CN104031927A - 一种与香稻香气含量相关的基因OsPRO及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了与香稻香气含量相关基因OsPRO及其编码蛋白的应用。所述基因OsPRO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；基因OsPRO编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述应用是指基因OsPRO及其编码蛋白在改善香稻香气含量上应用。本发明发现导入该基因的香稻的香气含量明显增加，并明确了OsPRO基因增加香稻香气含量的机制，可以将香稻OsPRO基因***到植物表达载体的多克隆位点，制备成重组表达载体，进一步构建转基因植物。本发明对生产上培育浓香型的香稻品种，以及通过转基因的方法调控香稻的香气含量具有很大的指导应用价值。

Description

一种与香稻香气含量相关的基因 OsPRO 及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种与香稻香气含量相关的基因OsPRO及其编码蛋白的应用。

背景技术

香稻通常称作香米，是水稻中的珍品，香稻米富含各种微量元素、氨基酸和蛋白质。尤其是八种必须氨基酸的含量很丰富，表现出优良的营养品质。现今市场上销售价高、米质好的名牌米都掺有香米，香米不仅具有食用意义，而且有很高的经济价值（游晴如和黄庭旭．稻米香味的研究与育种利用．福建稻麦科技，2003，20 (3)：30-33）。尽管香米的销售价格比常规优质米高2倍多，但世界香米的消费量仍在逐年增长，已引起世界各稻米生产国科研人员的高度重视。所以近年来，印度、巴基斯坦、日本、韩国、泰国、澳大利亚、中国台湾省、南非和孟加拉国等，正在加强香稻品种的选育进程，以便抢占国际香稻交易市场（谢黎虹等．泰国的香稻．中国农业信息，2004， (8) ：16-17）。

近年来随着人民生活水平的不断提高，我国对香米的需求量逐年增加引起我国对香稻研究的重视。特别是加入WTO后大米是我国粮食中唯一在贸易自由化过程中受益的产品，从发展趋势看，我国将是优质米市场的最主要受益者（杨庚．我国优质稻米开发现状与发展．中国稻米，2001，(5)：11-12），因此抓住机遇开发香稻生产，提高种稻效益，对富国强民具有重要的现实意义。鉴于香稻具有较高的食用价值和极好的市场走向，十分有必要开展香稻香气的研究，以提高我国稻米在国际稻米市场的竞争力，推进我国水稻产业化，增加农民经济收入。

宋文昌等认为控制香稻香气性状的是单隐性基因（宋文昌等．同源四倍体和二倍体水稻香味的遗传分析．作物学报，1989，15(3)：273～277）。任光俊等分析了 Scented lemont等香稻品种的遗传特点，结果表明，无香味为显性性状，并表现胚乳直感现象（任光俊和李青茂．水稻香味的遗传．四川农业大学学报，1994，12(3)：392-395）。顾铭洪等认为米香味受一对隐性主基因控制，有一些微效基因参与作用，在某些组合中表现出剂量效应（顾铭洪．谷类作物品质性状遗传研究进展．南京：江苏科学技术出版社，1990，93-99）。同时，有的研究者指出因香稻品种差异，控制香味的基因型存在差别，香稻品种间存在非等位的香味基因（Berner and Hoff. In heritance of Scent in American longgra in rice. CropSci. 1986，26(5)：876-878）。之所以出现对香气遗传的不同意见，可能在于对F1的含义理解不一，香稻品种的不同香气成份、香气的感官鉴别不准确，导致遗传推断上的偏差（汤圣祥．水稻育种学．北京：中国农业出版社，1996，337-339）。

如何在保证香稻产量和品质的基础上，提高我国香稻米的香气含量，目前正成为我国香稻育种和栽培科研人员和生产者所面临的难题。大多数学者一致认为2-乙酰-1-吡咯啉（2-Acetyl-1-pyrroline，简称2-AP）是香稻香气的主要成分（Giovanni et al. Identification of microsatellite markers for fragrance in rice by analysis of the rice genome sequence. Molecular Breeding, 2002,9：245-250；Sugunya et al.Effects of drying methods and storage time on the aroma and milling quality of rice(Oryza sativar L.) cv. Khao Dawk Mali 105. Food Chemistry, 2004, 87: 407-414）。有人推测香稻可能含有一种促进2-乙酰-1-吡咯啉生物合成的变性酶，且单个香味基的复等位基因可以稍微改变这种酶，致使产生不同香味浓的水稻品种，代谢途径各种附加步骤的改变是由复合香味因引起的（Pinson和谢国禄．六个水稻品种的香味遗传．国外作物育种，1995，(1)：1-3）。然而，关于2-AP 在香稻体内是怎样形成的研究甚少。前人对泰国香米KDML105的研究则发现，当提取液中存在较多的脯氨酸、鸟氨酸和谷氨酸时，2-AP的含量增加，并随着脯氨酸的增加，2-AP的含量是对照的3倍多（Tadashi Y., Nguyen T., and Hideo I. Precursors of 2-Acetyl-1-pyrroline, a Potent Flavor Compound of an Aromatic Rice Variety. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50：2001-2004）。示踪实验结果表明，2-AP的氮源来自于脯氨酸，所以他认为脯氨酸是2-AP合成的主要前体物质，其次为谷氨酸和鸟氨酸（Jin et al. Tagging of a gene for aroma in rice by R2-APD and RFLP(Ⅱ). Acta agriculture Zhejiang gensis, 1996,8 (1)：19-23）。目前为止，还没有关于脯氨酸到2-AP合成过程和机制的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有水稻脯氨酸氧化酶OsPRO功能研究的不足，提供一种与香稻香气含量相关的基因OsPRO在改善香稻香气含量中的应用。

本发明的目的是提供一种与香稻香气含量相关的蛋白OsPRO在改善香稻香气含量中的应用。

本发明另一目的是提供一种对香稻香气含量进行改造的方法。

本发明再一目的是提供一种制备香气改善型转基因水稻的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了与香稻香气含量相关的基因OsPRO及与香稻香气含量相关蛋白OsPRO在改善香稻香气含量中的应用。

所述基因OsPRO的cDNA全长序列如SEQ ID NO：1 所示；所述OsPRO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

与香稻香气含量相关蛋白OsPRO在制备改善香稻香气含量药剂中的应用，也在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种对香稻香气含量进行改造的方法，是将基因OsPRO转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；所述基因OsPRO的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

本发明还提供了一种制备香气改善型转基因水稻的方法，包括如下步骤：

S1.构建表达载体

S11.利用SEQ ID NO：3所示引物OsPRO-F和SEQ ID NO：4所示引物OsPRO-R，以水稻cDNA为模板进行PCR扩增，回收、定量、连接到相同双酶切的植物表达载体中；

S12.连接产物经过透析膜透析后（以除去盐离子），转化DH10B感受态细胞；

S13.用双酶切检测，得到含有OsPRO基因的阳性植物表达载体；

S2.转化愈伤组织

S21.利用农杆菌介导的方法，将上述含有OsPRO基因的植物表达载体转化水稻成熟胚的愈伤组织；

S22.转化后的愈伤组织经过预分化、分化，得到转化植株。

S3.阳性的转基因植株鉴定

利用SEQ ID NO：5所示引物1和SEQ ID NO：6所示引物2，对S22所述转化植株进行PCR鉴定，得到阳性转基因植株；

S4.纯合子的筛选

将S3所述阳性转基因植株进行培育繁殖，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA，通过Southern Blot检测***基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后将种子发芽后利用潮霉素进行筛选，存活下来的即为纯合子。

优选地，步骤S11所述植物表达载体为pCAMBIA1380、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121。更优选地，所述植物表达载体为pCAMBIA1380；步骤S11所述双酶切为HindIII和MluI酶切。

优选地，S11所述连接的反应体系总体积为10μL，于连接仪中反应3h左右，按照下列程序连接：10℃ 3 min，16℃ 3 min，18℃ 1 min；17个循环，65℃灭活 5 min。

S21所述转化的方法如下：

（1）将上述含有OsPRO基因的植物表达载体转化农杆菌EHA105感受态细胞，验证正确后，菌液-80℃保存。

（2）从保存在-80℃冰箱中的农杆菌菌株EHA105的菌液中挑取少量菌于YM培养基平板上划线培养（EHA105所用的抗生素为Kan和Chl）。置于28℃的培养箱中培养至长出单菌落。

（3）挑选单菌落4～5个于150µL液体培养基中混匀，在YM培养基平板上涂平板。培养1天后，刮下适量菌，置于含100µmol/L AS的30mL的NB液体培养基中进行恒温培养（28℃，180rpm），测得OD₅₅₀nm值为0.5～0.6即可用于愈伤组织的侵染。

（4）将准备好的愈伤组织浸入菌液20min，用无菌滤纸吸干菌液后转移到垫有无菌滤纸的培养皿中，25℃，光下干燥1天，转移到固体共培养培养基上（在培养基表面铺一张无菌滤纸），25℃，黑暗条件下培养3天之后，将共培养的愈伤组织转移至筛选培养基上，每两周筛选一次，筛选两次。

所述固体共培养培养基配方为：MS培养基的大量元素+ B5培养基的微量元素+B5培养基的有机成分+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+麦芽糖/蔗糖30g/L+明胶0.24%(w/w)+2,4-D 2mg/L +乙酰丁香酮100µmol/L，pH5.5。

所述筛选培养基配方为：N6培养基的大量元素+B5培养基的微量元素+B 5培养基的有机成分+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖30g/L+明胶0.28%(w/w)+脯氨酸500mg/L+2,4-D 2.5mg/L+200mg/L头孢唑林钠+200mg/L羧苄西林钠+Hyg 50mg/L，pH5.8。

其中，MS培养基的大量元素为：

1900mg/L 硝酸钾(KNO₃)+1650mg/L 硝酸铵(NH₄NO₃)+170mg/L 磷酸二氢钾(KH₂PO₄)+370mg/L 硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)+440mg/L 氯化钙(CaCl₂·2H₂O)。

B5培养基的微量元素为：

0.75 mg/L KI+3.0 mg/L H₃BO₄+1.0 mg/L MnSO₄·4H₂O+2.0 mg/L ZnSO₄·7H₂O+0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O+0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O+0.025 mg/L CuSO₄·5H₂O。

B5培养基的有机成分为：

100 mg/L肌醇+1.0 mg/L烟酸+1.0 mg/L盐酸吡哆醇+10 mg/L盐酸硫铵。

N6培养基的大量元素为：

2830 mg/L硝酸钾(KNO₃) +463 mg/L硫酸铵(NH₄SO₄)+166 mg/L氯化钙(CaCl₂·2H₂O) +185 mg/L硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)+ 400 mg/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)。

S22所述预分化、分化的方法为：

从筛选培养基上挑选1～2mm生长良好、结构致密的、淡黄色的抗性愈伤组织（除去褐化部分），在含有1～2层无菌滤纸的培养皿上，25℃，光照条件下，干燥处理1天，然后把它转置分化培养基上分化，此时，抗性愈伤组织会大量的增殖，并有绿点产生，待分化出的幼苗长到3～4cm左右，把它转置生根壮苗培养基上培养，待幼苗长出大量的根系，苗约8～10cm时，取出幼苗，洗净培养基，移栽到室外。

所述分化培养基配方为：N6培养基的大量元素+B5培养基的微量元素+B5培养基的有机成分+1mg/L NAA+3mg/L BA+30g/L蔗糖+20g/L山梨醇+200mg/L羧苄西林钠+200mg/L头孢唑林钠+Hyg 50mg/L+0.28% 明胶，pH5.8。

所述生根壮苗培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+3mg/L多效唑+15g/L蔗糖+0.3% 明胶+200mg/L羧苄西林钠+200mg/L头孢唑林钠+ Hyg50mg/L，pH5.8。

其中，1/2MS是指：950mg/L 硝酸钾(KNO₃)+825mg/L 硝酸铵(NH₄NO₃)+85mg/L 磷酸二氢钾(KH₂PO₄)+185mg/L 硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)+220mg/L 氯化钙(CaCl₂·2H₂O)+0.415mg/L 碘化钾(KI)+3.1mg/L 硼酸(H₃BO₃)+11.15mg/L 硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)+4.3mg/L 硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)+0.125mg/L 钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)+0.0125mg/L 硫酸铜(CuSO₄·5 H₂O)+0.0125mg/L 氯化钴(CoCl₂·6H₂O)+18.65mg/L 乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA)+13.9mg/L 硫酸亚铁(Fe₂SO₄·7H₂O)+50mg/L 肌醇+1mg/L 甘氨酸+0.05mg/L 盐酸硫胺素(VB1)+0.25mg/L 盐酸吡哆醇(VB6)+0.25mg/L 烟酸(VB5或VPP)。

优选地，S3所述PCR的扩增条件为：94 ℃ 2 min；94℃ 30 sec，58 ℃ 30 sec，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。

另外，携带有本发明的水稻基因OsPRO的植物表达载体还可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

此外，使用本发明的基因OsPRO构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因（如GUS基因、荧光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除秀剂基因）等。

本发明通过大量的研究和探索，成功地制备出过量表达OsPRO基因的转基因水稻，并通过实验发现，该转基因水稻的PRO活性以及稻谷中香气（2-AP）的含量均明显增加。明确了OsPRO基因与香稻香气含量的关系和作用机制，为香稻育种提供了理论指导，具有非常大的理论和实践价值。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了与香稻香气含量相关基因OsPRO及其编码蛋白的应用。所述基因OsPRO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示；基因OsPRO编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。本发明明确了OsPRO基因能够增加香稻香气含量，对生产上培育浓香型的香稻品种，调控香稻的香气含量具有很大的指导应用价值。

本发明的香稻OsPRO基因可以***到植物表达载体的多克隆位点，制备成重组表达载体，进一步构建转基因植物。实验结果表明，转OsPRO基因植株表现为香稻香气（2-AP）含量增加，OsPRO蛋白及其编码基因对调控香稻香气（2-AP）的含量有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsPRO基因转入不同的香稻品种中以培育更加理想的香稻栽培品种，或调节OsPRO基因的表达获得相应的香稻香气（2-AP）含量的水稻品种。OsPRO蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

本发明也明确了OsPRO基因编码的OsPRO蛋白（脯氨酸氧化酶）增加香稻香气含量的机制，其中在脯氨酸氧化酶的作用下，脯氨酸转化为吡咯啉-5-羧酸，这是脯氨酸转化为2-AP的第一步，也是必经的一步，更加丰富了香稻香气含量的影响机制，为香稻品种的研究和培育提供更丰富的途径和靶点。

附图说明

图1为水稻OsPRO基因的扩增电泳图；泳道M为分子量标记DL2000 plus（购自TAKARA）；泳道1～3为目的基因。

图2为过表达OsPRO基因的转基因水稻的PRO活性的测定结果；WT为野生型水稻云粳优14； Line6为过表达OsPRO的水稻转基因植株。

图3为过表达OsPRO基因的转基因水稻香气（2-AP）含量的测定结果；WT为野生型水稻云粳优14； Line6为过表达OsPRO的水稻转基因植株。

图4为脯氨酸氧化酶影响水稻香气（2-AP）含量的机制。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例 1 香稻 OsPRO 基因的获得

1、引物设计

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的关于OsPRO同源基因的cDNA序列设计引物，引物序列如下：

OsPRO-F（如SEQ ID NO：3所示，下划线为限制性内切酶HindIII识别位点）

5’ -ACTTGGAAGCTTCAGGCACAAGTCCGACCTTC- 3'；

OsPRO-R（如SEQ ID NO：4所示，下划线为限制性内切酶MluI识别位点）

5' -AATATCACGCGTTTACCGGAGCAGCTGTCTGT- 3'。

2、PCR扩增

以粳稻品种云粳优14号2周的幼苗叶片cDNA为模板，使用引物OsPRO-F1和OsPRO-R1进行PCR扩增OsPRO基因。PCR扩增为常规方法。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1428bp左右的DNA片段（如附图1所示）。将该片段纯化回收后，克隆到pMD18-T载体（购自TAKARA公司）上，获得pMD18-T-OsAT1载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序得到OsPRO基因cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白OsPRO的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在OsPRO基因DNA两端引入了合适的酶切位点HindIII和MluI。

实施例 2 遗传转化鉴定目的基因的功能

本实施例通过构建过表达OsPRO基因的转基因水稻，研究其PRO活性以及稻谷中香气（2-AP）的含量变化，来探讨OsPRO基因对香稻香气含量的影响及其机制。

1、构建表达载体

将OsPRO基因克隆入植物过表达载体pCAMBIA1380（购自澳大利亚CAMBIA公司）多克隆位点的HindIII和MluI酶切位点之间，得到含有OsPRO基因的植物表达载体。

（1）表达载体的构建

OsPRO-F和OsPRO-R引物分别引入了HindIII和MluI两个酶切位点，在组成型载体pCAMBIA1380上也有单一的HindIII和MluI酶切位点，因此利用引物OsPRO-F和OsPRO-R，以粳稻品种云粳优14号2周的幼苗叶片cDNA为模板进行PCR扩增，用试剂盒回收相应的OsPRO全长目的片段，再经定量、连接到相同酶酶切的pCAMBIA1380载体中，连接反应体系总体积为10μL，于连接仪中反应3h左右，按照下列程序连接：10℃ 3 min，16℃ 3 min，18℃ 1 min；17个循环，65℃灭活 5 min。

取连接产物于透析膜上透析约半小时，以除去盐离子，转化DH10B感受态细胞。连接后装载完的质粒选用HindIII和MluI双酶切检测后，可以看出切出了相应大小的片段约1.4Kb左右，至此证实了OsPRO超表达重组载体已成功构建。

2、转化愈伤组织

利用农杆菌介导的方法，将上述含有OsPRO基因的植物表达载体转化粳稻品种云粳优14号的成熟胚的愈伤组织，方法参考文章Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J, 1994, 6(2): 271-282。

具体的转化过程如下：

（1）将上述含有OsPRO基因的植物表达载体转化农杆菌EHA105感受态细胞，验证正确后，菌液-80℃保存。

（2）从保存在-80℃冰箱中的农杆菌菌株EHA105的菌液中挑取少量菌于YM培养基平板上划线培养（EHA105所用的抗生素为Kan和Chl）。置于28℃的培养箱中培养至长出单菌落。

（3）挑选单菌落4～5个于150µL液体培养基中混匀，在YM培养基平板上涂平板。培养1天后，刮下适量菌，置于含100µmol/L AS的30mL的NB液体培养基中进行恒温培养（28℃，180rpm），测得OD₅₅₀nm值为0.5～0.6即可用于愈伤组织的侵染。

（4）将准备好的愈伤组织浸入菌液20min，用无菌滤纸吸干菌液后转移到垫有无菌滤纸的培养皿中，25℃，光下干燥1天，转移到固体共培养培养基上（在培养基表面铺一张无菌滤纸），25℃，黑暗条件下培养3天之后，将共培养的愈伤组织转移至筛选培养基上，每两周筛选一次，筛选两次。

所述YM培养基和NB液体培养基配方参照本领域常规配方。

所述固体共培养培养基配方为：MS培养基的大量元素+ B5培养基的微量元素+B5培养基的有机成分+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+麦芽糖/蔗糖30g/L+明胶0.24%(w/w)+2,4-D 2mg/L +乙酰丁香酮100µmol/L，pH5.5。

所述筛选培养基配方为：N6培养基的大量元素+B5培养基的微量元素+B 5培养基的有机成分+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖30g/L+明胶0.28%(w/w)+脯氨酸500mg/L+2,4-D 2.5mg/L+200mg/L头孢唑林钠+200mg/L羧苄西林钠+Hyg 50mg/L，pH5.8。

（5）转化后的愈伤组织预分化、分化

从筛选培养基上挑选1～2mm生长良好、结构致密的、淡黄色的抗性愈伤组织（除去褐化部分），在含有1～2层无菌滤纸的培养皿上，25℃，光照条件下，干燥处理1天，然后把它转置分化培养基上分化，此时，抗性愈伤组织会大量的增殖，并有绿点产生，待分化出的幼苗长到3～4cm左右，把它转置生根壮苗培养基上培养，待幼苗长出大量的根系，苗约8～10cm时，取出幼苗，洗净培养基，移栽到室外。

所述分化培养基配方为：N6培养基的大量元素+B5培养基的微量元素+B5培养基的有机成分+1mg/L NAA+3mg/L BA+30g/L蔗糖+20g/L山梨醇+200mg/L羧苄西林钠+200mg/L头孢唑林钠+Hyg 50mg/L+0.28% 明胶，pH5.8。

所述生根壮苗培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+3mg/L多效唑+15g/L蔗糖+0.3% 明胶+200mg/L羧苄西林钠+200mg/L头孢唑林钠+ Hyg50mg/L，pH5.8。

转化后的愈伤组织经过预分化、分化，得到16株转化植株。

3、阳性的转基因植株鉴定

对上述16株转化植株进行PCR鉴定， PCR引物序列如下：

引物1：（如SEQ ID NO：5所示）

5’- GACGAAGCTGCCATGGAAAG-3'；

引物2：（如SEQ ID NO：6所示）

5’- AGCTGCCCGGACTCGACGTT -3’；

PCR扩增条件为：94 ℃ 2 min；94℃ 30 sec，58 ℃ 30 sec，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。

结果显示，16株转化植株全部为阳性。

4、纯合子的筛选

将上述经过PCR鉴定为阳性的转基因植株进行培育繁殖，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA，通过Southern Blot检测***基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合。

5、转基因水稻中PRO活性以及稻谷中香气（2-AP）的含量变化

（1）PRO活性测定

选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻云粳优14种子萌发后，利用木村B营养液（调pH为4.8）培养水稻至4叶期，取样测定水稻叶片中PRO活性的含量。

所述木村B营养液的具体配方为：(NH₄)₂SO₄ (0.365mM)， KH₂PO₄ (0.182 mM)，KNO₃ (0.183 mM)，K₂SO₄ (0.086 mM)，Ca(NO₃)₂ (0.366 mM)，MgSO₄ (0.548 mM)，EDTA-Fe^Ⅲ (0.020 mM)，MnCl₂ ^.4H₂O (0.091×10^-3 mM)，ZnSO₄ ^.7H₂O (0.77×10^-3 mM)，CuSO₄ ^.5H₂O (0.32×10^-3 mM)，H₃BO₃ (0.0462 mM)，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ ^.4H₂O (0.145×10^-3 mM)。

叶片PRO活性测定方法如下：

S1.准确称取水稻叶片材料0.2 g加入适量的液氮研磨成碎末，分次加入总量为3 mL的提取液（pH7.4 0.1 mol▪L^-1磷酸钾缓冲液，0.5% (v/v) triton X-100），继续研磨成匀浆，4℃，3000 r▪min^-1离心10 min，上清液既为脯氨酸氧化酶液。

S2.于离心管中，依次加入0.3 mL反应体系（pH8.0 0.1 mol▪L^-1磷酸钾缓冲液，0.5% (v/v) triton X-100；15 mmol▪L^-1脯氨酸），0.15 mmol▪L^-1细胞色素C 20 μL，0.20 mL酶提取液；在37℃水浴中反应30 min。

S3.加入0.5 mL 10%三氯乙酸中止反应，再加入0.4 mL 0.5% α-氨基苯甲醛（溶解在95%的乙醇中）进行显色，反应30 min后，9000 r▪min^-1离心10 min，在440 nm下比色。

（2）香气（2-AP）含量的测定

待转基因稻米收获干燥后贮藏3个月，测稻谷中的香气（2-AP）含量。稻谷中香气（2-AP）含量的测定方法如下：

S1.利用同时蒸馏萃取仪进行蒸馏萃取，在同时蒸馏萃取仪一端烧瓶放入50 g糙米和145 mL蒸馏水，100℃加热蒸馏，另一端烧瓶放入50 mL***，40℃加热蒸馏，循环蒸馏90 min。

S2.由漏液处取出***萃取液，用无水硫酸钠去水过滤，减压蒸馏至2 mL，过0.2 µm滤膜。

S3.取1 mL于1.5 mL样品瓶中，加入0.2 ppm的2，4，6-三甲基嘧啶作为内标，进行气质测定。

气质测定的条件为：

GC-MS：Shimadzu 2010 plus；

色谱柱：RESTEK Rxi-5ms 长度为30 m，内径0.32 mm，膜厚0.25 μm，进样口温度220℃，载气为He气2 mL·min^-1，离子源：EI，70 eV，350 V；扫描质量：30～160。

升温程序：40℃保持1 min，以2℃/min升温到65℃保持1 min，以10℃/min升温到220℃保持10 min。

6、结果显示，过表达OsPRO基因的转基因植株为阳性植株。转基因植株的PRO活性较野生型提高了3倍多（如附图2所示）。稻米收获干燥贮藏3个月后，测得转基因稻谷中香气（2-AP）的含量是野生型的2倍之多（如附图3所示）。

通过以上实验，我们确定了OsPRO基因的表达能够增加香稻香气的含量，同时也明确了OsPRO基因影响香稻香气含量的机制是OsPRO基因通过参与脯氨酸到2-AP的合成过程，影响水稻中香气（2-AP）的含量。

实施例 3 OsPRO 基因影响香稻香气物质 2-AP 的合成机制

1、发明人经过大量的研究，探索出了OsPRO基因影响香稻香气含量的具体机制，如附图4所示，其中，OsPRO基因编码的OsPRO蛋白（脯氨酸氧化酶）发挥了至关重要的作用，在脯氨酸氧化酶的作用下，脯氨酸转化为吡咯啉-5-羧酸，这是脯氨酸转化为2-AP的第一步，也是必经的一步。

2、发明人通过将OsPRO基因RNAi沉默，构建转基因水稻

（1）载体构建

根据 SEQ ID NO：1的序列设计引物，引物序列如下：

OsPRO-RNAi-F（如SEQ ID NO：7所示，下划线为限制性内切酶BamHI识别位点）

5'-ATAGTAGGATCCGACGAAGCTGCCATGGAAAG-3'；

OsPRO-RNAi-R（如SEQ ID NO：8所示，下划线为限制性内切酶HindIII识别位点）

5'-ATATACAAGCTT AGCTGCCCGGACTCGACGTT-3'

以水稻cDNA为模板，进行PCR扩增。

分两步完成组成型RNA干涉载体和目的片段的装载过程：

RNA干涉载体pRNAi由华南农业大学刘耀光研究员馈赠，RNA干涉载体pRNAi的构建参照（胡旭霞，刘耀光. 植物ＲＮＡ干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用. 分子植物育种，2006. 5 (4): 621-626）。

S1.用BamHI和HindIII两种限制性内切酶分别双酶切上述的特异PCR产物和RNA干涉载体pRNAi，再经回收、定量、连接。反应体系总体积为10μL，于连接仪中反应3h左右，按照下列程序连接：10℃ 3 min，16℃ 3 min，18℃ 1 min；17个循环，65℃灭活 5 min。取连接产物于透析膜上透析约半小时，以除去盐离子，然后电激转化TOP10感受态细胞。

S2.将S1验证连接成功的质粒用MluI和PstI双酶切之后，回收，用作载体；而***子则来源于用引物RNAi-MluI和 RNAi-PstI对S1连接成功的质粒作PCR扩增的产物；按1：3摩尔比混合载体和***子，然后连接、转化DH10B感受态细胞。

所述引物RNAi-MluI和 RNAi-PstI是 RNA干涉载体pRNAi的BamHI和HindIII两侧的通用引物，序列如下：

RNAi-MluI（如SEQ ID NO：9所示，下划线为限制性内切酶MluI识别位点）

5’- GAGAACGCGTGGTACCCTTGACCATGGTAG -3’

RNAi-PstI（如SEQ ID NO：10所示，下划线为限制性内切酶PstI识别位点）5’- AACTACTGCAGGGCCCTCAGATCTACCATGGTC -3’

（2）载体表达

参照实施例例2中的2和3步骤。

（3）PRO活性、2-AP含量测定方法同实施例2。

吡咯啉-5-羧酸含量的测定方法如下：

参照Wu等(2009))的方法测定吡咯啉-5-羧酸的含量，具体如下：

S1.准确称取水稻叶片材料0.5 g加入适量的液氮研磨成碎末，分次加入总量为4 mL的提取液（PH 8.0 50mM Tris-HCl），继续研磨成匀浆，4℃，3000 r/min离心10 min，上清液既为脯氨酸氧化酶液。

S2.于离心管中，依次加入0.20 mL酶提取液，500 μL 10%质量比的三氯乙酸（TCA），125 μL 40 mM 2-氨基苯甲醛，室温下保持30min，8000rpm 离心10min，于440nm测定，摩尔消光系数为2.58 mM⁻¹·m⁻¹。

测定结果如表1所示。

表1

本试验所有数据分析均采用Excel软件对原始数据进行标准化处理，然后用SPSS 19.0软件进行统计分析。各平均数的多重比较采用最小显著差数法（LSD），比较结果采用字母标记法标记，相同字母的两组数据之间未达到5%显著水平，标记不同的两组数据之间达到5%显著水平。

由表1数据可知，PRO活性、吡咯啉-5-羧酸的含量和2-AP的含量均为：OsPRO基因过表达转基因水稻 > 正常水稻 > OsPRO基因RNAi转基因水稻，且具有显著性差异，即表明了OsPRO基因表达的OsPRO蛋白（脯氨酸氧化酶）与2-AP含量正相关的机制为脯氨酸氧化酶能够催化脯氨酸转化为吡咯啉-5-羧酸，进而合成水稻香气物质2-AP。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种与香稻香气含量相关的基因OsPRO及其编码蛋白的应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 基因OsPRO的cDNA核苷酸序列

<400> 1

atggccatcg cctcccgcat ccagaagcgc gtgcttgcct ccttcgccgc cgccgccgca 60

gccaagctcc cggaggcggc cgtcgcggcc gccggaggcg ccgcagaggc ggtggaggag 120

gtcgcgtctt ccgtgcagga gcaggtgcag gcgcagggag cgcaggtgtt ggagtttggg 180

gataccgaga ggctgttcgc cggggagagg tcgacgtcgc tggtgcgcac gctcgccgtg 240

ctgcaggcgc tgtcggtggg cccgctcgtg gacgtggcga cggcggcgct gaggtcgccg 300

gcggtggccg ggagcgcggc ggggcgcgcc gcggcgaggg ccaccgcgta ccagcacttc 360

tgcgccgggg agaccgccga ggaggccgcc gcggcggtgc gccgcctctg gcgcggcggc 420

atgggcggga tcctcgacta cggcatcgag gacgccgagg acggccccgc ctgcgaccgc 480

aacgccgccg gattcctcgc cgccatcgac gtcgccgccg cgctgcctcc tggctcggcg 540

agcgtgtgca tcaagatcac ggcgctgtgc ccggtcgcgt tgctggagaa ggcgagtgat 600

ctgctgcggt ggcagcagaa gcacccggcg acgaagctgc catggaaagt gcacgggttc 660

ccggtgctgt gcgtctccag cccgctgtac ctgacggcgg cggagccgcc ggcgctggag 720

gcggaggagg agagggagct cgagatggcg cacgggcggc tgctggcgat cggcgagcgg 780

tgcgcggagt acgacatccc gctgctggtg gacgccgagt acgccaccgt gcagccggcg 840

atcgactact tcacgttcgc cggcgcgctg gcgttcaacg gcggcgggag gcccatcgtg 900

cacggcaccg tccaggccta cctccgcgac gcgcgcgacc ggctggaggc catggcgcga 960

gcggcgcagg gcgagcgcgt gtgcctcgcg ctcaagctgg tccgcggcgc gtacctggcg 1020

cgcgaggccc gcctcgcggc ctccctcggc gtgccgtcgc cggtccaccg cagcatccag 1080

gacacccacg actgctacaa cggctgcgcc gcgttcctcc tcgaccgcgt ccgccgcggc 1140

gccgccgccg tgacgctcgc cacgcacaac gtcgagtccg ggcagctcgc cgcggcgagg 1200

gcgctggagc tcggcatcgg cggcggcggc gaccgcggcc tgcagttcgc gcagctgatg 1260

ggcatggcgg atggcctctc gctcggcctc cgcaacgccg ggttccaggt gagcaagtac 1320

ctgccgtacg gtccagtgga gcagatcatc ccgtacctca tcagacgagc agaggagaac 1380

aggggattgc tctcgtcttc ctccttcgac agacagctgc tccggtaa 1428

<210> 2

<211> 475

<212> PRT

<213> 基因OsPRO编码蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Ile Ala Ser Arg Ile Gln Lys Arg Val Leu Ala Ser Phe Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Lys Leu Pro Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Ala Glu Ala Val Glu Glu Val Ala Ser Ser Val Gln Glu Gln

35 40 45

Val Gln Ala Gln Gly Ala Gln Val Leu Glu Phe Gly Asp Thr Glu Arg

50 55 60

Leu Phe Ala Gly Glu Arg Ser Thr Ser Leu Val Arg Thr Leu Ala Val

65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Ser Val Gly Pro Leu Val Asp Val Ala Thr Ala Ala

85 90 95

Leu Arg Ser Pro Ala Val Ala Gly Ser Ala Ala Gly Arg Ala Ala Ala

100 105 110

Arg Ala Thr Ala Tyr Gln His Phe Cys Ala Gly Glu Thr Ala Glu Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Ala Val Arg Arg Leu Trp Arg Gly Gly Met Gly Gly Ile

130 135 140

Leu Asp Tyr Gly Ile Glu Asp Ala Glu Asp Gly Pro Ala Cys Asp Arg

145 150 155 160

Asn Ala Ala Gly Phe Leu Ala Ala Ile Asp Val Ala Ala Ala Leu Pro

165 170 175

Pro Gly Ser Ala Ser Val Cys Ile Lys Ile Thr Ala Leu Cys Pro Val

180 185 190

Ala Leu Leu Glu Lys Ala Ser Asp Leu Leu Arg Trp Gln Gln Lys His

195 200 205

Pro Ala Thr Lys Leu Pro Trp Lys Val His Gly Phe Pro Val Leu Cys

210 215 220

Val Ser Ser Pro Leu Tyr Leu Thr Ala Ala Glu Pro Pro Ala Leu Glu

225 230 235 240

Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu Glu Met Ala His Gly Arg Leu Leu Ala

245 250 255

Ile Gly Glu Arg Cys Ala Glu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Val Asp Ala

260 265 270

Glu Tyr Ala Thr Val Gln Pro Ala Ile Asp Tyr Phe Thr Phe Ala Gly

275 280 285

Ala Leu Ala Phe Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ile Val His Gly Thr Val

290 295 300

Gln Ala Tyr Leu Arg Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Ala Met Ala Arg

305 310 315 320

Ala Ala Gln Gly Glu Arg Val Cys Leu Ala Leu Lys Leu Val Arg Gly

325 330 335

Ala Tyr Leu Ala Arg Glu Ala Arg Leu Ala Ala Ser Leu Gly Val Pro

340 345 350

Ser Pro Val His Arg Ser Ile Gln Asp Thr His Asp Cys Tyr Asn Gly

355 360 365

Cys Ala Ala Phe Leu Leu Asp Arg Val Arg Arg Gly Ala Ala Ala Val

370 375 380

Thr Leu Ala Thr His Asn Val Glu Ser Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg

385 390 395 400

Ala Leu Glu Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gly Asp Arg Gly Leu Gln Phe

405 410 415

Ala Gln Leu Met Gly Met Ala Asp Gly Leu Ser Leu Gly Leu Arg Asn

420 425 430

Ala Gly Phe Gln Val Ser Lys Tyr Leu Pro Tyr Gly Pro Val Glu Gln

435 440 445

Ile Ile Pro Tyr Leu Ile Arg Arg Ala Glu Glu Asn Arg Gly Leu Leu

450 455 460

Ser Ser Ser Ser Phe Asp Arg Gln Leu Leu Arg

465 470 475

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物OsPRO-F

<400> 3

acttggaagc ttcaggcaca agtccgacct tc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物OsPRO-R

<400> 4

aatatcacgc gtttaccgga gcagctgtct gt 32

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 5

gacgaagctg ccatggaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 6

agctgcccgg actcgacgtt 20

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物OsPRO-RNAi-F

<400> 7

atagtaggat ccgacgaagc tgccatggaa ag 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> OsPRO-RNAi-R

<400> 8

atatacaagc ttagctgccc ggactcgacg tt 32

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物RNAi-MluI

<400> 9

gagaacgcgt ggtacccttg accatggtag 30

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> RNAi-PstI

<400> 10

aactactgca gggccctcag atctaccatg gtc 33

Claims (7)

1.与香稻香气含量相关基因OsPRO在改善香稻香气含量中的应用；所述基因OsPRO的cDNA全长序列如SEQ ID NO：1 所示。

2.与香稻香气含量相关蛋白OsPRO在改善香稻香气含量中的应用；所述OsPRO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

3.与香稻香气含量相关蛋白OsPRO在制备改善香稻香气含量药剂中的应用。

4.一种对香稻香气含量进行改造的方法，其特征在于，将基因OsPRO转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；所述基因OsPRO的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

5.一种制备香气改善型转基因水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.构建表达载体

S11.利用SEQ ID NO：3所示引物OsPRO-F和SEQ ID NO：4所示引物OsPRO-R，以水稻cDNA为模板进行PCR扩增，回收、定量、连接到相同双酶切的植物表达载体中；

S12.连接产物经过透析膜透析后，转化DH10B感受态细胞；

S13.双酶切检测，得到含有OsPRO基因的阳性植物表达载体；

S2.转化愈伤组织

S21.利用农杆菌介导的方法，将上述含有OsPRO基因的植物表达载体转化水稻成熟胚的愈伤组织；

S22.转化后的愈伤组织经过预分化、分化，得到转化植株；

S3.阳性的转基因植株鉴定

利用SEQ ID NO：5所示引物1和SEQ ID NO：6所示引物2，对S22所述转化植株进行PCR鉴定，得到阳性转基因植株；

S4.纯合子的筛选

将S3所述阳性转基因植株进行培育繁殖，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA，通过Southern Blot检测***基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后将种子发芽后利用潮霉素进行筛选，存活下来的即为纯合子。

6.根据权利要求5所述制备香气改善型转基因水稻的方法，其特征在于，步骤S11所述植物表达载体为pCAMBIA1380、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121。

7.根据权利要求6所述制备香气改善型转基因水稻的方法，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1380；步骤S11所述双酶切为HindIII和MluI酶切。