CN104034271B - 一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于该方法设计了一种双臂干涉显微***。该***能够将参考反射面与被测物的像呈现在统一位置,从而使其发生干涉。干涉所形成的光谱或条纹可以映射出被测点处的光程差。被测物下方安装有压电驱动的旋转/扫描平台,可以实现1nm精度的横向扫描和360度旋转。通过差分采集方法,可以获得超高分辨率一维方向上的光程投影。然后对样品进行旋转,采集多个角度下样品的光程投影,可以重构出三维超高分辨率图像。
Description
技术领域
本发明涉及超高分辨率显微检测技术,特别是指一种基于迈克耳逊干涉仪结构,具有旋转映射超高分辨率成像的检测技术。
背景技术
显微成像技术在电子科技、生物医学、化学材料等领域有着广泛的应用。随着科学技术的发展,人们对显微分辨率的要求也是越来越高。但是传统的光学显微分辨率会受到衍射极限的限制,只能够实现亚微米级的分辨率,无法满足科技发展的应用需要。
为了解决光学显微镜衍射极限的问题,科研人员开发出了一系列的超高分辨率显微***。电子显微镜是目前应用最为广泛的超高分辨率显微镜,它采用电子束替代光束,对样品进行成像。由于电子束的波长远小于可见光的波长,从而可以实现更高的分辨率。但是电子显微镜所使用的电子束对细胞有严重的伤害,并且环境必须在近似真空状态,所以不能够对活细胞进行观察,这严重限制了电子显微镜在生物医学领域的应用。
扫描探针显微镜是另外一种超高分辨率显微镜。扫描探针显微镜利用压电平移台的位移分辨率替代光学***的成像分辨率,实现高分辨率的电扫描成像。扫描探针显微镜已经演化出原子力显微镜,扫描电子显微镜等多种类型,但是这类显微镜需要非常长的扫描时间,不适合对动态样本的检测。
光学显微镜方面也有相关突破衍射极限的技术方法。如20世纪20年代末提出,在20世纪80年代才得以实现的近场光学显微镜,采用纳米光纤探针,通过控制在波长尺寸近距离接触范围采集衍射光信号,实现了30nm左右的超分辨率光学扫描成像。又如本世纪初发展的“随机光学重建显微法”、“光激活定位显微技术”等,这类方法使用局部成像的原理,在一次成像中只特定激活图像中的一部分像素,以防止像素之间的串扰,可以实现20-30nm的超分辨率扫描成像。但是,这类方法为了实现像素的分批点亮,样品必须使用荧光处理,而荧光标记则会对生物样品产生一定的毒性,且使整个检测过程大大复杂化。以上方法均需要非常长的检测时间才能获得一幅图像,不适合用于动态样本的检测。
此外,还有椭圆偏振仪、白光干涉仪等仪器已经能够在纵向实现纳米水平的超高分辨率。这类仪器利用光自身的干涉或偏振实现了纳米水平的分辨率,但其动态测量范围只有几百纳米,并且这个分辨率仅能体现样品表面厚度的变化,而无法提供更高的横向分辨率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于是在一个包括动态样品在内的样品表面厚度干涉映射检测***中按以下步骤实现的:
步骤(1),构造一个光学干涉结构,通过旋转被测样品,把干涉厚度测量的纵向分辨率映射解析成横向分辨率,用于实现三维超高分辨率成像的干涉旋转映射检测***,其中包括:光源(1)、准直镜(2)、分束镜(3)、第一物镜(41)、第二物镜(42)、计算机(5)、成像透镜(6)、探测器件(7)、电动旋转/平移三维运动载物台(8)、以及反射镜(9),其中:
光源(1)是激光或其它白光光源,
分束镜(3)是平面镜、二向色镜或棱镜中的任何一种,
第一物镜(41),位于长度可调的测量臂臂端,
第二物镜(42),位于长度可调的参考臂臂端,
探测器件(7),采用白光作光源时为光谱仪,采用激光作光源时为CCD器件,所述探测器件(7)的输出端与所述计算机(5)相连,
电动旋转/平移三维运动载物台(8),简称载物台(8),位于所述第一物镜(41)正下方,用于安装表面附着有被测样品的微载体芯片,所述载物台(8)为三层嵌套结构,外层为电机驱动运动平台,中间为压电晶体驱动运动平台,内层为旋转扫描平台,微载体芯片固定在内层旋转扫描平台上,所述载物台(8)在所述计算机(5)的控制下,完成对所述微载体芯片上被测样品的扫描和旋转,以获得被测样品所有空间各点的全光谱信息;
光源(1)发出的光经所述准直镜(2)准直成平行光后垂直入射到所述分束镜(3)上,分成透射光和反射光;所述透射光经所述第一物镜(41)汇聚到所述微载体芯片上,被反射回来后再经过所述第一物镜(41),被准直成平行光,发送到所述分束镜(3),被反射到所述成像透镜(6)上后汇聚成物光;所述反射光经所述第二物镜(42)准直成平行光后,被所述反射镜(9)反射,然后再经所述第二物镜(42)准直成平行光,再经过所述分束镜(3)透射后,由所述成像透镜(6)汇聚成参考光;所述物光和参考光相干叠加被所述探测器件(7)接收,然后发送到所述计算机(5),形成干涉高分辨率光谱,简称高光谱;
步骤(2),所述一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其实现步骤如下:
步骤(2,1),调整测量臂和参考臂成相同光程长度,使物光和参考光发生干涉;
步骤(2,2),所述计算机(5)控制所述载物台(8),调节到水平位置,打开所述光源(1),获得被测样品的高光谱;
步骤(2,3),在所述计算机(5)控制下,所述载物台(8)绕水平轴旋转,寻找出反射光强极大值点的旋转角度α,获得在所述旋转角度α下被测样品的干涉高光谱;
步骤(2,4),对步骤(2,3)得到的所述干涉高光谱,进行微载体芯片高光谱干涉厚度编码/解码数值求解,计算出被测样品在旋转角度α下的径向厚度信息ρ;
步骤(2,5),按照下式计算被测样品在旋转角度α下的映射纵向坐标y和横向坐标x:
x=ρ×Cosα,
y=ρ×Sinα;
步骤(2,6),通过径向厚度分辨率Δρ,按照下式计算出被测样品在旋转角度α下的映射纵向分辨率Δy和横向分辨率Δx:
Δx=Δρ×Cosα,
Δy=Δρ×Sinα。
本发明提供的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于所述微载体芯片高光谱干涉厚度编码/解码方法,通过数值求解计算厚度,测量径向或纵向厚度分辨率可以达到1nm;其特征还在于所述干涉高分辨率光谱适合所有两个波面部分或全部相干叠加的任何干涉结构装置产生的干涉光谱或干涉条纹。
无论使用何种方法获得样品厚度的一维分布图,均可以通过旋转载物台获得多个角度拍摄的厚度一维分布图。将这些厚度一维分布图综合起来,利用Radon变换方法即可实现二维平面成像和断层信息,利用多角度干涉高光谱可以重构还原出三维表面形貌信息,利用频谱编码法将纵向分辨率映射到横向分辨率,二维、三维重建图的分辨率与一维分布图的分辨率一致,具有1nm超高分辨率的特点。
本发明提供的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于所述被测样品为生物分子、非生物分子、细胞、组织、病毒、微生物、细菌、微加工结构和纳米材料中的任何一种。
附图说明
图1宽带光超分辨率显微装置结构示意图
图2激光超分辨率显微装置结构示意图
图3像面差与干涉条纹的映射关系图
图4相位差分值与光程差变化量的映射关系图
图5角度覆盖度、角度分辨率与最后重建图像之间的关系
图6干涉旋转映射实现纵向分辨率向横向分辨率转换的极值原理
图7干涉旋转映射方法还原三角形纳米结构的示例
图8干涉旋转映射实现纵向分辨率向横向分辨率转换的一般原理
具体实施方式
1、***装置结构
现通过测量铝箔纸表面形貌的实验具体说明该方法的实施方式。本发明提供了一种如图1和图2所示高光谱显微***,其中包括光源1、准直镜2,分束镜3,参考臂物镜42,测量臂物镜41,成像镜6、探测器件7、旋转/平移载物台8、反射镜9和计算机5。旋转/平移载物台8使用压电晶体驱动实现nm分辨率平移,旋转台使用涡轮蜗杆传动。光源选用白光时探测器件7需要使用光谱仪7a,光源选用激光时探测器件7需要使用CCD7b。参考臂或测量臂的长度可以调节。
具体到各个部件,***的宽带光源可采用宽带卤钨灯,电功率250W,光通量9000流明,光谱范围400nm–2500nm。光用光纤耦合,传导到准直透镜上方,出射光由准直透镜准直后输入到***中。激光光源采用半导体激光器,波长650nm(或其它波长),光功率50mW,经过准直透镜变换成平行光后输入到***中。
***使用平场无限远镜头,数值孔径0.60,工作距离3.7-2.7mm;目镜焦距800nm。镜头放大倍数61.5×。物镜固定在电动升降架上,以便电动对焦。
***旋转/平移载物台8包括平移台和旋转台两部分,其中所使用的平移台为双层嵌套结构,外层为电机驱动平台,内层为压电驱动平台。电机驱动平台的步长分辨率为6μm,压电驱动平台的步长分辨率为2nm,带有闭环伺服控制。旋转台固定在压电驱动平台上。
2、光程检测方法
***使用宽带光源或激光光源照明。采用不同的光源时,需要使用不同的光程检测方法,才能准确检测被测物表面厚度的变化。
当使用宽带光源时,参考像与测量像会在光谱域内发生干涉,需要使用光谱仪作为采集器件。光谱仪的光谱响应范围要求为0.2-1.1μm或更宽,可以全面覆盖紫外-可见光-红外波段。当参考像与测量像之间的光程差较小时,干涉光谱的频率较低;当参考像与测量像之间的光程差较大时,干涉光谱的频率较高。而细微的光程差变化则会体现为相位的变化。如图1所示,相位变化与光程差的变化基本成线性关系,所以可以通过差分累计方法得到样品厚度的一维分布图。
当使用激光光源时,参考像与测量像会产生干涉条纹,需要使用CCD作为接收器件。CCD采集到如图2所示的,由像面位置差导致的明暗条纹。当测量臂上的样品厚度变薄或变厚时,对应点处的光程会变短或变长,这种光程的变化最终会导致干涉向内或者向外缩放。圆环每变化一个周期,对应表明光程差变化了一个波长。将干涉圆环与标准圆环相减,可以得到等高线的差值。差值与光程变化线性相关。根据条纹的变化可以推测出当前测量点处的平均光程变化。同样通过差分累计方法可以得到样品厚度的一维分布图。同理,当载物台倾斜时,测量面与参考面之间会形成一个固定的角度。若两个平面都严格平整,当载物台移动时,干涉条纹也应该匀速运动。而当测量面不平整时,干涉条纹的运动会形成速度变化,通过检测该速度变化,同样可以得到样品厚度的一维分布图。
使用时,首先将参考臂和测量臂调节成相同长度,使参考像(如图3中波面11)和测量像(如图3中波面12)能够叠加(如图3中波面13)成功发生干涉,形成干涉光谱或干涉条纹(如图3中圆形干涉条纹14)。使用光谱仪或者CCD采集到干涉光谱或干涉条纹。干涉光谱与光程差的关系为:
设参考点厚度为d0,测量点厚度变化量为dΔ,即测量点厚度值为d0+dΔ。当厚度变厚时,光谱会向红端发生漂移。变化前的光谱如图4中曲线21所示,而变化后的光谱则如图4中曲线22所示。当厚度发生变化时,变化前与变化后的光程差为:
对λ积分,消去λ变量,得:
式(3)可以拆分为三项乘积:
式(4)不含Δ,可以看作一个常数。式(5)中,dΔ相比d0非常小,故可以忽略不计,从而这一项也可看作一个常数,将这两个常数的积记为常数C,即:
式(6)是关于dΔ的一个函数,计为M(dΔ),将其与式(7)一并代入式(3),化简为C·M(dΔ)。由于M(dΔ)的解析解过于复杂,故可求其数值解,结果如图4中曲线23所示,左图中21对应厚度变化前的反射光谱,22对应厚度变化后的反射光谱。从图4右图曲线23可知,厚度变化量与测量值在50nm范围内成近似线性的关系,厚度测量的分辨率可以达到1nm。配合压电平台的一维扫描,该方法可以得到一维直线上各点处的光程信息。由于衍射现象的存在,该方法中的像素与像素之间可能会出现混叠。如图4所示,该方法的光谱差分量与厚度变化量之间成近似线性的关系,所以可以利用相邻像素之间的差值计算出相邻差分量,进而计算出表面形貌对应的光程信息。
3、重构方法
获得一维厚度信息后,通过载物台对样品进行旋转,获得另一个投影方向上的光程投影信息。载物台多次旋转,即可获得多个角度下的光程信息。该信息共有三种重构方法:
1.用Radon变换还原出断层信息。
2.用多角度重构方法还原出三维表面形貌信息。
3.用频谱编码法从纵向分辨率映射出横向分辨率。
用Radon变换还原断层信息的具体方法如下。由于每一个角度的光程投影信息中都包含有整个扫描面中部分的断层信息,样品多次旋转后,将该投影信息与光程信息绘制到同一张正弦图中。根据CT成像的原理,正弦图满足中心切片定理,可以使用反Radon变换从正弦图中还原出截面图,具体方法包括滤波反投影或卷积反投影两种。
滤波反投影的具体方法是:
1.将每个投影方向的投影信号g(R)取出;
2.将g(R)信号进行傅立叶变换(可使用快速傅立叶变换或其它等效变换方法)得到频域信号;
3.将变换后的频域信号乘上|ρ|,其中ρ为半径r傅立叶变换后对应的变量;
4.对各个角度下经过第3步处理后的投影信号再次使用傅立叶变换,将信号量变换回空域;
5.按照各自的角度,将处理后的空域信号反投影形成重建结果。
卷积反投影的具体方法是:
1.将每个投影方向的投影信号g(R)取出;
2.将g(R)信号R-L滤波函数或S-L滤波函数进行卷积。其中R-L函数的表达式为:
(其中ρ0为截止频率)
S-L函数的表达式为:(其中ρ0为截止频率)
3.按照各自的角度,将处理后的信号反投影形成重建结果。
根据Radon变换的原理,重建出图像的分辨率由纵向分辨率,扫描分辨率及旋转分辨率共同决定。重建图像的分辨率与角度覆盖度和角度分辨率之间的关系如图5所示,(a)为角度覆盖度与重建分辨率之间的关系,随着角度的增大,重建分辨率逐渐提高,在140°左右已经非常清晰无畸变;(b)为角度分辨率与重建分辨率之间的关系,随着角度细分量的增大,重建分辨率逐渐提高,在1-2°左右已经非常清晰无畸变。从图中可以看出,该方法经过频域变换后的分辨率对应于图像在极坐标图中的径向分辨率,而旋转的角度间隔对应角度分辨率。如果旋转的角度足够精细,重建的图像的横向分辨率可以达到与径向分辨率相同的水平,从而突破衍射极限的限制。
用多角度重构方法还原出三维表面形貌信息的具体方法如图6所示,(a)对应原始波面,(b)为反射光强最大的角度对应的波面,(c)为反射光强最大的角度对应的极大值位置波面,(d)为(c)中所有反射光强最大的角度对应的极大值位置波面的连线,即为重建后的波面形貌。首先旋转载物台,选出若干反射光强最大的角度(如图6中的α、β、γ、δ)。将载物台分别旋转至该角度,并进行一维扫描,获得该角度下的反射光强信息和光程差信息。利用此信息分别绘制出如图6中曲线1所示的一维反射光强曲线。然后在反射光强曲线中寻找出极大值点,并在极大值处计算该点处的光程(如图6中曲线2所示)。将光程长度绘制在光强的极大值位置中(如图6中曲线3所示)中,重构时,针对每个角度,将其标注光程的线段(如图6中的3、4、5、6)旋转过各自的角度(如α、β、γ、δ),得到旋转后的平面位置(如图6中的7、8、9、10)。最后,将所有平面位置连接,即可还原被测物的断面形貌(如图6中11所示)。
在图6中,不同旋转角度所对应的线段用不同的线型来表示)。旋转平台转过不同的角度,寻找到反射光强最大的若干个角度,并计算其光程差,该光程差可以表示该角度下反光面与参考面的距离,既可以通过极值方法获得,也可以通过差分方法获得。重构时,首先确定一个重构图像的圆心点,然后用连续线段依次描绘其形貌。其中,反射光的强度正比于线段长度,光程正比于线段与圆心点的距离。每个角度绘制一个线段,最终将这些线段连接起来,即可还原被测物的断面形貌。
为了更好地说明多角度重构方法,这里通过实例解析边长23nm的正三角形纳米微结构来演示该算法的还原过程。假设物镜的数值孔径为0.60,其在空气中的孔径角为74度。旋转时,旋转角度与反射光强度的关系如图7(a)所示。寻找出其中的反射角极大值点,图7(a)中,极大值点为-60度点与+60度点;然后将载物台翻转到这两个角度,如图7(b)中,b1翻转了-60度,b2翻转了60度;在这两个角度下进行横向扫描。横向扫描时记录下光程差和反射光强如图7(c)所示。将扫描处光强达到阈值以上的部分—即图7(c)中c1和c2部分—标记为有效位置,并记录下该点处的光程,然后将有效位置的光程标记在如图7(d)所示的重构面图中,如图7(d)中d1、d2所示。最后将d1转过-60度,d2转过60度,然后合成,得到如图7(e)所示的样品切片形貌。
采用多角度重构方法,光程检测到的厚度变化对应于重构图像的径向分辨率,精度优于2nm,通过极坐标系向笛卡尔坐标系的转换,从径向分辨率Δρ和光强极值位置对应的角度θ可以映射出笛卡尔坐标系的纵向分辨率Δy和横向分辨率Δx:
Δy=Δρ×Sinθ (10)
Δx=Δρ×Cosθ (11)
举例说明,公式(7)获得的径向分辨率Δρ为2nm,如光强极值位置对应的角度θ为60度,则其X方向分辨率可达到1nm。
用频谱编码法将纵向分辨率映射到横向分辨率,要求使用宽带照明,解析式使用傅立叶变换处理光谱,获得光谱的频率信息,如图8所示。从图8(a)可以看出,光程差越大,反射光谱的频率越高;光程差越小,反射光谱的频率越低。将图8(a)中物体旋转α角,并将反射光的光谱横轴用波数表示后,进行傅立叶变换可以得到如图8(b)中所示的频谱,每个频率点代表一个厚度,如图8(b)中频谱峰值1、2、3分别对应物体1、2、3的干涉频谱。利用载物台的旋转功能实现纵向分辨率到横向分辨率的转换,具体步骤如下:
1.将载物台旋转过一定的角度,使参考面与测量面之间形成α的夹角;
2.用光谱仪测量反射光谱,并将光谱变换到波数域;
3.将反射光谱进行傅立叶变换,获得各个频率分量幅值信号;
4.由于反射光谱的频率与光程差成正比,从而可以从频率中解析出不同纵向位置的像素信息;
5.由于测量面与参考面之间夹角的存在,可以通过纵向位置推算出横向位置:
(其中x位横向位置,y为纵向位置)
x=y/tanα (12)
因此,当旋转角度不同时,可以获得不同的横向分辨率。当旋转角度达到或者超过α时,横向分辨率可以达到或超过纵向分辨率,从而实现横向的超分辨率成像。
Claims (7)
1.一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于是在一个包括被测样品在内的干涉旋转映射检测***中按以下步骤实现的:
步骤(1),构造一个光学干涉结构,通过旋转被测样品,把干涉厚度测量的纵向分辨率映射解析成横向分辨率,用于实现三维超高分辨率成像的干涉旋转映射检测***,其中包括:光源(1)、准直镜(2)、分束镜(3)、第一物镜(41)、第二物镜(42)、计算机(5)、成像透镜(6)、探测器件(7)、电动旋转/平移三维运动载物台(8)、以及反射镜(9),其中:
光源(1)是激光或其它白光光源,
分束镜(3)是平面镜、二向色镜或棱镜中的任何一种,
第一物镜(41),位于长度可调的测量臂臂端,
第二物镜(42),位于长度可调的参考臂臂端,
探测器件(7),采用白光作光源时为光谱仪,采用激光作光源时为CCD器件,所述探测器件(7)的输出端与所述计算机(5)相连,
电动旋转/平移三维运动载物台(8),简称载物台(8),位于所述第一物镜(41)正下方,用于安装表面附着有被测样品的微载体芯片,所述载物台(8)为三层嵌套结构,外层为电机驱动运动平台,中间为压电晶体驱动运动平台,内层为旋转扫描平台,微载体芯片固定在内层旋转扫描平台上,所述载物台(8)在所述计算机(5)的控制下,完成对所述微载体芯片上被测样品的扫描和旋转,以获得被测样品所有空间各点的全光谱信息;
光源(1)发出的光经所述准直镜(2)准直成平行光后垂直入射到所述分束镜(3)上,分成透射光和反射光;所述透射光经所述第一物镜(41)汇聚到所述微载体芯片上,被反射回来后再经过所述第一物镜(41),被准直成平行光,发送到所述分束镜(3),被反射到所述成像透镜(6)上后汇聚成物光;所述反射光经所述第二物镜(42)准直成平行光后,被所述反射镜(9)反射,然后再经所述第二物镜(42)准直成平行光,再经过所述分束镜(3)透射后,由所述成像透镜(6)汇聚成参考光;所述物光和参考光相干叠加被所述探测器件(7)接收,然后发送到所述计算机(5),形成干涉高分辨率光谱,简称高光谱;
步骤(2),所述一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其实现步骤如下:
步骤(2.1),调整测量臂和参考臂成相同光程长度,使物光和参考光发生干涉;
步骤(2.2),所述计算机(5)控制所述载物台(8),调节到水平位置,打开所述光源(1),获得被测样品的高光谱;
步骤(2.3),在所述计算机(5)控制下,所述载物台(8)绕水平轴旋转,寻找出反射光强极大值点的旋转角度α,获得在所述旋转角度α下被测样品的干涉高光谱;
步骤(2.4),对步骤(2.3)得到的所述干涉高光谱,进行微载体芯片高光谱干涉厚度编码/解码数值求解,计算出被测样品在旋转角度α下的径向厚度信息ρ;
步骤(2.5),按照下式计算被测样品在旋转角度α下的映射纵向坐标y和横向坐标x:
x=ρ×Cosα,
y=ρ×Sinα;
步骤(2.6),通过径向厚度分辨率Δρ,按照下式计算出被测样品在旋转角度α下的映射纵向分辨率Δy和横向分辨率Δx:
Δx=Δρ×Cosα,
Δy=Δρ×Sinα。
2.如权利要求1所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于步骤(2)中所述微载体芯片高光谱干涉厚度编码/解码方法,通过数值求解计算径向厚度,测量径向厚度分辨率Δρ达到1nm。
3.如权利要求1或2所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于用Radon变换还原出断层信息。
4.如权利要求1或2所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于用多角度干涉高光谱重构还原出三维表面形貌信息。
5.如权利要求1或2所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于用频谱编码法将纵向分辨率映射到横向分辨率。
6.如权利要求1所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于所述干涉高分辨率光谱适合所有两个波面部分或全部相干叠加的任何干涉结构装置产生的干涉光谱或干涉条纹。
7.如权利要求1所述的一种横向分辨率达到1nm的干涉旋转映射检测方法,其特征在于所述被测样品为生物分子、非生物分子、细胞、组织、病毒、细菌、微加工结构和纳米材料中的任何一种。
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