踪***(Water2020,HVS Image,U.K)来进行记录。使用HVSImage对数据进行离线分析，并用微软的Excel进行处理。3xTg-AD小鼠的MWM测试在直径为1.5米的圆桶中实施，此桶被放置在具有附加迷宫线索的房间内。在训练期间，平台的位置(直径为14cm)对于每只小鼠都是固定不变的，且位于水面以下1.5cm，在整个测试期间水的温度都维持在25℃。在训练期间，小鼠一天进行四次试验，每次试验都是采用随机的出发点，且试验之间的时间间隔是25秒。如果小鼠在60秒内没有找到平台，研究员就会引导它去找到平台，并让它在那里停留10秒。探查试验是在最后一次训练试验结束24小时后实施。在探查试验期间，平台被移动，小鼠在桶内自由地游60秒。训练和探查试验是通过安装在天花板上的摄像机进行记录，且数据用EthoVisioXT跟踪***进行分析。

免疫印迹、Aβ测定和免疫组织化学.用前面13、25、26所描述的方法对组织进行处理和分析，并且在附加信息中对其进行详细描述。使用特异性ELISA来测量Aβ和τ。

3xTg-AD小鼠通过CO₂窒息法来处死。将其大脑取出并径向切成两半，并对组织进行处理，如所述(Oddo等人,2008)。用过量的异氟烷(isoflurane)将hAPP(J20)小鼠安乐死。将两个半脑速冻。一个半脑在液氮中被均化成匀浆，而另外一个半脑在免疫组织化学测定法中使用。关于Western印迹分析法，在还原条件下用SDS/PAGE(Invitrogen,Temecula,CA)解析来自hAPP(J20)和3xTg-AD的可溶性部分的蛋白质，并将其转移至硝酸纤维素或PVDF膜中。此膜在20℃下在5％的无脂乳溶液或5％BSA中培养1小时。在4℃与合适的一级抗体一起过夜温育后，在Tween20-TBS(T-TBS)(0.02％Tween20，100mMTris pH7.5；150nM NaCl)中对印迹洗涤20分钟，并在20℃与二级抗体一起进行温育。然后将印迹在T-TBS中洗涤3次，每次20分钟，然后与Super Signal(Pierce,Rockford,IL)一起温育5分钟，再次洗涤并暴露于膜中。使用先前所述的夹心式ELISA方案(Oddo等人,2005)对可溶性和不溶性部分中的Aβ40和Aβ42含量进行了测量。在文献所述(Galvan等人,2006)，在Tg hAPP(J20)半脑的胍匀浆中，用特异性ELISA分析法(Invitrogen,Carlsbad,CA)测定了hAPP(J20)小鼠中Aβ40和Aβ42的数量。

关于免疫组织化学法，将来自速冻大脑的10微米冻干切片后固定于4％三聚甲醛中，并用LC3特异性抗体(10μg/ml；Nous,Littleton,CO)染色，接着用结合AlexaFluor488的驴抗兔IgG(1:500；Molecular Probes,Invitrogen,CA)染色，并用表面荧光显微镜(Nikon Eclipse E800，具有FITC立方体)和使用488氩激光和505长通滤光片的激光扫描共焦显微镜(Zeiss LSM510)进行成像。图像使用20X和60X物镜获得。共焦图像的z堆叠使用LSM浏览软件(Zeiss)进行处理。Aβ和τ免疫组织化学分析是在50μm厚的切片中进行的，此切片的获得是采用振动切片***和标准试验方案。图像是使用Zeiss数码相机来获得的，并用ImageJ进行分析。

统计分析.使用GraphPad Prism(GraphPad,San Diego,CA)和StatView来进行统计分析。在双变量实验中，在双向ANOVA之后紧接着进行Bonferroni的事后检验，以用于评价组平均值之间的差异显著性。当分析两组以上的单变量实验时，平均值之间的差异显著性通过依次进行单向ANOVA与Tukey的事后检验来评估。使用学生t检验对两组之间的差异进行了评估。P＜0.05的值被认为是显著的。

结果

所进行的研究是为了确定雷帕霉素是否能预防或延缓年龄相关性疾病，如阿尔茨海默病。将补充有雷帕霉素的食物(其与延长小鼠寿命的食物(如实施例1中所述)是相同的)或对照食物喂食给3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠。在位于不同位置的两个独立实验室中测量功能性结果和生化结果。3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠以及适当的非转基因对照小鼠分别从6.5月龄和7月龄开始被治疗10周和12周。在治疗结束时，用莫里斯水迷宫(MWM)对学***台的先前位置的记忆力被恢复到一定程度，其与两种小鼠模型中非转基因小鼠的记忆力程度很难区分(图28B、28D)。这些数据合起来表明雷帕霉素治疗可以在两个独立的阿尔茨海默病小鼠模型中改善学***用22C11(一种N端特异性APP抗体)首先进行了测量。发现通过施用雷帕霉素，APP稳态水平没有发生显著改变(图29A、29C)。为了检查主要C端衍生物的稳态水平，用C端特异性APP抗体对蛋白质提取物进行了探测。结果表明，在两种转基因株系中C99和C83的水平在施用雷帕霉素后没有发生改变(图29A、29B、29D和29E)。这些结果表明，在任一个转基因小鼠中，雷帕霉素的施用皆没有改变APP的稳态水平或其加工。在治疗结束时，3xTg-AD和hAPP(J20)小鼠分别是8月龄和7月龄。在这个年龄，两种转基因小鼠显示出可溶性Aβ水平的上升，且3xTg-AD小鼠还显示出神经元内Aβ8、12、17的积累。先前研究已经表明在这个年龄的任一个转基因株系中细胞外Aβ沉积不明显(Hsia等人,1999；Oddo等人,2003)。当Aβ40水平保持不变时，发现在3xTg-AD小鼠脑中雷帕霉素使可溶性Aβ42水平显著地降低了32.78±6.68％，且在hAPP(J20)小鼠脑中降低了52.35±13.14％(图29F、29G、29H)。不溶性Aβ40和Aβ42的水平在两种转基因小鼠模型中都检测不到，这与之前的报道一致(Hsia等人,1999；Mucke等人,2000；Oddo等人,2003)。为了确定细胞内Aβ积累是否受雷帕霉素影响，被治疗和未被治疗的3xTg-AD小鼠大脑的海马切片用Aβ特异性抗体进行免疫染色。结果表明，与对照喂养的3xTg-AD小鼠相比，雷帕霉素喂养的3xTg-AD小鼠的海马中Aβ阳性神经元的数量显著地减少(图29H、29I)。除Aβ积累之外，3xTg-AD小鼠还出现了磷酸化和聚集的τ的年龄依赖性积累(Oddo等人,2003a；Oddo等人,2003b；Oddo等人,2007)。在8月龄时，3xTg-AD小鼠显示了可溶性τ物质的细胞体-树突积累，所述τ物质在CA1锥体神经元中在不同表位上被磷酸化。在施用雷帕霉素之后，使用抗τ抗体AT270和MC-1观察到τ免疫反应性的显著降低，所述AT270和MC-1分别识别在Thr181被磷酸化的τ和在τ中的构象变化(图30A、30B、30C、30D)。τ中的这些改变被认为在疾病过程的早期发生。当MC1阳性神经元在这个年龄的3xTg-AD小鼠的海马中变得明显时(图30E)，在雷帕霉素治疗的小鼠中没有检测到MC1阳性神经元(图30E、30F)。免疫组织化学数据也用Western印迹分析法进行了确认(图30G、30H)。为了更好地对τ的变化进行定量，我们用夹心式ELISA测量了可溶性和不溶性τ含量，并发现雷帕霉素选择性地降低了可溶性τ含量(图30I)。这些数据合起来表明8月龄的3xTg-AD小鼠中的早期τ病理现象在施用雷帕霉素后显著地减弱。Aβ和τ病理现象的减弱可能是由于Aβ和τ产量的下降或它们自身的降解增加。在此所列的数据表明雷帕霉素所调节的Aβ和τ含量的降低并不是由于它们产量的改变，因为C99/C83的稳态水平(分别来源于β-和α-分泌酶所参与的APP裂解)和τ转基因没有发生改变。

为了更好地理解雷帕霉素所调节的Aβ和τ病理现象减弱的基础机理，对一种主要的细胞降解路径----即自噬进行了测量。虽然自噬诱导的具体机理还在研究中，但目前的数据表明了一系列被认为是自噬相关蛋白(Atg)的蛋白质(Mizushima等人,1998)。两个自噬相关蛋白Atg5和Atg12之间形成共价复合物显示对于自噬诱导是至关重要的(Mizushima等人,1998；Suzuki等人,2001)。此复合物的形成由Atg7和Atg10来调节。自噬诱导也可以通过测量轻链3II(LC3-II)的含量来进行监控，此LC3-II在形成时被并入到自噬体膜中(Kabeya等人,2000)。研究发现，与喂食对照食物的小鼠相比，在用雷帕霉素治疗的转基因小鼠中Atg7和Atg5/Atg12复合物的含量显著地提高(图31A、31B、31C、31D、31E)，示出了自噬作用由雷帕霉素所调节的增加。自噬作用的增加进一步通过LC3-II总含量的显著提高(如Western印迹法所测定)和海马切片的LC3免疫反应性提高而得到了确认(图31A、31E、31F)。虽然我们不能排除其它机理可能与雷帕霉素所调节的Aβ和τ含量下降有关，但这些数据都支持，在两种动物模型中，在阿尔茨海默病之类的神经病理表型的改善中有自噬作用的参与。

Aβ含量的降低也可能有助于在3xTg-AD小鼠中所观察到的τ病理现象的改善，因为已经表明降低Aβ减弱了τ病理现象(Oddo等人,2008；Oddo等人,2006；Oddo等人,2004)。这些数据是与转基因小鼠的一则最近的报道相一致的，其表明降低自噬提高了Aβ水平，而提高自噬则降低Aβ水平(Pickford等人,2008)。这些来自两个独立实验室的结果表明，在两个显然不同的转基因阿尔茨海默病小鼠模型中，对于阿尔茨海默病之类的神经病理学的发展，雷帕霉素具有强烈的保护效应，并且恢复了丧失的记忆力。这些数据表明，在使用可以延长小鼠寿命的剂量时，雷帕霉素提高了自噬作用并且减弱了阿尔茨海默病病理。

实施例4

延迟发作的或不太严重的癌症有助于用肠道递送的雷帕霉素长期治疗的Het3 小鼠的寿命延长

关于用肠道递送的雷帕霉素进行长期治疗的Het3小鼠中mTORC1信号传导的新数据与延迟发作的或不太严重的癌症保持一致，这是导致寿命延长的一种机理。

由于癌症主要影响中位数年龄为68岁的人(Edwards等人,2002)，因此对于此疾病，老年个体处于更大的风险。鉴于此人口统计，从20月龄(相当于人的60岁)开始用雷帕霉素进行长期治疗在所测试的遗传异质小鼠中延长了寿命是有重要意义的；如实施例1中所述，癌症是主要死因。因此，用于预防此群体中临床上已有表现的癌症的技术是世界上癌症研究的一个目标。

关于临床应用，主要问题是在癌症预防方案中雷帕霉素或雷帕霉素类似物的长期应用可能导致Akt Ser463磷酸化作用的增加，这作为一种促生长刺激(综述于Guertin和Sabatini2009；Lane和Breuleux,2009)会抵消任何抑制效应。最近来自我们实验室的免疫印迹数据表明在长期的治疗环境中这种情况不会发生在正常的脂肪和骨骼肌中。为了进行说明，图32显示了内脏脂肪的免疫印迹分析结果，此内脏脂肪从食用含雷帕霉素食物5周的小鼠中解剖所得。作为对这种相对较短的治疗的回应，Akt Ser473磷酸化作用得到了显著诱导。

相比之下，用雷帕霉素治疗20个月的小鼠的内脏脂肪却没有显示出这种活化作用，且在雄性中此活化作用显著地降低(图33)。在骨骼肌中也有相同的趋势(图34)。

这些数据表明，用肠道递送的雷帕霉素进行长期治疗没有增加机体组织中Akt的肿瘤促进活化作用，而是可能使其降低。

如果应用肠道雷帕霉素的长期治疗延缓了癌症或降低了其严重性使得癌症要到非常晚年才在症状上表现出来，一种预测是被治疗的小鼠中mTORC1信号传导的生长促进潜力应该得到了抑制。在群组3的两只被监视的小鼠中，对两只患有肝细胞癌的雄性小鼠各自进行了分析，一只用雷帕霉素治疗，另一只是对照组。

图35显示了这两个肿瘤的免疫分析数据，其表明慢性肠道雷帕霉素通过mTORC1显著地抑制了Thr389的磷酸化作用。因此，此mTORC1效应分子的抑制作用强烈表明延迟发作的或不太严重的癌症是在食用雷帕霉素食物的小鼠中寿命延长的主要机理。这也与热量和生长因子(侏儒鼠)受限制的小鼠中的肿瘤反应是相一致的。总之，这些数据有力地支持以下概念，即在中等年龄的老年人中通过肠道递送的雷帕霉素来预防癌症表现是可行的。

*****

鉴于本公开书，本文所公开和要求保护的所有微胶囊、方法和试剂盒可在不进行不当实验的情况下制备和实施。虽然已经在优选实施方案中描述了本发明的微胶囊、方法和试剂盒，但对于所属领域技术人员明显的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下各种改变可被应用。更具体地说，明显的是，在化学和生理上相关的某些药剂可替代本文描述的药剂，同时仍可获得相同或类似结果。所属领域技术人员所了解的所有这些类似替代和修饰被认为处于随附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

在达到提供对本文所述内容进行补充的示例性程序细节或其它细节的程度上，以下参考文献以引用的方式特别并入本文。

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Claims (17)

1.雷帕霉素在制备用于治疗有需要的哺乳动物受试对象中年龄相关性疾病或阻止有需要的哺乳动物受试对象中年龄相关性疾病发作或延长有需要的哺乳动物受试对象寿命的医药组合物或保健组合物中的用途，其中所述组合物被包裹于包含水不溶性聚合物的包衣中，其中所述水不溶性聚合物是甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物。

2.权利要求1所述的用途，其中所述有需要的受试对象已知或疑似患有年龄相关性疾病。

3.权利要求1所述的用途，其中所述有需要的受试对象已知患有年龄相关性疾病。

4.权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含25重量％至60重量％的雷帕霉素，其中在施用所述组合物后受试对象中雷帕霉素的平均血液含量大于25ng/ml，并且其中所述受试对象是大于50岁的人。

5.雷帕霉素在制备用于在需要治疗腺瘤或延迟腺瘤发作或延长寿命的哺乳动物受试对象中治疗腺瘤或延迟腺瘤发作或延长寿命的医药组合物的制剂或保健组合物的制剂中的用途，其中所述哺乳动物对象具有以下一种或多种病症：所述哺乳动物受试对象已知处于患有腺瘤的风险；所述哺乳动物受试对象疑似处于患有腺瘤的风险；所述哺乳动物受试对象以前接受过显示腺瘤风险的疾病、病症或紊乱的治疗；所述哺乳动物受试对象具有与腺瘤风险相关的遗传风险因素；所述哺乳动物受试对象具有与腺瘤风险相关的环境风险因素；或所述哺乳动物受试对象具有与腺瘤风险相关的其它风险因素；

所述医药组合物的制剂或保健组合物的制剂包含雷帕霉素和水不溶性的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物的组合，所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物是热塑性的，所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物在pH值低于7时是稳定的，所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物能够保护雷帕霉素在所述哺乳动物受试对象的胃的酸性条件下不受损坏，并且所述甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物在所述哺乳动物受试对象的肠中的非酸性条件中是可溶的，从而允许在肠中吸收所述雷帕霉素，所述制剂被制备为口服施用给哺乳动物受试对象。

6.权利要求5的用途，其中所述制剂被制备为以每天至少一次的频率施用一段时间。

7.权利要求5的用途，其中，

所述制剂包含药物递送结构，所述药物递送结构包含核心，所述核心包含雷帕霉素；

所述核心在环境气氛条件下为固体形式；并且

多个所述核心以这样的方式被包含水不溶性的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物的包衣材料围绕，使得所述多个核心和围绕的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物包衣聚集在一起形成所述药物递送结构。

8.权利要求7的用途，其中所述药物递送结构具有小于约50微米的直径。

9.权利要求7的用途，其中所述药物递送结构包含至少5％重量的雷帕霉素。

10.权利要求7的用途，其中所述药物递送结构包含表面活性剂。

11.权利要求7的用途，其中

所述药物递送结构具有小于约50微米的直径；

所述药物递送结构包含至少5％重量的雷帕霉素；和

所述药物递送结构包含表面活性剂。

12.权利要求11的用途，其中所述哺乳动物受试对象是人受试对象。

13.权利要求12的用途，其中所述受试对象是大于50岁的人。

14.权利要求12的用途，其中对于所述人受试对象，在口服施用一定量的所述制剂后所观察到的雷帕霉素的平均血液含量的峰值大于12ng/ml。

15.权利要求11的用途，其中所述哺乳动物受试对象是动物受试对象。

16.权利要求15的用途，其中所述制剂包含食物或食物添加剂。

17.权利要求11的用途，其中所述制剂还包含亲水的、可溶胀的、水凝胶形成材料，其中所述组合物由包含水不溶性聚合物和亲水性水渗透性剂的包衣包裹。