CN104027324B - 一种可溶性微针疫苗贴片及其制备方法 - Google Patents
一种可溶性微针疫苗贴片及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于经皮给药的可溶性微针贴片，特别涉及可溶性微针疫苗贴片及其制备方法。本发明的可溶性微针疫苗贴片是由不含目标药物的可溶性微针基底部分和含有目标药物的可溶性微针针体部分所组成；疫苗及适用于此种疫苗的佐剂的目标药物负载在可溶性微针针体的前端，疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂是负载在纳米颗粒上，且纳米颗粒是均匀地分布在溶性微针针体的前端；所述可溶性微针疫苗贴片的基质材料是生物相容性的水溶性高分子材料。本发明制作的适用于疫苗经皮免疫的可溶性微针疫苗贴片，其可溶性微针针体具有足够的硬度，能有效刺穿皮肤表层的角质层，进入皮肤的针体的前端部分可以实现快速溶解并释放出储存在针体的前端中的目标药物。
Description
技术领域
本发明属于经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，特别涉及以具有生物相容性的水溶性高分子材料作为基质制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片及其制备方法。
背景技术
目前大部分临床治疗药物以及疫苗都是采用注射手段进行给药。注射虽然具有快速、低成本以及可以适用于各种类型药物的优点，但是却必须由技术熟练的护士进行操作，不适用于病人自己给药。同时注射手段也存在因针头反复利用带来各种传染病的风险。经皮给药克服了上述缺点并以其快速简单的给药方式，越来越受到人们的关注。
针对疫苗而言，皮肤中含有朗格汉斯细胞（Langerhans cells，LCs）和树突细胞（dendritic cells，DCs）等大量的专职抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC），使得皮肤成为一个良好的免疫接种位点（Bos JD,Kapsenberg ML.The skin immunesystem:progress in cutaneous biology.Immunol Today1993;14(2):75–8；BanchereauJ,Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity.Nature1998;392(6673):245–52；Kupper TS,Fuhlbrigge RC.Immune surveillance in the skin:mechanisms and clinical consequences.Nat Rev Immunol2004;4(3):211–22）。在经皮免疫中，由于免疫位点有更多的APC使得经皮免疫要比肌肉注射节省药剂量（Charest AF,McDougall J,Goldstein MB.A randomized comparison of intradermalandintramuscular vaccination against hepatitis B virus in incident chronichemodialysis patients.AmJ Kidney Dis 2000;36(5):976–82；Egemen A,Aksit S,Kurugol Z,Erensoy S,Bilgic A,Akilli M. Low-dose intradermalversusintramuscular administration of recombinant hepatitis B vaccine:acomparison of immunogenicityin infants and preschool children. Vaccine1998;16(16):1511–5；Sabchareon A,Chantavanich P,Pasuralertsakul S, Pojjaroen-Anant C,Prarinyanupharb V,Attanath P,et al.Persistence of antibodies in childrenafter intradermal or intramuscularadministration of preexposure primary andbooster immunizations with purified Vero cell rabiesvaccine.Pediatric InfectDis J1998;17(11):1001–7）。但是目前研究表明疫苗经皮免疫倾向于诱导更强的辅助性T细胞2（Th2）型体液免疫应答，对许多疾病而言辅助性T细胞1（Th1）型的细胞免疫应答也是必须的（Fu S.Quan,“Dose sparing enabled by skin immunization with influenzavirus-like particle vaccine using microneedles”,J.Control.Release.147(2010)326–332；K outsonanos D.G，“Transdermal Influenza Immunization with Vaccine-Coated MicroneedleArrays”，Transdermal Vaccination.4(2009)47-73）。因此需要选择合适的佐剂和抗原的呈递方式来提高经皮免疫所诱导的细胞免疫反应应答，实现体液免疫反应和细胞免疫反应的平衡。研究发现纳米颗粒负载抗原后，在经皮免疫过程中纳米颗粒可以被皮肤中的APC直接吞噬从而诱导细胞免疫。更重要的是很多纳米颗粒材料本身也具有佐剂的功能，并且其中直径在30～300纳米的免疫刺激复合物（Immune stimulatingcomplex，ISCOM)更容易通过刺激Toll受体活化APC，诱导细胞免疫反应（BehazineCombadiere,Brice Mahe. Particle-based vaccines for transcutaneousvaccination.Comparative Immunology,Microbiology&Infectious Diseases31(2008)293–315）。目前在经皮免疫中多种纳米颗粒被开发出来作为疫苗的载体比如：聚乳酸聚羟基乙酸（PLGA)（Hedley ML,Curley J,Urban R.Microspheres containing plasmid-encoded antigens elicit cytotoxic T-cell responses.Nat Med 1998;4(3):365–8；Denis-Mize KS,Dupuis M,MacKichan ML,Singh M,Doe B,O’Hagan D,et al.Plasmid DNAadsorbed onto cationic microparticles mediates target gene expression andantigen presentation by dendritic cells.Gene Ther 2000;7(24):2105–12），聚乳酸（PLA)，聚原酸酯(POE)，脂质体，免疫刺激复合物（ISCOMS）和壳聚糖（Reddy ST,Swartz MA,Hubbell JA.Targeting dendritic cells with biomaterials:developing the nextgeneration of vaccines.Trends Immunol2006;27(12):573–9）等。但是传统的经皮给药方式，由于纳米颗粒粒径较大，受到皮肤角质层的阻挡，药物透过率低，导致药物有效利用率低。因此经皮给药***必须能够有效地使药物穿过皮肤表面角质层的阻挡，提高药物的有效利用率。
随着微加工技术的发展，多种可以进行经皮给药的微针给药***被发展起来。微针不但可以刺穿皮肤表面角质层，完成药物的经皮输送，而且其刺入的深度又不触及神经，不会引起疼痛和皮肤的损伤。其中流感疫苗（Q.Y.Zhu,V.G.Zarnitsyn,L.Ye,Z.Y.Wen,Y.L.Gao,L.Pan,I.Skountzou,H.S.Gill,M.R.Prausnitz,C.L.Yang,R.W.Compans,Immunization by vaccine-coated microneedle arrays protects against lethalinfluenza virus challenge,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(2009)7968–7973；D.G.Koutsonanos,M.d.P.Martin,V.G.Zarnitsyn,S.P.Sullivan,R.W.Compans,M.R.Prausnitz,I.Skountzou,Transdermal influenza immunization with vaccine-coated microneedle arrays,PLoS One4(2009)e4773）、乙肝疫苗（A.K.Andrianov,D.P.DeCollibus,H.A.Gillis,H.H.Kha,A.Marin,M.R.Prausnitz,L.A.Babiuk,H.Townsend,G.Mutwiri,Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene is a potentadjuvant for intradermal immunization,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(2009)18936–18941），丙肝DNA疫苗（H.S.Gill,J.,M.R.Prausnitz,M.,Cutaneous vaccination using microneedles coated with hepatitis C DNA vaccine,Gene Ther.17(2010)811–814）等在涂布针（coating）中得到使用，并且在小鼠免疫试验中了取得了比同剂量肌肉注射免疫更好的免疫球蛋白G（IgG）滴度。但是由于涂布针微针载药量低，而且在疫苗应用中难以跟佐剂，尤其是纳米颗粒佐剂同时使用，影响了涂布针在纳米颗粒抗原载体中的应用。在微针使用中还可以将实心微针作用于皮肤形成药物通过的微孔道，然后将药物贴剂敷在微针作用后位置，让药物经过微孔道输送入皮肤内。虽然这种方法可以满足疫苗和佐剂的同时使用，但是使用贴剂时，作用时间过长，药物利用率低。更重要的是对于那些传统的以金属以及单晶硅为材料的微针在使用过程中存在针体折断残留在皮肤中的潜在风险。因此微针给药***仍然需要进一步的改进，得到一种使用简单，载药量高，而且可以适用于多种药物，在疫苗利用可以做到与佐剂联合使用的微针给药***。
由水溶性高分子材料作为基质制作的可溶性（dissolving）微针或者叫做自溶性（self-dissolving）微针被开发出来。其中目标药物被混匀在微针针体制作基质中，制成含药微针，当针体***皮肤中后，伴随着针体的溶解药物释放到皮肤内。通过选用不同的基质可以控制针体在皮肤中的溶解速度，实现快速给药或者缓释给药。例如以麦芽糖(日本专利特开2003-238347号公报；日本专利特开2005-154321号公报；日本专利特开2005-152180号公报)、蚕丝蛋白（国际专利WO2012/054582A2）、透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone,PVP）、聚甲基乙烯基醚和马来酐复合物(copolymer of methyvinyl ether and maleic anhydeide,PMVE/MA)以及多种多糖组合等作为基质来制作可溶性微针(Akira Yamamoto，“The development and characteristics of novelmicroneedle arrays fabricated from hyaluronic acid,and their application inthe transdermal delivery of insulin”，Journal of Controlled Release xxx(2012)xxx；Chien-Chung Fu和Hsing-Wen Sung，“Multidrug release based on microneedlearrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres”，Biomaterials33(2012)5156-165；Ryan F.Donnelly，“Microneedle-mediated intradermal nanoparticledelivery:Potential for enhanced local administrationof hydrophobic pre-formedphotosensitisers”，Photodiagnosis and Photodynamic Therapy(2010)7,222—231；J.C.Birchall，“Low temperature fabrication of biodegradable sugar glassmicroneedles fortransdermal drug delivery applications”，Journal of ControlledRelease158(2012)93–101；)；上述材料中可以满足在室温条件下添加药物，并且不影响针体硬度及形态的主要有PVP、HA和硫酸软骨素。
在目前的可溶性微针经皮给药研究中，流感疫苗（S.P.Sullivan,D.G.Koutsonanos,M.D.Martin,J.W.Lee,V.Zarnitsyn,S.O.Choi,N.Murthy,R.W.Compans,I.Skountzou,M.R.Prausnitz,Dissolving polymer microneedle patches forinfluenza vaccination,Nat.Med.16(2010)915–920；A.P.Raphael,T.W.Prow,M.L.Crichton,X.F.Chen,G.I.P.Fernando,M.A.F.Kendall,Targeted,needle-freevaccinations in skin using multi layered,densely-packed dissolvingmicroprojection arrays,Small6(2010)1785–1793）、乙肝表面抗原（H.J.H.B.Hirschberg,G.G.P.V.de Wijdeven,A.B.Kelder,G.P.J.M.van den Dobbelsteen,G.F.A.Kerstena,Bioneedles(TM)as vaccine carriers,Vaccine26(2008)2389–2397），霍乱疫苗（H.Hirschberg,G.de Wijdeven,H.Kraan,J.P.Amorij,G.F.A.Kersten,Bioneedlesas alternative delivery system for hepatitis B vaccine,J. Control.Release147(2010)211–217.）均表现出比肌肉注射免疫更好的免疫效果。这说明可溶性微针应用于疫苗的经皮给药是可行的。Chien-Chung Fu和Hsing-Wen Sung报道了用含有中空的PLGA纳米颗粒的基质制作可溶性微针，实验结果显示将PLGA纳米颗粒添加到可溶性微针针尖后并没有影响纳米颗粒及微针真针尖自身的性质（C.J.Ke,Y.J.Lin,Y.C.Hu,W.L.Chiang,K.J.Chen,W.C.Yang,H.L.Liu,C.C.Fu,H.W.Sung,Multidrug release based onmicroneedle arrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres，Biomaterials33(2012)5156-165）。
绝大多数疫苗必须与佐剂联合使用才能发挥有效地免疫保护效果，然而在现有的可溶性微针研究中，佐剂和疫苗的联合使用并没有对免疫效果产生显著的改善。因此在可溶性微针疫苗制剂的实用化开发中如何有效地联合使用疫苗和佐剂成为一个必须要解决的问题。本发明正是致力于解决疫苗和佐剂在可溶性微针中的联合使用问题。
在可溶性微针的制作过程中，制作方法也是多种多样，例如：在参考文献(美国专利US2009/0182306A1；国际专利WO2012/023044A1)中公开了的可以用多种可溶性物质制作可溶性微针，尤其说明了以羟甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC）为基质制作的可溶性微针，并公开了使用离心和真空的方法使溶液进入模具的针孔并制作可溶性微针。此外用拉拽方式（国际专利WO2008/010681A1）和重物压力（国际专利WO2012/054582A2）等方法也被用来制作可溶性微针。为了有效地利用药物，理想的微针是使药物仅存在于能有效进入皮肤内的微针针体的部位。采用上述离心方法，在中国专利CN101868229A中提供了一种利用硫酸软骨素作为基质，制作的可溶性微针中药物仅仅分布在针***置；在文献（MarkR.Prausnitz，“Fabrication of Dissolving Polymer Microneedles for ControlledDrug Encapsulation and Delivery:Bubble and Pedestal Microneedle Designs”，Journal of Pharmaceutical Acience,99(2010)）中也报道了以PVP/聚乙烯醇（PVA）为基质制作的仅在部分针尖载药的可溶性微针。
但是现在常用的可溶性微针制作方法中，离心方法操作不便，不适于大规模的使用；真空制作微针的方法不便于制作只在部分针尖载药的微针；使用重物压力法会因为模具微孔中的气体不能完全排除，进而导致制作的微针针尖不够尖锐，影响实际应用。因此开发一种新型的方便快捷的可溶性微针制作方法也是本发明要解决的问题。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供一种用水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片。本发明的可溶性微针疫苗贴片是由不含目标药物的可溶性微针基底部分和含有目标药物的可溶性微针针体部分所组成，疫苗及其佐剂负载在纳米颗粒上并均匀的分布在可溶性微针针体部分的前端，实现疫苗和佐剂在可溶性微针疫苗贴片经皮给药中的有效联合使用，从而起到调节疫苗免疫应答的功能，提高Th1型免疫反应的效果，而且纳米颗粒具有缓慢释放目标药物的特性，能进一步提高疫苗的免疫应答效果。
本发明进一步提供一种适合上述可溶性微针疫苗贴片的制备方法，并且通过优化可溶性微针疫苗贴片的制备方法实现通过一种简单有效的方法来制作由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成的可溶性微针疫苗贴片。
本发明的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片（也可简单描述为可溶性微针）如图1所示，是由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成，其中所述的目标药物负载在所述的可溶性微针针体的前端；所述的目标药物是疫苗及适用于此种疫苗的佐剂，所述的疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂是负载在纳米颗粒上，并且所述的纳米颗粒是均匀地分布在所述的可溶性微针针体的前端；所述纳米颗粒具有缓慢释放目标药物的功能；所述纳米颗粒具有改善疫苗免疫应答的功能。
本发明中所述的疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂是负载在纳米颗粒上，其中疫苗：佐剂：纳米颗粒的重量比在1::1:1～1:10:50范围之内。优选疫苗、佐剂和纳米颗粒在所述的可溶性微针针体中所占的总重量为0.1%～50%；更优选在所述的可溶性微针针体中所占的总重量为1%～15%。
优选地，所述的可溶性微针基底和可溶性微针针体的材料都是水溶性高分子材料，选自聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、透明质酸钠（HA）、硫酸软骨素（CS）中的一种或者几种。
优选地，所述的水溶性高分子材料的重均分子量范围为2000～100000，优选重均分子量范围为6000～40000。作为本发明中可溶性微针疫苗贴片的制作材料，优选重均分子量为40000的PVP K30、重均分子量为7000～8000的HA、重均分子量为10000的CS和重均分子量为30000的CS中的一种。
本发明中作为制作可溶性微针疫苗贴片所使用的基质材料是安全的生物相容性的水溶性高分子材料。所述的水溶性高分子材料干燥后必须有足够的强度，保证可溶性微针针体的针尖可以有效刺穿皮肤。同时进入皮肤内部的可溶性微针针体部分又能迅速吸取皮肤中的水分实现快速溶解，从而将可溶性微针针体的前端含有的目标药物释放入皮肤中。此外，本发明中所述的水溶性高分子材料有较好的分散剂作用，可以将不溶性药物，尤其是纳米颗粒均匀的分散在水溶性高分子材料中，并且纳米颗粒在一定浓度范围不影响可溶性微针针体的强度。
本发明中所述的可溶性微针疫苗贴片的基质材料，优先选择使用PVP和HA的混合水溶性高分子材料（重量比为1:1～0.1：0.9），以及CS和HA的混合水溶性高分子材料（重量比为1:1～0.1：0.9）；作为可溶性微针疫苗贴片的制作材料，上述可溶性微针疫苗贴片的基质材料在使用时，在背衬制作液中所占的重量百分含量可以在30wt%～80wt%之间，在此浓度范围内混合水溶性高分子材料有较好的流动性，便于在制作可溶性微针疫苗贴片的过程中容易铺盖在反转模具的表面。
本发明中所述的目标药物是负载在可溶性微针针体的前端，负载有目标药物的可溶性微针针体部分优选占整个可溶性微针针体总长度的20～80%（从可溶性微针针体的针尖起至可溶性微针针体的底端方向），以避免目标药物集中存在针体少量部分形成局部的高浓度药物区域，影响了可溶性微针针体的硬度。同时可溶性微针针体的后端及可溶性微针疫苗贴片的背衬中不含有目标药物，避免了因可溶性微针针体的后端及背衬不能进入皮肤释放药物而造成的药物浪费，实现药物利用效率最大化。
优选地，所述的可溶性微针针体的高度为150～800微米，优先选用高度为300～700微米的可溶性微针针体，可溶性微针针体的针尖的角度为30～40度。
在本发明中更优先选用可溶性微针针体的针体的高度为650微米，可溶性微针针体的针尖的角度为30度的可溶性微针针体。上述的可溶性微针针体更适合于采用手压方式进行可溶性微针疫苗贴片的经皮给药。
优选地，所述的纳米颗粒为聚羟基乙酸（poly(D,L-lactic-co-glycolicacid)copolymers，PLGA)纳米颗粒、聚乳酸（poly(D,L-lactide),PLA)纳米颗粒、聚原酸酯(poly(ortho esters),POE)纳米颗粒、脂质体纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒中的一种；所述的纳米颗粒的粒径是10～1000nm，优先选取粒径为100～500nm的纳米颗粒。
本发明中所述的纳米颗粒优选为中空的纳米颗粒。所述的中空的纳米颗粒中优先选择中空阳离子脂质体纳米颗粒作为疫苗和佐剂的载体。
优选地，所述的纳米颗粒在所述的可溶性微针针体中的重量百分含量在0.1wt%～20wt%之间，优先选择在1wt%～10wt%范围之内。
虽然在文献（Chien-Chung Fu和Hsing-Wen Sung，“Multidrug release based onmicroneedle arrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres”，Biomaterials33(2012)5156-165）中有在可溶性微针中添加中空PLGA纳米颗粒的报道，但是并没有说明它们添加中空PLGA纳米颗粒的作用。中国专利CN101868229A中虽然提到在可溶性微针中使用的目标物质可以是微胶囊以及胶囊类物质，但是所述胶囊微粒的粒径在10微米以下，而本发明中适用的中空纳米颗粒最优的粒径为100～500nm，而且中国专利CN101868229A中的微胶囊内的目标物质中提到的是肽、蛋白质、核酸或者多糖，没有限定目标物质是可以用来提高疫苗免疫能力的疫苗及佐剂物质。而且以上专利或文献都没有限定纳米颗粒在可溶性微针中所占的重量百分含量。在不影响可溶性微针的针尖硬度的前提下，本发明中所述的纳米颗粒在所述的可溶性微针针体中的重量百分含量在0.1wt%～20wt%之间，优先选择在1wt%～10wt%范围之内。
优选地，所述的疫苗可以选自减毒活疫苗、亚单位疫苗、多糖-蛋白质偶联疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗中的一种。
本发明中所述的减毒活疫苗是将病原微生物(细菌或病毒)在人工训育的条件下，促使病原微生物产生定向变异，使其极大程度地丧失致病性，但仍保留一定的剩余毒力、免疫原性和繁衍能力。优先选用麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙脑减毒活疫苗或手足口疫苗。
本发明中所述的亚单位疫苗是从细菌或病毒培养物中，以生物化学和物理方法提取纯化有效特异性抗原制成的疫苗，或者是通过基因工程菌表达纯化有效特异性抗原制成的疫苗。优先选用乙肝疫苗或流感疫苗。
本发明中所述的多糖-蛋白质偶联疫苗是由长链糖分子构成，如细菌的多糖荚膜。优先选用肺炎球菌疫苗、A群流脑疫苗或A+C群流脑疫苗。
本发明中所述的DNA疫苗是将编码某一种病原生物特异抗原的基因***到DNA载体上，获得的具有疫苗性质的DNA疫苗。优先选择表达乙型肝炎表面抗原基因（S）的DNA疫苗。
本发明中所述的病毒载体疫苗是将遗传改造的重组病毒作为载体，再从某一病原生物中获得一段特定的基因，将获得的一段特定的基因***到重组病毒载体中，获得的具有疫苗性质的重组活病毒疫苗。所述的重组活病毒疫苗优先选用痘病毒载体疫苗或腺病毒载体疫苗。所述的痘病毒载体疫苗优先选用表达乙型肝炎表面抗原基因（S）的痘病毒载体疫苗；所述的腺病毒载体疫苗优先选用表达乙型肝炎表面抗原基因（S）的腺病毒载体疫苗。
优选地，所述的佐剂是本身不具抗原型，在与疫苗配合使用中可以通过提升对体液免疫反应的刺激来增强疫苗免疫应答的非特异性免疫增强剂。
优选地，所述的佐剂需要与疫苗联合使用，所述的佐剂优先选择Th1型（1型辅助性T细胞）佐剂，在Th1型佐剂中优先选择人未甲基化寡聚脱氧核苷酸（CpG OND）。
本发明中，中空阳离子脂质体纳米颗粒可以负载CpG OND和疫苗，并直接将CpGOND和疫苗呈递给皮肤中的专职抗原呈递细胞，从而提高CpG OND的佐剂效果，进而提高疫苗的免疫反应实现使用少量疫苗既可达到有效免疫保护作用的效果。并且负载疫苗和CpGOND的中空阳离子脂质体纳米颗粒可以将疫苗和CpG OND缓慢释放，实现药物的持续高效利用。
本发明的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片的制作是在密闭容器中并于2～5倍大气压下作用10～30秒钟，使含有目标药物的黏度优选低于100厘帕（cP）的水溶性高分子材料的水溶液进入反转模具的针孔中，在2℃～40℃的条件下干燥；然后加入黏度为600～2000厘帕（cP）的不含目标药物的水溶性高分子材料的水溶液，放置于温度为2℃～40℃的条件下干燥后形成可溶性微针贴片。
本发明的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片的制备方法包括以下步骤：
（1）配制含有纳米颗粒、疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂的水溶性高分子材料的水溶液作为针体制作液（即可溶性微针针体的制作液），然后将针体制作液覆盖到表面具有所需数量的针孔的反转模具中；在密闭容器中于2～5倍大气压下作用10～30秒钟，使针体制作液进入到所述的针孔中，回收反转模具上的剩余针体制作液（回收后的针体制作液可再重复利用）；将已加入针体制作液的反转模具于温度为2℃～40℃的条件自然晾干，在反转模具中得到可溶性微针针体，且负载有疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂的纳米颗粒是均匀地分布在所述的可溶性微针针体的前端；
（2）将水溶性高分子材料溶解于水中，得到浓度为30wt%～80wt%，黏度为600～2000厘帕（cP）的不含目标药物的水溶性高分子材料的水溶液作为背衬制作液（即可溶性微针疫苗贴片的背衬制作液），然后倒入步骤(1)覆盖有针体制作液并干燥后得到的反转模具中，室温下放置；然后置于密闭容器中，在密闭容器中于2～5倍大气压下作用1～10分钟，使所述的针孔中残存的空气溢出；然后将覆盖有背衬制作液的反转模具于温度为2℃～40℃的条件下干燥（优选干燥的温度为4℃），得到由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成的可溶性微针疫苗贴片。
所述的反转模具可按照如下方法进行制备：将表面具有所需数量的微针针体的金属微针模具作为母模模具，取预聚合的聚二甲基硅氧烷和交联剂的混合物并覆盖在母模模具上，在温度为80℃下放置（一般放置的时间为30分钟左右），其中聚二甲基硅氧烷：交联剂的重量比为10:1，得到表面具有与所述的母模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的反转模具，以用来作为制作可溶性微针疫苗贴片的模具。
所述的针体制作液中的水溶性高分子材料的水溶液的重量百分含量为5～10%。
所述的针体制作液中的疫苗：佐剂：纳米颗粒的重量比在1:1:1～1:10:50范围之内。
所述的针体制作液的黏度优选低于100厘帕。
所述的纳米颗粒在所述的可溶性微针针体制作液中的重量百分含量在0.1wt%～20wt%之间，优先选择在1wt%～10wt%范围之内。本发明的可溶性微针疫苗贴片在使用时，将可溶性微针针体的针尖（如图1中5所指部位）对准所作用的皮肤位置，用手按压可溶性微针疫苗贴片的背衬（如图1中1所指部位），可溶性微针针体刺穿皮肤角质层后进入表皮。本发明的可溶性微针疫苗贴片的针体可以在3～15分钟内将目标药物释放到皮肤内。给药时间优选为10分钟，此时可以保证刺入皮肤部分的可溶性微针针体的前端完全溶解在皮肤中并将目标药物释放入皮肤。
本发明的有益效果在于：可以通过一种简单有效的方法制作由不含目标药物的可溶性微针疫苗贴片的基底部分和含有目标药物的可溶性微针疫苗贴片的针体部分组成所述的可溶性微针疫苗贴片，其中目标药物负载在所述的可溶性微针疫苗贴片的针体的前端，实现疫苗和佐剂在可溶性微针疫苗贴片经皮给药中的有效联合使用，从而起到调节疫苗免疫应答，提高Th1型免疫反应的效果，并得到相对平衡的Th1和Th2型免疫应答。克服了疫苗在经皮免疫时优先激起Th2型免疫反应，Th1型免疫反应相对低下的缺点。此外可溶性微针疫苗贴片使用方便简单，不需要技术熟练的护士来操作，适用于病人自己给药。
附图说明
图1.本发明的可溶性微针疫苗贴片的整体示意图。
图2.本发明制备可溶性微针疫苗贴片所使用的金属微针模具的示意图。
图3.本发明制备可溶性微针疫苗贴片所使用的与图2所示的金属微针模具相适配的PDMS反转模具的示意图。
图4.本发明的实施例1和实施例2中以台盼蓝作为模式疫苗，图中深色部分表示模式疫苗在可溶性微针针体上的分布位置。
图5.本发明的实施例1和实施例2中制成的可溶性微针针体的前端含有台盼蓝的可溶性微针疫苗贴片作用于猪耳朵皮肤后留下的针孔。
图6.本发明的实施例3和比较例1、2、3所使用的可溶性微针疫苗贴片经皮给药后，实施例和各比较例的IgG滴度。
图7.本发明的实施例3和比较例1、2、3所使用的可溶性微针疫苗贴片经皮给药后，实施例和各比较例的IgG2a/IgG1的比例。
图8.本发明的实施例4和比较例4、5、6所使用的可溶性微针疫苗贴片经皮给药后的实施例和各比较例的IgG滴度。
图9.本发明的实施例4和比较例4、5、6所使用的可溶性微针疫苗贴片经皮给药后的实施例和各比较例的IgG2a/IgG1的比例。
图10.本发明实施例5的可溶性微针疫苗贴片（贴片1）的可溶性微针针体中负载的HBSAg的总释放率。
图11.本发明实施例5的可溶性微针疫苗贴片（贴片2）的可溶性微针针体中的中空阳离子脂质体纳米颗粒负载的HBSAg的总释放率。
附图标记
1.可溶性微针疫苗贴片的基底（背衬）
2.可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体
3.可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体的前端（含药部分）
4.可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体的后端（不含药部分）
5.可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体的针尖
6.可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体的底端
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但是本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
（1）反转模具的制备：依托表面有36个（6×6行）高约650微米，底端直径约250微米的四面体形微针针体的母模模具（如图2所示），取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交联剂1克的混合物并覆盖在母模模具上，在温度为80℃下放置30分钟左右，得到表面具有与所述的母模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的反转模具；反转模具的表面含有36个（6×6行）深度约650微米，底端直径约250微米的正方形的针孔(如图3所示）；针孔的锥角的角度为35度；
（2）分别将负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒（中空阳离子脂质体纳米颗粒可按照比较例3的方法制备得到，并且负载的方法也可按照比较例3的方法）加入到表2中所示的溶液编号为1-11的溶液中，分别得到作为针体制作液的溶液A，其中：中空阳离子脂质体纳米颗粒：CpG OND：台盼蓝的重量比为10:5:1，负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒在针体制作液中所占的重量百分含量为10%；然后将得到的11个针体制作液分别覆盖到步骤（1）得到的11个表面具有36个正方形的针孔的反转模具中；在密闭容器中按照表1中所示的大气压A及作用时间A，使针体制作液进入到所述的36个正方形的针孔中，回收反转模具上的剩余针体制作液（回收后的针体制作液可再重复利用）；将已加入针体制作液的反转模具于表1中所示的温度A条件下自然晾干；在11个反转模具中分别得到可溶性微针针体，且负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒是分别均匀地分布在11个可溶性微针针体的前端，可溶性微针针体的针尖的角度为35度；
（3）将CS、HA、PVP K30按照不同比例溶解到水中，分别得到表3中所示的溶液编号为1-12的溶液B作为背衬制作液，然后将从溶液编号为1-12的溶液B中选取的背衬制作液随机的倒入步骤(2)得到的11个覆盖有针体制作液并干燥后得到的反转模具中，室温下放置5分钟；然后置于密闭容器中，在密闭容器中按照表1中所示的大气压B及作用时间B，使所述的36个正方形的针孔中残存的空气溢出；然后将11个覆盖有背衬制作液的反转模具于表1中所示的温度B条件下自然晾干，将干燥后的11个可溶性微针疫苗贴片小心取下，分别得到选取自表3中溶液编号为1-12的高分子材料为主要基质材料的含有36根微针针体所组成的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度（如图4所示）。其中负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约130～520微米的长度区域，每一根微针针体的后端没有负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒（如图4所示）。
本实施例中使用的针体制作液及背衬制作液中选用的PVP K30的重均分子量为40000、PVP K17的重均分子量为8000、HA的重均分子量为2000或者7000、CS的重均分子量为30000或者100000。
可溶性微针疫苗贴片的使用方法：将上述得到的以表3中1-12组高分子材料组合为主要基质材料的可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针针体的针尖（如图1中的5所示）对准所作用的猪耳朵皮肤（猪耳朵皮肤的角质层同人皮肤角质层的厚度相当，可以用来替代人皮肤进行微针针体硬度的测试），用手按压可溶性微针疫苗贴片的背衬（如图1中的1所示），按压的时间为10min，然后取下作用后的可溶性微针疫苗贴片。作用后的猪耳朵皮肤如图5所示，表面有36个清晰的蓝色针孔，蓝色针孔为可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针中的台盼蓝释放到皮肤中所留，表明可溶性微针贴片的可溶性微针针体可以有效地刺穿皮肤并将可溶性微针贴片中的可溶性微针针体中的台盼蓝释放到皮肤中。
表1
| 大气压A | 2倍大气压 | 3倍大气压 | 5倍大气压 |
| 作用时间A | 10秒 | 20秒 | 30秒 |
| 温度A | 4℃ | 25℃ | 40℃ |
| 大气压B | 2倍大气压 | 3倍大气压 | 5倍大气压 |
| 作用时间B | 1分钟 | 5分钟 | 10分钟 |
| 温度B | 4℃ | 25℃ | 40℃ |
表2
表3
实施例2
（1）采用实施例1的反转模具；
（2）分别将表4中所示的负载有台盼蓝和CpG OND（佐剂）的中空阳离子脂质体纳米颗粒（中空阳离子脂质体纳米颗粒可按照比较例3的方法制备得到，并且负载的方法也可按照比较例3的方法）加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，分别得到3个针体制作液，其中负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒的针体制作液的重量百分含量分别为0.1%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为10纳米的）、20%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为200纳米的）、50%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为1微米的）；然后将得到的3个针体制作液分别覆盖到步骤（1）得到的3个表面具有36个正方形的针孔的反转模具中；在密闭容器中增加气压至3倍大气压，作用20秒，使针体制作液进入到所述的36个正方形的针孔中，回收反转模具上的剩余针体制作液（回收后的针体制作液可再重复利用）；将已加入针体制作液的反转模具于4℃下自然晾干；在3个反转模具中分别得到可溶性微针针体，且负载有台盼蓝（模式疫苗）和CpG OND（佐剂）的中空阳离子脂质体纳米颗粒是分别均匀地分布在3个可溶性微针针体的前端，可溶性微针针体的针尖的角度为35度；
（3）将CS：HA：水按重量比为1:1:3（w/w/w）混合溶解得到作为可溶性微针疫苗贴片的背衬制作液，然后分别倒入步骤(2)得到的3个覆盖有针体制作液并干燥后得到的反转模具中，室温下放置5分钟；然后置于密闭容器中，增加气压至3倍大气压，作用3分钟，使所述的36个正方形的针孔中残存的空气溢出；然后将3个覆盖有背衬制作液的反转模具于4℃下自然晾干，将干燥后的3个可溶性微针疫苗贴片小心取下，分别得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度（如图4所示）。其中负载有台盼蓝和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有台盼蓝和CpG的中空阳离子脂质体纳米颗粒（如图4所示）。负载有台盼蓝和CpG的中空阳离子脂质体纳米颗粒在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量分别为1%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为10纳米的）、20%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为200纳米的）、50%（中空阳离子脂质体纳米颗粒的粒径为1微米的）。
采用实施例1中可溶性微针疫苗贴片的使用方法对本实施例中所得的一系列可溶性微针疫苗贴片进行可溶性微针针体的强度检测，可溶性微针疫苗贴片按实施例1中使用方法作用后的猪耳朵皮肤均可得到如图5所示的效果，表面有36个清晰的蓝色针孔，蓝色针孔为可溶性微针疫苗贴片的可溶性微针中的台盼蓝释放到皮肤中所留，表明可溶性微针贴片的可溶性微针针体可以有效地刺穿皮肤并将可溶性微针贴片中的可溶性微针针体中的台盼蓝释放到皮肤中。
表4台盼蓝、CpG OND和中空阳离子脂质体纳米颗粒的重量比
比较例1
本例中采用乙肝疫苗（HBSAg）作为亚单位疫苗的模型疫苗，使用的HA的重均分子量为7000、CS的重均分子量为30000。
可溶性微针疫苗贴片的制作步骤如下：
（1）采用实施例1的反转模具；
（2）将HBSAg加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中HBSAg在针体制作液中所占的重量百分含量为0.5%。然后将针体制作液覆盖到步骤（1）得到的表面具有36个正方形的针孔的反转模具中；在密闭容器中增加气压至3倍大气压，作用20秒，使针体制作液进入到所述的36个正方形的针孔中，回收反转模具上剩余的针体制作液；将已加入针体制作液的反转模具于4℃下自然晾干；在反转模具中得到可溶性微针针体，且负载的HBSAg是均匀地分布在可溶性微针针体的前端，可溶性微针针体的针尖的角度为35度；
（3）将CS：HA：水按重量比为1:1:3（w/w/w）混合溶解得到作为可溶性微针疫苗贴片的背衬制作液，然后倒入步骤(2)得到的覆盖有针体制作液并干燥后得到的反转模具中，室温下放置5分钟；然后置于密闭容器中，增加气压至3倍大气压，作用3分钟，使所述的36个正方形的针孔中残存的空气溢出；然后将覆盖有背衬制作液的反转模具于4℃下自然晾干，将干燥后的可溶性微针疫苗贴片小心取下，得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中HBSAg主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有HBSAg。HBSAg在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为0.5%。
以6只体重约20g的年龄在7周左右的Bal b/c雌性小鼠为实验对象。提前24小时，小心把小鼠腹部一侧的毛除去。采用戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后将本实施例中得到的可溶性微针疫苗贴片按压在小鼠的无毛区域，按压时可溶性微针疫苗贴片中的可溶性微针的针尖面向小鼠的无毛区域，按压时间为3分钟，使可溶性微针针体中的HBSAg完全释放到小鼠皮肤中，完成经皮给药。两周后重复一次上述给药。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体IgG的滴度（如图6所示），并分析血清中针对HBSAg的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图7所示）。
比较例2
疫苗采用乙肝疫苗（HBSAg），佐剂为Th1型佐剂CpG OND。将HBSAg和CpG OND的混合物（HBSAg与CpG OND的重量比为1:2）加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中HBSAg和CpG OND在针体制作液中所占的重量百分含量分别为0.5%和1%。
除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中HBSAg和CpG OND主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有HBSAg和CpG OND。HBSAg和CpG OND在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量分别为0.5%和1%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度（如图6所示），并分析血清中针对HBSAg的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图7所示）。
比较例3
将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二甲基三十六烷基铵（DDA）和胆固醇（cholesterol）按照摩尔比为2：1：1的比例搅拌混合溶于6ml的酒精中，50℃水浴加热溶解，继续搅拌蒸馏掉酒精得到脂质层；加10ml蒸馏水水和，50℃水浴搅拌均匀，得到中空的多层囊泡；将得到的中空的多层囊泡用均质机挤压得粒径均一（约200纳米）的单层囊泡，即得到中空阳离子脂质体纳米颗粒；加入HBSAg混匀，冻干；再加1ml蒸馏水水和且在45℃搅拌30分钟，可得到负载HBSAg的中空阳离子脂质体纳米颗粒（Lip-HBSAg），其中，中空阳离子脂质体纳米颗粒与HBSAg的重量比为5:1。将Lip-HBSAg加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中Lip-HBSAg在针体制作液中所占的总重量百分含量为3%。
除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中Lip-HBSAg主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-HBSAg。Lip-HBSAg在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为3%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度（如图6所示），并分析血清中针对HBSAg的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图7所示）。
实施例3
将HBSAg和CpG OND的混合物（HBSAg与CpG OND的重量比为1:2）代替比较例3的HBSAg，并采用比较例3所述的负载药物的中空阳离子纳米颗粒的制作方式，制作得到同时负载HBSAg和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒（Lip-HBSAg-CpG OND），中空阳离子脂质体纳米颗粒：HBSAg：CpG OND的重量比为5：1：2。
将Lip-HBSAg-CpG OND加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中Lip-HBSAg-CpG OND在针体制作液所占的总重量百分含量为4%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中Lip-HBSAg-CpG OND主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-HBSAg-CpGOND。Lip-HBSAg-CpG OND在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为4%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度（如图6所示），并分析血清中针对HBSAg的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图7所示）。
图6结果显示，使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，小鼠血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度高于比较例1和比较例2中小鼠血清中得到的针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度，说明将HBSAg和CPGOND同时负载在中空脂质体阳离子纳米颗粒上后会明显提高血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体的滴度；另外使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，小鼠血清中针对HBSAg的特异性IgG抗体高于比较例3，表明向可溶性微针疫苗贴片负载的负载有HBSAg的中空脂质体纳米颗粒中添加CPG OND佐剂会明显提高疫苗诱导的免疫反应中特异性IgG抗体的滴度。IgG2a和IgG1抗体分别是Th1和Th2型免疫反应的指标，通常用IgG2a/IgG1的比例来评价疫苗诱导的免疫应答是偏向Th1型免疫反应还是Th2型免疫反应。当IgG2a/IgG1比例接近1时表示得到了相对平衡的Th1和Th2型免疫应答，对大多数疫苗来说，最优的免疫效果就是得到平衡的Th1和Th2型免疫应答。图7结果显示，使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，IgG2a/IgG1的比例明显高于比较例1、2、3，并且更靠近1。表明使用本实施例得到的可溶性微针疫苗贴片进行经皮给药时可以得到相对平衡的Th1和Th2型免疫应答。通过上述实验结果可以得出使用本实施例得到的可溶性微针疫苗贴片进行经皮免疫时可以取得优于比较例1、2、3的免疫效果。
比较例4
选用的疫苗为表达乙型肝炎病毒表面抗原（简称乙肝表面抗原）的DNA疫苗：VR-S2S。将VR-S2S加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中VR-S2S在针体制作液中的重量百分含量为1%。
除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中VR-S2S主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有VR-S2S。VR-S2S在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为1%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体的滴度（如图8所示），并分析血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图9所示）。
比较例5
疫苗采用比较例4中所述的VR-S2S，佐剂为Th1型佐剂CpG OND。将VR-S2S和CpGOND的混合物（VR-S2S与CpG OND的重量比为1:1）加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中VR-S2S和CpGOND在针体制作液中所占的重量百分含量均为1%。
除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中VR-S2S和CpG OND主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有VR-S2S和CpG OND。VR-S2S和CpG OND在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量均为1%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体的滴度（如图8所示），并分析血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图9所示）。
比较例6
疫苗采用比较例4中所述的VR-S2S，将VR-S2S代替比较例3的HBSAg，并采用比较例3所述的负载药物的中空阳离子纳米颗粒的制作方式，制作得到负载有VR-S2S的中空阳离子脂质体纳米颗粒（Lip-VR-S2S），中空阳离子脂质体纳米颗粒与VR-S2S的重量比为5:1。
将Lip-VR-S2S加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中Lip-VR-S2S在针体制作液中所占的总重量百分含量为6%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中Lip-VR-S2S主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-VR-S2S。Lip-VR-S2S在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为6%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体的滴度（如图8所示），并分析血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图9所示）。
实施例4
疫苗采用比较例4中所述的VR-S2S，佐剂为Th1型CpG OND。将VR-S2S和CpG OND的混合物（VR-S2S与CpG OND的重量比为1:1）代替比较例3的HBSAg，并采用比较例3所述的制作负载药物的中空阳离子脂质体的制作方法，制作得到同时负载了VR-S2S和CpG OND的中空阳离子脂质体纳米颗粒(Lip-VR-S2S-CpG OND)，其中，中空阳离子脂质体纳米颗粒：VR-S2S：CpGOND的重量比为5：1：1。
将Lip-VR-S2S-CpG OND加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中Lip-VR-S2S-CpG OND在针体制作液所占的总重量百分含量为7%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中Lip-VR-S2S-CpG OND主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-VR-S2S-CpG OND。Lip-VR-S2S-CpG OND在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为7%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序并在第二次给药前一天从小鼠尾静脉取血并获得血清，测定血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体的滴度（如图8所示），并分析血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例（如图9所示）。
图8结果显示，使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，小鼠血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体高于比较例4和比较例5中小鼠血清中得到的针对乙肝表面的特异性IgG抗体的滴度，说明将VR-S2S和CPGOND同时负载在中空脂质体阳离子纳米颗粒上后会明显提高血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体的滴度；另外使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，小鼠血清中针对乙肝表面抗原的特异性IgG抗体高于比较例6，表明向可溶性微针疫苗贴片负载的负载有VR-S2S的中空脂质体纳米颗粒中添加CPGOND佐剂会明显提高疫苗诱导的免疫反应中特异性IgG抗体的滴度。IgG2a和IgG1抗体分别是Th1和Th2型免疫反应的指标，通常用IgG2a/IgG1的比例来评价疫苗诱导的免疫应答是偏向Th1型免疫反应还是Th2型免疫反应。当IgG2a/IgG1比例接近1时表示得到了相对平衡的Th1和Th2型免疫应答，对大多数疫苗来说，最优的免疫效果就是得到平衡的Th1和Th2型免疫应答。图9结果显示，使用本实施例制作得到的可溶性微针疫苗贴片时，IgG2a/IgG1的比例明显高于比较例3、4、5，并且更靠近1。表明使用本实施例得到的可溶性微针疫苗贴片进行经皮给药时可以得到相对平衡的Th1和Th2型免疫应答。通过上述实验结果可以得出使用本实施例得到的可溶性微针疫苗贴片进行经皮给药时可以取得优于比较例4、5、6的免疫效果。
实施例5.
采用比较例1的方法制备得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片。其中HBSAg负载在可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有HBSAg（贴片1）。采用比较例3的方法制备得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片。其中负载HBSAg的中空阳离子脂质体纳米颗粒（Lip-HBSAg）负载在可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-HBSAg（贴片2）。将贴片1和贴片2分别加入到10ml蒸馏水中，分别在不同时间点取样，检测HBSAg的总释放率。贴片1中HBSAg总释放率随时间变化如图10所示；贴片2中HBSAg总释放率随时间变化如图11所示。通过图10和图11对比发现贴片2需要更长的时间才能实现HBSAg完全释放，说明HBSAg负载在中空阳离子脂质体纳米颗粒上后具有更好的缓释能力。
实施例6.
本实施例中疫苗选取表达乙型肝炎病毒表面抗原的MVA病毒载体疫苗（rMVAS2S），佐剂为Th1型佐剂CpG OND。除使用rMVAS2S代替实施例3中的HBSAg之外，采用实施例3所述的负载药物的中空阳离子纳米颗粒的制作方式，制作得到同时负载了rMVAS2S和CpG OND佐剂的中空阳离子脂质体纳米颗粒(Lip-rMVAS2S-CpG OND)，其中，中空阳离子脂质体纳米颗粒：rMVAS2S：CpGOND的重量比为5：1：1。将Lip-rMVAS2S-CpG OND加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中Lip-rMVAS2S-CpG OND在针体制作液所占的总重量百分含量为7%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中Lip-rMVAS2S-CpG OND主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有Lip-rMVAS2S-CpG OND。Lip-rMVAS2S-CpG OND在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为7%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在每次给药前一天从小鼠尾静脉取血，获得血清，测定血清中针对乙型肝炎病毒表面抗原的特异性抗体，最终可以得到效价为1：6400的针对乙型肝炎病毒表面抗原的特异性抗体。
实施例7
本实施例中疫苗选取肺炎球菌疫苗，佐剂为Th1型佐剂CpG OND，中空聚乳酸纳米颗粒的粒径为200纳米。首先制作得到了同时负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒，其中，中空聚乳酸纳米颗粒：肺炎球菌疫苗：CpGOND的重量比为5：1：1。将负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒在针体制作液所占的总重量百分含量为7%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒。负载了肺炎球菌疫苗和CpG OND的中空聚乳酸纳米颗粒在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为7%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在每次给药前一天从小鼠尾静脉取血，获得血清，测定血清中针对肺炎球菌的特异性抗体，最终可以得到效价为1：6400的针对肺炎球菌的特异性抗体。
实施例8
本实施例中疫苗选取乙脑减毒疫苗，佐剂为Th1型佐剂CpG OND，中空聚原酸酯纳米颗粒的粒径为200纳米。首先制作得到了同时负载了乙脑减毒疫苗和CpG OND的中空聚原酸酯纳米颗粒，其中，中空聚原酸酯纳米颗粒：肺炎球菌疫苗：CpGOND的重量比为5：1：1。将负载了乙脑减毒疫苗和CpG OND的中空聚原酸酯纳米颗粒加入到重量百分含量为5%的HA水溶液中，得到针体制作液，其中负载了乙脑减毒疫苗和CpG OND的中空聚原酸酯纳米颗粒在针体制作液所占的总重量百分含量为7%。除将本实施例制备的上述针体制作液替代比较例1中的针体制作液之外，采用与比较例1相同的方法及背衬制作液制作可溶性微针疫苗贴片。得到以CS和HA混合材料为主要基质材料的含有36根微针针体的可溶性微针疫苗贴片，可溶性微针针体的高度约为650微米，针尖的角度为35度。其中负载了乙脑减毒疫苗和CpGOND的中空聚原酸酯纳米颗粒主要负载在上述得到的可溶性微针疫苗贴片的36根微针针体的每一根微针针体的前端约200微米的长度区域，每一根微针针体的后端不负载有负载了乙脑减毒疫苗和CpG OND的中空聚原酸酯纳米颗粒。负载了乙脑减毒疫苗和CpG OND的中空聚原酸酯纳米颗粒在可溶性微针疫苗贴片针体中所占的总重量百分含量为7%。
采用与比较例1相同的程序实施可溶性微针疫苗贴片的经皮给药程序。并在每次给药前一天从小鼠尾静脉取血，获得血清，测定血清中针对乙脑病毒的特异性抗体，最终可以得到效价为1：6400的针对乙脑病毒的特异性抗体。
Claims (11)
1.一种以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的可溶性微针疫苗贴片是由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成；其中所述的目标药物负载在所述的可溶性微针针体的前端；所述的目标药物是疫苗及适用于此种疫苗的佐剂，所述的疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂是负载在纳米颗粒上，其中疫苗：佐剂：纳米颗粒的重量比在1:1:1～1:10:50范围之内；疫苗、佐剂和纳米颗粒在所述的可溶性微针针体中所占的总重量的百分含量为0.1％～50％；并且所述的纳米颗粒是均匀地分布在所述的可溶性微针针体的前端；
所述的可溶性微针基底和可溶性微针针体的材料都是水溶性高分子材料；
所述的水溶性高分子材料选自透明质酸钠、硫酸软骨素中的一种或者几种；
所述的纳米颗粒选自聚羟基乙酸纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚原酸酯纳米颗粒、脂质体纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒中的一种。
2.根据权利要求1所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的目标药物是负载在所述的可溶性微针针体的前端，其负载有目标药物的可溶性微针针体部分占整个可溶性微针针体总长度的20～80％。
3.根据权利要求1或2所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的可溶性微针针体的高度为150～800微米；所述的可溶性微针针体的针尖的角度为30～40度。
4.根据权利要求1所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的水溶性高分子材料的重均分子量范围为2000～100000。
5.根据权利要求1所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的纳米颗粒的粒径是10～1000nm。
6.根据权利要求5所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的纳米颗粒为中空的纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的疫苗选自减毒活疫苗、亚单位疫苗、多糖-蛋白质偶联疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗中的一种；
所述的佐剂是Th1型佐剂。
8.根据权利要求7所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片，其特征是：所述的减毒活疫苗是麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙脑减毒活疫苗或手足口疫苗；
所述的亚单位疫苗是乙肝疫苗或流感疫苗；
所述的多糖-蛋白质偶联疫苗是肺炎球菌疫苗、A群流脑疫苗或A+C群流脑疫苗；
所述的DNA疫苗是表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗；
所述的病毒载体疫苗是重组活病毒疫苗，所述的重组活病毒疫苗是痘病毒载体疫苗或腺病毒载体疫苗；
所述的Th1型佐剂是人未甲基化寡聚脱氧核苷酸。
9.一种根据权利要求1～8任意一项所述的以水溶性高分子材料作为基质材料制作的适用于疫苗经皮给药的可溶性微针疫苗贴片的制备方法，其特征是：所述的制备方法包括以下步骤：
(1)配制含有纳米颗粒、疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂的水溶性高分子材料的水溶液作为针体制作液，然后将针体制作液覆盖到表面具有所需数量的针孔的反转模具中；在密闭容器中于2～5倍大气压下作用10～30秒钟，使针体制作液进入到所述的针孔中，回收反转模具上剩余的针体制作液；将已加入针体制作液的反转模具于温度为2℃～40℃的条件自然晾干，在反转模具中得到可溶性微针针体，且负载有疫苗及其适用于此种疫苗的佐剂的纳米颗粒是均匀地分布在所述的可溶性微针针体的前端；
(2)将水溶性高分子材料溶解于水中，得到浓度为30wt％～80wt％，黏度为600～2000厘帕的不含目标药物的水溶性高分子材料的水溶液作为背衬制作液，然后倒入步骤(1)覆盖有针体制作液并干燥后得到的反转模具中，室温下放置；然后置于密闭容器中，在密闭容器中于2～5倍大气压下作用1～10分钟，使所述的针孔中残存的空气溢出；然后将覆盖有背衬制作液的反转模具于温度为2℃～40℃的条件下干燥，得到由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成的可溶性微针疫苗贴片。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征是：所述的针体制作液中的水溶性高分子材料的水溶液的重量百分含量为5～10％；
所述的针体制作液中的疫苗：佐剂：纳米颗粒的重量比在1:1:1～1:10:50范围之内。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征是：所述的针体制作液的黏度低于100厘帕。
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