CN104041831A - 一种牡丹肽软胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牡丹肽软胶囊及其制备方法，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份；所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末；所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取，并干燥的提取物；所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取，并干燥的提取物。本发明提供的软胶囊营养价值高，含有多种具有较好保健功能的活性成分，且牡丹肽分子量较小，分布均匀，最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收，具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性。
Description
技术领域
本发明属于保健品领域，主要涉及一种牡丹肽软胶囊及其制备方法。
背景技术
牡丹是我国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史，素有“国色天香”、“花中之王”的美称。牡丹全身是宝，牡丹花可供观赏，还可以制成牡丹花茶、牡丹花精油；牡丹根皮是传统中药“丹皮”；牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸，尤其是罕见的奇数脂肪酸，是一种具有重要开发价值的食用油脂来源通过脱皮后牡丹籽仁不仅含有脂肪、蛋白质等营养成分，还含有芍药苷，白芍苷，羟基芍药苷，羟基白芍苷等芍药苷类化合物。如何全发面开发利用牡丹将会是一个非常重要且任务艰巨的研究课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡丹肽软胶囊及其制备方法，该软胶囊营养价值高，含有多种具有较好保健功能的活性成分，且牡丹肽分子量较小，分布均匀，最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收，具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性。
本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份；
所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末；
所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取，并干燥的提取物；
所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取，并干燥的提取物。
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取油用牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水，用160-220目的研磨机研磨2-4遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %，保持温度为40-50 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min，在无菌空气下水解24-48 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量15-25倍的水，超声提取30-50min，收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇，混合后静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量3-5%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水，超声提取20-30min，然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5，再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇，混合静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取物1-3份和步骤三得到的牡丹花提取物1-3份，再取蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为65-75 ℃条件下搅拌20-30min，然后用180-220目研磨机研磨2-4次，在压力为20-30Mpa下均质1-2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
步骤一所述的混合蛋白酶是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2：0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。
本发明的有益效果
其一、本发明提供的牡丹肽软胶囊营养价值高，具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性，同时含有多种具有较好保健功能的活性成分，如芍药苷、白芍苷、羟基芍药苷、羟基白芍苷等芍药苷类化合物，具有较好的抗高血脂、抗血栓形成，扩张冠状动脉，增加冠脉流量，对抗急性心肌缺血，降低血压具有较好的疗效，另外还能够显著提高人的免疫力，抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿等。而且，充分利用复合蛋白酶来水解牡丹籽饼粕蛋白，制备得到的牡丹小肽分子量较小，分布均匀，最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收。
其二、本发明是以油用牡丹，主要是凤丹和紫斑牡丹牡丹籽仁为主要原料，同时充分利用牡丹籽壳、牡丹花等其它的牡丹原料资源，实现了牡丹资源的充分利用，不会造成任何牡丹资源的浪费，且本发明在制备过程对环境不产生有毒有害排放物，制备工艺简单，适合规模化生产。
具体实施方式
一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份；
所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末；
所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取，并干燥的提取物；
所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取，并干燥的提取物。
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取油用牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水，用160-220目的研磨机研磨2-4遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %，保持温度为40-50 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min，在无菌空气下水解24-48 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量15-25倍的水，超声提取30-50min，收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇，混合后静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量3-5%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水，超声提取20-30min，然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5，再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇，混合静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取物1-3份和步骤三得到的牡丹花提取物1-3份，再取蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为65-75 ℃条件下搅拌20-30min，然后用180-220目研磨机研磨2-4次，在压力为20-30Mpa下均质1-2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
步骤一所述的混合蛋白酶是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2：0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。
本发明中所述的牡丹籽为油用牡丹籽，主要有凤丹牡丹和紫斑牡丹等。在制备牡丹肽过程中，采用的过滤方法是板框过滤或者膜过滤，水解得到的牡丹肽分子量在200-5000道尔顿之间，且该牡丹肽具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等多种活性。
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉40份、牡丹籽壳提取物3份、牡丹花提取物1份、蜂蜡8份和牡丹籽油48份；
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取凤丹牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤4次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制8 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量20倍的水，用160-220目的研磨机研磨4遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为9.6，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为1.2%，所述的混合蛋白酶是指重量比为1:1.2:1.2：1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物，保持温度为50 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min，在无菌空气下水解48 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量25倍的水，超声提取50min，收集提取液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积6倍的无水乙醇，混合后静置6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/4，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量5%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的15倍的水，超声提取30min，然后将提取液浓缩至原体积的1/5，再向浓缩液中加入体积6倍的无水乙醇，混合静置6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/4，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物，再取蜂蜡和牡丹籽油，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为75 ℃条件下搅拌30min，然后用220目研磨机研磨4次，在压力为20-30Mpa下均质2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
实施例2：
一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉30份、牡丹籽壳提取物1份、牡丹花提取物3份、蜂蜡3份和牡丹籽油63份；
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取紫斑牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量10倍的水，用160-220目的研磨机研磨2遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6 %，所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8:0.8：1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物，保持温度为40 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为100r/min，在无菌空气下水解24 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量15倍的水，超声提取30min，收集提取液并浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混合后静置3h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量3%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10倍的水，超声提取20min，然后将提取液浓缩至原体积的1/4，再向浓缩液中加入体积4倍的无水乙醇，混合静置3h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物，再取蜂蜡和牡丹籽油，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为65℃条件下搅拌20min，然后用180目研磨机研磨2次，在压力为20-30Mpa下均质1次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
实施例3：
一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉35份、牡丹籽壳提取物2份、牡丹花提取物2份、蜂蜡5份和牡丹籽油56份；
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取凤丹牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.0的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制7min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量15倍的水，用190目的研磨机研磨3遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为8.6，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.9 %，所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8:1.0：0.6：0.6的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物，保持温度为45 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为150 r/min，在无菌空气下水解36 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量20倍的水，超声提取40min，收集提取液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积5倍的无水乙醇，混合后静置5h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/4，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量4%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的13倍的水，超声提取25min，然后将提取液浓缩至原体积的1/4，再向浓缩液中加入体积5倍的无水乙醇，混合静置5h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/4，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物，再取蜂蜡和牡丹籽油，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为70 ℃条件下搅拌25min，然后用200目研磨机研磨3次，在压力为20-30Mpa下均质2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌18秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
实施例4：
一种牡丹肽软胶囊，所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉35份、牡丹籽壳提取物2份、牡丹花提取物2份、蜂蜡4份和牡丹籽油63份；
所述的牡丹肽软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取油用牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量10倍的水，用160-220目的研磨机研磨4遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.8 %，所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:1.0:0.8：1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物，保持温度为50 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min，在无菌空气下水解48 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量15倍的水，超声提取30-50min，收集提取液并浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混合后静置6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量5%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10倍的水，超声提取20min，然后将提取液浓缩至原体积的1/5，再向浓缩液中加入体积5倍的无水乙醇，混合静置4h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物，再取蜂蜡和牡丹籽油，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为70℃条件下搅拌25min，然后用200目研磨机研磨3次，在压力为20-30Mpa下均质2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
活性测试试验
1. 抗肿瘤活性研究
1) 试验材料
胎牛血清，96孔培养板，恒温箱，RPM1640培养液。
2)方法
对上述实施例中得到的牡丹肽进行细胞毒活性测试，采用的方法为MTT法。
3)试验步骤
(1) 取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培养液，制成单细胞悬液5×104个/mL，将该悬液加到96孔培养板中，每孔加入1×104个细胞。培养24 h后，加入受试牡丹肽浓度分别为30 μg/mL、10 μg/mL。
(2) 将平板在37 ℃，含5%CO2空气及100%湿度的恒温箱中孵育3天，去除培养液。
(3) MTT用无血清的RPM1640培养液配成1 mg/mL溶液，每孔加100 μL，37℃温育4 h，使MTT还原为甲臢。
(4) 吸出上层清液，加入150 μL DMSO使甲臢溶解，于ELISA仪570 nm处测OD值。
4)试验结果
表1 牡丹肽细胞毒活性实验数据(n=3)
2. 抗氧化活性研究
1) 试验材料
牡丹肽粉末(制备方法见实施例1)。
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、无水乙醇、双氧水、2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、盐酸(HC1)均为分析纯，大豆卵磷脂(>90%)。
2)方法
(1) 清除超氧阴离子自由基(O
-
2
·)的测定方法
用pH8.0、浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度，各取1.5mL不同浓度牡丹肽溶液，然后依次加入0.5mL NBT (300μmol/L，以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制)，0.5mL NADH (468 μmol/L，以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制)，0.5mL PMS (60μmol/L，以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制)，混匀后在25℃中水浴5分钟，取出在波长560 nm处测定吸光度，空白对照组以缓冲液代替芪类溶液。
E(O- 2·)(%)=(1－)×100 (1)
式中：E(O- 2·)为牡丹小肽对O- 2·的清除率(%)；A1为芪类吸光度；A0为空白吸光度。
(2)清除DPPH 自由基的测定方法
将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度，各取2 mL上述浓度的溶液于试管中，再加入2 mL浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液，混合均匀，反应20分钟，3500 r/min离心分离10分钟，取上清液在波长517 nm处测其吸光度为Ai；另各取2mL上述浓度的牡丹肽溶液于试管中，分别加入无水乙醇2 mL，反应20分钟，3500 r/min离心分离10分钟，取上清液在波长517nm处测其吸光度为Aj；以2 mL 0.04 mg/mL DPPH 和2 mL无水乙醇反应作为参比，其吸光度记为A0。
E(DPPH)(%)=(1－)×100 (2)
式中：E(DPPH)为牡丹肽对DPPH自由基的清除率(%)；A0为2mL DPPH溶液+2mL 无水乙醇的吸光度；Ai为2mL DPPH溶液+2mL牡丹肽溶液的吸光度；Aj为2mL无水乙醇+2mL牡丹肽的吸光度。
(3)清除羟自由基(·OH)的测定方法
将牡丹肽用双蒸水配制成不同浓度梯度，各取2mL上述浓度的溶液，依次加入2mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2，混匀后静置10分钟，再加入2mL 6 mmol/L水杨酸，混匀，静置30分钟，在波长510 nm处测其吸光度记为Ai，当用双蒸水代替水杨酸时的吸光度记为Aj。空白对照组以双蒸水代替牡丹肽溶液吸光度记为A0。
E(·OH)(%)= (1－)×100
式中：E(·OH)为羟自由基的清除率(%)；Ai为牡丹肽反应的吸光度；A0为空白吸光度；Aj为无水杨酸参加反应时芪类的吸光度。
3)结果
(1) 清除超氧阴离子自由基(O2 -·)
表2 牡丹肽清除超氧阴离子自由基(O2 -·)活性(%)
由表2可知，在所选质量浓度范围内，牡丹肽化合物具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着质量浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强，呈现量效关系，总体效果比BHT一致。
(2) 清除DPPH 自由基
表3牡丹肽清除DPPH 自由基活性
DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，对其清除的效果表明受试药物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。由表3可知，牡丹肽化合物表现出很强的清除DPPH自由基的能力。
(3) 清除羟自由基(·OH)
表4 牡丹肽清除羟自由基(·OH)活性
羟基自由基是最强的氧化剂，在生物体内几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害很大。由表4可知，牡丹肽清除·OH效果和BHT相比稍弱一些。
Claims (3)
1.一种牡丹肽软胶囊，其特征在于：所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成：牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份；
所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末；
所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取，并干燥的提取物；
所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取，并干燥的提取物。
2.如权利要求1所述的一种牡丹肽软胶囊的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、牡丹肽的制备
1）取油用牡丹籽原材料，脱壳后收集牡丹籽壳，并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min，得到牡丹籽仁，备用；
2）将步骤1）得到的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水，用160-220目的研磨机研磨2-4遍，得到牡丹籽浆液，备用；
3）用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2）得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6，然后加入培养成熟的混合蛋白酶，并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %，保持温度为40-50 ℃，控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min，在无菌空气下水解24-48 h，水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活，过滤除渣，经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉，备用；
步骤二、牡丹籽壳提取物的制备
取步骤一收集的牡丹籽壳，加入其重量15-25倍的水，超声提取30-50min，收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5，得到浓缩液，备用；向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇，混合后静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹籽壳提取物，备用；
步骤三、牡丹花提取物的制备
取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料，加入其重量3-5%的食盐，揉捻后采用水蒸气蒸馏，向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水，超声提取20-30min，然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5，再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇，混合静置3-6h，过滤，将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，喷雾干燥，即得到牡丹花提取物，备用；
步骤四、牡丹肽软胶囊的制备
按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取物1-3份和步骤三得到的牡丹花提取物1-3份，再取蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份，备用；先向混合釜内加入牡丹籽油，然后边搅拌边加入牡丹肽粉，牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡，搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物，并在温度为65-75 ℃条件下搅拌20-30min，然后用180-220目研磨机研磨2-4次，在压力为20-30Mpa下均质1-2次，在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20秒，得到混合底料，备用；将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中，即完成牡丹肽软胶囊的制备。
3.如权利要求2所述的一种牡丹肽软胶囊的制备方法，其特征在于：步骤一所述的混合蛋白酶是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2：0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。
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