CN104041412B - 一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法,包括如下步骤:取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体进行消毒;将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到丛生芽;将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株;将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗;取完整的带根苗进行炼苗后移植于石灰岩土壤生长一个半月,再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高,可在短期内提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗,对贵州半蒴苣苔资源保护和可持续利用具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法,特别是一种贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法。
背景技术
贵州半蒴苣苔,为苦苣苔科植物贵州半蒴苣苔(Hemiboeacavalerieivar.paucinervisW.T.Wang&Z.Y.Li)。多年生草本。茎上升,无毛,不分枝或分枝,花期8—10月,果期10-12月。分布于我国广西、广东、福建、湖南等省。生于山谷林下石上,海拔250-1500m。全草入药,微酸、涩,凉。清热解毒。用于治疗痈、烫伤、跌打损伤、刀伤出血,腹水。
贵州半蒴苣苔花色褐紫色或淡绿色,具有较高的园林观赏和一定的药用价值,一般生于山谷林下石上或阴处,林缘沟旁或岩石上、沟边石缝中,石灰岩山地阴湿处,对环境要求比较苛刻,加之近年来环境资源遭到严重破坏,使贵州半蒴苣苔植株数量大大减少。
发明内容
本发明的目的是采用生物技术组织培养方法,有效快速地提高贵州半蒴苣苔种苗的繁殖速度和质量,在短期内就能提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗。
本发明采取的技术方案是:
1、一种组织培养快速繁殖方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体,依次用2%洗洁***溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-15min、添加了2-3滴吐温-20的100ml0.1%升汞消毒7-9min、无菌水冲洗3-5次,最后用灭菌滤纸吸去表面水分,剪成长约1cm长的外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水,
(2)顶芽分化获得丛生芽培养:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天,顶芽分化后获得丛生芽,其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA(萘乙酸)、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,
(3)丛生芽继代培养:将步骤(2)中得到的试管苗不定芽置于MS增殖培养基中,在培养温度23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12小时/天的条件下培养20-25天得到完整的健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.0-2.0mg/L的6-BA(苄氨基腺嘌呤)、0.5-1.0mg/L的NAA、0.5-1.0mg/LKT(激动素),25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,
(4)丛生芽生根培养:将步骤(3)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含1.0-1.5mg/L的IAA(吲哚乙酸)、0.5mg/L的ABT(生根粉)、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,
(5)炼苗与移栽:步骤(4)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内散射光照射2-4天,打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,表面角质形成后将苗取出,洗净根部培养基,立即移栽到通风良好且弱光石灰岩土壤中,在石灰岩土壤中生长一个半月后移栽大田。
采用生物技术组织培养技术,不仅可以有效快速地提高贵州半蒴苣苔种苗的繁殖速度和质量,且采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高,对贵州半蒴苣苔资源保护和可持续利用具有重要价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
一种贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体,依次用2%洗洁***溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-20min、添加了2-3滴吐温-20的100ml0.1%升汞消毒7-9min、无菌水冲洗3-5次,最后用灭菌滤纸吸去表面水分,剪成长约1cm长的外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水,
(2)顶芽分化获得丛生芽快速繁殖:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12h/d的条件下培养25-30天,顶芽分化后获得大量丛生芽,其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,数据分析发现6-BA,NAA对贵州半蒴苣苔丛生芽增殖倍率具有显著影响,根据生长率指标确定的最适培养基激素浓度为1.5mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA,此时贵州半蒴苣苔顶芽分化倍率为5.72。
表1不同激素对顶芽分化效果的影响
注:芽增殖倍数=(30天后芽数-接种时芽数)/接种时芽数
(3)丛生芽壮苗培养:将步骤(2)中得到的试管苗不定芽置于MS增殖培养基中,在培养温度23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12小时/天的条件下培养20-25天得到完整的健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.0-2.0mg/L的6-BA、0.5-1.5mg/L的NAA、0.1-0.4mg/LKT,25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,观察发现,壮苗培养基中6-BA浓度增加,贵州半蒴苣苔植株的高度增加长势趋好,培养基中添加0.2mg/L的KT、2.0mg/L的6-BA和1.5mg/L的NAA壮苗效果最好,壮苗指数达到5.75,而且经过壮苗后得到的植株叶片舒展,适合进行生根培养;
表2不同激素水平对贵州半蒴苣苔丛生芽壮苗效果的影响
注:壮苗指数=[茎粗(cm)/株高(cm)+培养基上质量(g)/培养基下质量(g)]*全株质量
(4)丛生芽生根培养:将步骤(3)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-26℃,光照强度1500lux,光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含1.0-1.5mg/L的IAA、0.5mg/L的ABT、25-30g/L蔗糖和4.0-4.4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;观察发现,培养基中IAA浓度增加,组培苗的生根率也增加;培养基中添加1.0mg/L的IBA和1.5mg/L的IAA生根效果最好,生根率达100%,平均根长达到4.68cm;
表3不同激素水平对贵州半蒴苣苔组培苗生根效果的影响
(6)炼苗与移栽:获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内散射光照射2-4天,打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,表面角质形成后将苗取出,洗净根部培养基,立即移栽到通风良好且弱光的石灰岩及沙土壤(1:1)基质中,在石灰岩及沙土壤中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内,每天早8点到晚6点喷雾3-5次,每次10min,此后每天早8点、晚6点各喷雾1次,每次10min;移栽时温度条件为18-28℃,相对湿度75-80%,遮阳率60%。
Claims (2)
1.一种贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体,依次用2%洗洁***溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-20min、添加2-3滴吐温-20的100ml0.1%升汞消毒7-9min、无菌水冲洗3-5次,最后用灭菌滤纸吸去表面水分,剪成长约1cm长的外植体;
(2)顶芽分化获得丛生芽培养:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-26℃、光照强度1500lux、光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天,顶芽分化后获得丛生芽,其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)丛生芽壮苗继代培养:将步骤(2)中得到的试管苗不定芽置于MS壮苗继代培养基中,在培养温度23-26℃、光照强度1500lux、光照时间为10-12小时/天的条件下培养20-25天得到完整的健壮植株,其中MS壮苗继代培养基中含1.0-2.0mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、0.5-1.0mg/LKT,25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)丛生芽生根培养:将步骤(3)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-26℃、光照强度1500lux、光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含1.0-1.5mg/L的IAA、0.5mg/L的ABT、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(5)炼苗与移栽:步骤(4)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内散射光条件下照射2-4天,打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,表面角质形成后将苗取出,洗净根部培养基,立即移栽到通风良好且弱光的石灰岩土壤中,在石灰岩土壤中生长一个半月后移栽大田。
2.如权利要求1所述的贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法,其特征在于:所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
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