KR20110128923A - 인간 ｆａｓ에 대한 인간 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 Fas (Fas)에 대해 지시된 결합 요소, 특히 F45D9 (이는 IgG1 또는 IgG4 포멧일 수 있음)로 지칭되는 항체 분자의 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 사용하는 인간 Fas에 대한 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 아팝토시스를 수반하는 환자, 질환 또는 장애, 예컨대 이식-대-숙주 질환, HIV-감염, 스티븐스-존슨 증후군 또는 독성 표피 괴사용해, 인슐린-의존성 당뇨병에 대한 치료로서의 섬 이식, 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 심장 질환, 신장 질환, 신경계 장애 및 손상, 및 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈에서 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 ＦＡＳ에 대한 인간 항체 및 그의 용도{HUMAN ANTIBODIES AGAINST HUMAN FAS AND THEIR USE}
본 발명은 인간 Fas (Fas)에 대해 지시된 결합 요소, 특히 인간 Fas에 대한 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 F45D9로 지칭되는 본원의 항체 분자의 항체 VH 및/또는 VL 도메인를 사용한다. 추가의 바람직한 실시양태는 F45D9 중쇄 가변 (VH) 및/또는 경쇄 가변 (VL) 도메인의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR), 특히 다른 항체 프레임워크 영역의 VH CDR3을 사용한다.
Fas/APO-1은 1989년에 처음 문헌에 게재되었으며, 이는 일본의 미나코 요네하라(Minako Yonehara) 및 독일의 페터 크라머(Peter Krammer)가 이끄는 두 독립적인 그룹에 의해 기재되었다 (문헌 [Yonehara, S. et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756, 1989], [Trauth B. C. et al., Science, 245:301-305, 1989]). 두 팀은 Fas (CD95)가 효능성 항-Fas 항체와 가교되었을 때 세포 사멸을 촉발시키는, 인간 림프구 상에서 발현되는 세포 표면 분자라고 보고하였다.
CD95 및 그의 리간드 CD95L의 상호작용에 의해 매개되는 아팝토시스는 T 세포에서 가장 잘 이해되는 아팝토시스 시스템 중 하나이다. CD95는 45-kDa 제I형 막횡단 단백질이며, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 패밀리에 속한다 (문헌 [Itoh, N. et al. Cell, 66:233-243, 1991]). CD95는 다양한 조직에서 광범위하게 발현되며, 특히 흉선 세포 및 T 세포에서 풍부하게 발현된다 (문헌 [Klas C. et al. Int. Immunol., 5:625-630, 1993]; [Ogasawara J. et al., J. Exp. Med., 181:485-491]).
CD95의 리간드인 CD95L은 CD40-kDa 제II형 세포 표면 당단백질이며, TNF 패밀리에 속한다 (문헌 [Suda, T. et al., Cell, 75:1169-1178, 1993]). CD95L이 면역-회피 부위에서 및 활성화된 T 세포 및 NK 세포 상에서 주로 검출됨에 따라, 그의 발현은 보다 엄격하게 제어되는 것으로 보인다. CD95에 대한 CD95L의 결합은 일반적으로 CD95 보유 세포에서 신속한 카스파아제-의존성 아팝토시스를 유발한다 (문헌 [Tomohiro Takahashi, et al., Int. Immunol., 6:1567-1574, 1994]). TNF의 경우에서와 같이, 인체의 인간 CD95L은 삼량체의 형태일 것으로 추정된다 (문헌 [Masato Tanaka, et al., EMBO J., 14:1129-1135, 1995]).
면역계에서 CD95/CD95L에 대한 역할은 림프구증식 및 림프절병증과 비장 비대증에서의 명백한 발생을 특징으로 하는 자가면역 질환이 자발적으로 발생한 마우스의 연구에 의해 지지된다. 이들 마우스는 CD95 발현의 감소를 유발하는 결함을 갖는 것으로 밝혀졌다 (림프구증식의 경우 lpr 마우스로 지칭됨) (문헌 [Watanabe-Fukunaga R. et al., Nature, 356:314-317, 1992]). 또한, 단백질을 수용체에 결합할 수 없도록 하는 CD95L의 돌연변이를 보유하는 gld 마우스 (일반화된 림프구증식성 장애의 경우)가 매우 유사한 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Lynch, D.H., et al., Immunity 1:131-136, 1994]; [Takahashi T. et al., Cell, 76:969-976, 1994]). 최근, CD95L에 결함이 있고, gld 마우스보다 훨씬 더 심각한 표현형을 나타내는 마우스가 생성되었으며, 이는 다시 자가반응성 림프양 세포의 제거 및 면역계 항상성에 있어 이들 유전자의 중요성을 강조한다 (문헌 [Karray S. et al., J. Immunol., 172:2118-2125, 2004]).
여러 연구에서 CD95 신호전달이 T 및 B 세포 발생, 성숙 및 결실을 조절할 수 있는 다수의 모델이 제공되었다. 감염에 대한 후천성 면역 반응 동안 활성화된 T 세포는 활성화 유도 세포 사멸 (AICD)로 불리는 과정에서 CD95-매개 아팝토시스에 의해 결실된다. 또한, Fas-매개 아팝토시스는 항원-제시 세포와 같은 후천성 면역에 관여하는 다른 세포를 조절하고, 세포독성 T 림프구 (CTL)가 외래 항원을 발현하는 세포에서 아팝토시스를 유발하는 주요 메카니즘이다 (문헌 [Medema, J.P. et al., Eur. J. Immunol., 27:3492-3498, 1997]).
면역계에서의 그의 역할 이외에도 CD95/CD95L이 너무 많거나 또는 너무 적은 아팝토시스를 특징으로 하는 다양한 질환의 발병에 필수적인 역할을 수행한다는 증거가 또한 존재한다. CD95/CD95L은 적어도 부분적으로 HIV-유도된 CD4+ T 세포 고갈에 중요한 역할을 수행한다고 제안되었다 (문헌 [Katsikis, P.D. J Exp. Med. 181:2029, 1995]; [Gehri, R. AIDS, 10:9-16, 1996]). Fas-매개 아팝토시스는 또한 전격성 간염 (문헌 [Song, E. et al. Nat. med. 9:347, 2003]), 허혈성 재관류 손상 (문헌 [Lee, P. et al. Am. J. Physiol. Heart Circul., 284: H456, 2003]), 허혈후 뉴런 변성 (문헌 [Martin-Villalba A. et al., J. Neurosci. 19:3809-17, 1999]), 외상성 뇌 손상 동안 (문헌 [Qiu J. et al., J. Neurosci., 22:3504-3511, 2002]), 이식-대-숙주-질환 (GVHD) (문헌 [Via, C., et al., J. Immunol., 157:5387-5393, 1996]) 및 몇몇 유형의 자가면역 질환 (문헌 [Nishimura-Morita Y. et al., Int. Immunol., 9:1793, 1997])에 관련되어 있다. 이러한 상황을 고려하여, CD95/CD95L 경로를 조절하는 시약, 예컨대 효능성 또는 길항성 항-CD95 항체는 이들 질환에 치료제로 사용하기 위한 후보물질을 나타낸다.
본원에 제공되고 본원 발명자들에 의해 수득되는 항체 분자는 하기 추가로 논의되는 바와 같이 (특히, F45D9) 현저하게 유리한 특성을 나타낸다. 이들 항체 분자는 본원 발명자들이 고안하고 이전에 보고된 바 없는 전략에서의 기술의 조합으로 수득하였다.
본원 발명자들은 완전히 인간일 수 있으며, 인간 Fas 분자 뿐만 아니라 비-인간 영장류 (침팬지 및 코먼 마모셋 (common marmoset)) Fas에 높은 친화도로 결합하고 FasL/Fas-매개 아팝토시스를 억제하는 모노클로날 항체 분자를 최초로 제공하였다. 본 발명의 특정 측면에 따라 본원에 제공된 항체 분자는 시험관내에서 아팝토시스를 유도하지 않고, 코먼 마모셋을 사용하는 전임상 안전 모델에서 생체내 높은 투여량에서 허용가능하다. 본원에 제공된 항체 분자는 예를 들어 인간 및/또는 코먼 마모셋 T 세포 및 B 세포 (시험관내)의 FasL/Fas-매개 아팝토시스 및 인간 표적 세포를 사용하는 SCID 마우스 모델 (생체내)에서의 FasL/Fas-매개 아팝토시스를 길항할 수 있다. 제공된 항체 분자는 활성화 및 증식을 위한 공동-자극 신호 및 생존을 유도하는 비-아팝토시스성 Fas-매개 신호전달과 같은 아팝토시스-관련 신호전달 이외의 신호를 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 항체 분자 (F(ab')2 단편일 수 있음)는 수용체 점유율이 ≥12％일 때 Fas-유도 아팝토시스를 완전히 차단하는 특성을 가질 수 있다.
우수한 특성은 F45D9의 특성을 갖는 결합 요소가 그의 생리적 설정에서 hFas에 결합하는데 매우 유리하다는 것을 의미한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 F45D9 및 다른 결합 요소는 이에 따라 Fas에 결합하고 아팝토시스를 억제하는데 사용될 수 있다. 이는 질환 또는 장애, 예컨대 (1) 이식-대-숙주 질환 (GVHD), (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 또는 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체, (3) 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군 (SJS) 및 독성 표피 괴사용해 (TEN), (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)을 위한 치료로서의 섬 이식, (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 특히 심장, 신장, 간, 폐, 장 또는 뇌에서의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환 (예를 들어, 졸중); 및 수술 또는 이식과 연관된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환 및 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 연관된 허혈성 재관류 손상, (6) 심장 질환, 바람직하게는 허혈성 심장 질환, 특히 심근 경색; 심부전; 및 허혈성 재관류 손상, (7) 신장 질환, 바람직하게는 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상 및 급성 신부전, (8) 신경계 장애 및 손상, 특히 뇌 또는 척수 손상, 및 졸중, (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 인간 Fas에 대한 결합, 바람직하게는 Fas-매개 아팝토시스의 억제 (이에 제한되지는 않음)에 유용하고, Fas-매개 아팝토시스를 경험한 세포가 소정의 역할을 수행하는 다양한 질환 및 장애에서 치료적 잠재성을 갖는다. 예시적 질환 및 장애는 본원에서 추가로 논의된다.
도 1a는 지시된 바와 같이 상이한 농도에서 적정된, 저캣(Jurkat) 세포에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 결합의 결과를 보여준다. 다이아몬드형: F45D9-γ1; 정사각형: F45D9-γ4.
도 1b는 저캣 세포의 표면에 대한 F45D9-γ1의 반응성을 결정하는 실험의 결과를 보여준다. 굵은 실선은 F45D9-γ1 mAb에 의한 염색을 나타내고, 가는 실선은 이소형 대조군 항체에 의한 염색을 나타낸다.
도 1c는 SKW6.4 세포에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 결합의 결과를 보여준다 (적정). 다이아몬드형: F45D9-γ1; 정사각형: F45D9-γ4.
도 2a는 재조합 sFas와의 사전-인큐베이션에 의해 저캣 세포주의 표면에 대한 항체 결합의 차단을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 솔리드 블록: F45D9-γ1; 오픈 블록: F45D9-γ1 + sFas*.
도 2b는 재조합 sFas와의 사전-인큐베이션에 의해 SKW6.4 세포 (악성 인간 림프모구양 B 세포)의 표면에 대한 항체 결합의 차단을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 솔리드 블록: F45D9-γ1; 오픈 블록: F45D9-γ1 + sFas*.
도 2c는 상이한 수준의 Fas를 발현하는 저캣 세포의 표면에 대한 F45D9-γ4 mAb 결합의 히스토그램을 보여준다. 굵은 실선은 F45D9-γ4 mAb 또는 항-CD95 양성 대조군 mAb에 의한 염색을 나타내고, 채워진 히스토그램은 대조군 항체로의 염색을 나타낸다.
도 3a는 2.12, 4.25, 17 및 68 3, 6, 33, 66, 132 nM mAb 농도에서 Fas에 대한 F45D9-γ1 mAb 상호작용의 결합을 보여주는 2가 분석물 대입된 센소그램을 보여준다. 센소그램은 백그라운드 차감 후 상대적 반응 (반응 단위) 대 시간 (초)을 보여준다.
도 3b는 2.12, 4.25, 17 및 68 nM mAb 농도에서 Fas에 대한 F45D9-γ4 mAb 상호작용의 2가 분석물 대입된 센소그램을 보여준다. 센소그램은 백그라운드 차감 후 상대적 반응 (반응 단위) 대 시간 (초)을 보여준다. 도 3b는 결합 및 친화도 상수를 계산하기 위한 비아코어(BIAcore) 모델의 적용 결과를 보여준다. 1:1 결합 모델은 3, 6 및 33 nM을 사용하는 우수한 대입을 제공하였다.
도 4는 JPT 펩티드 테크놀로지(JPT peptide technology)로부터의 펩티드 마이크로어레이를 사용하는 에피토프 맵핑 분석 후 결합 펩티드 31, 32 및 33의 아미노산 서열을 갖는 Fas 분자 아미노산 서열의 정렬을 보여준다.
도 5는 Fas의 도메인 구조 및 F45D9 항체 분자에 의해 결합된 펩티드의 공통 영역 (145-164 aa)을 보여준다. PLAD: 프리-리간드-결합 어셈블리 도메인, TM: 막횡단 도메인.
도 6a는 F45D9-γ1이 단독으로 저캣 세포에서 아팝토시스를 유도하지 않는다는 것을 입증하는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다.
도 6b는 F45D9-γ4가 단독으로 저캣 세포에서 아팝토시스를 유도하지 않는다는 것을 입증하는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다.
도 6c는 F45D9-γ1에 의한 저캣 세포에서 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다.
도 6d는 F45D9-γ1에 의한 SKW6.4 세포에서 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주고, 다시 F45D9-γ1이 단독으로 아팝토시스를 유도하지 않는다는 것을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다.
도 6e는 지시된 바와 같이 상이한 농도에서 적정된, 저캣 세포에 대한 F45D9-γ1, F45D9-γ4, F45D9-γ1 F(ab)2 또는 Fab 단편의 결합의 결과를 보여준다.
도 6f는 F45D9-γ1, F45D9-γ4, F45D9-γ1 F(ab)2 또는 Fab 단편에 의한 저캣 세포에서의 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다.
도 7a는 F45D9-γ1에 의한 활성화된 인간 T 세포의 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다. F45D9-γ1은 단독으로 활성화된 인간 T 세포의 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 7b는 활성화된 인간 T 세포 상에서 Fas에 대한 F45D9-γ1의 결합을 결정하는 실험의 결과를 보여준다 (적정).
도 7c는 F45D9-γ4에 의한 활성화된 인간 T 세포의 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하는 실험의 결과를 보여준다. F45D9-γ4 단독은 활성화된 인간 T 세포의 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 7d는 활성화된 인간 T 세포 상에서 Fas에 대한 F45D9-γ4의 결합을 결정하는 실험의 결과를 보여준다 (적정).
도 8은 상응하는 처리된 동물로부터 수득하여 세포 사멸을 검출하기 위해 튜넬 검정(TUNEL assay)을 행한 조직 절편의 이미지를 도시한다. 조직에서 세포 사멸을 검출하기 위한 검정의 사용에 선행하는 동물 처리 절차의 설명도 역시 도시한다. 튜넬 염색에서 적색 영역이 사멸된 세포이다.
도 9a는 유세포분석에 의해 측량된, 상이한 종으로부터의 세포 상의 Fas 항원에 대한 항체의 반응성을 보여주는 결과를 갖는 히스토그램을 도시한다. 굵은 실선은 항-Fas 항체에 의한 염색을 나타내고, 가는 실선은 이소형 대조군 항체에 의한 염색을 나타낸다.
도 9b는 유세포분석에 의해 측량된, 상이한 종으로부터의 세포 상의 Fas 항원에 대한 항체의 반응성을 보여주는 결과를 갖는 히스토그램을 도시한다. 굵은 실선은 항-Fas 항체에 의한 염색을 나타내고, 가는 실선은 이소형 대조군 항체에 의한 염색을 나타낸다.
도 9c는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, SKW6.4 세포 및 2 종의 마모셋 B 세포주 (9505 및 9601)에 대한 F45D9-γ1의 결합의 결과를 도시한다.
도 9d는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, SKW6.4 세포 및 2 종의 마모셋 B 세포주 (9505 및 9601)에 대한 F45D9-γ4의 결합의 결과를 도시한다.
도 9e는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, 마모셋 동물로부터 단리한 PBMC에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 결합의 결과를 도시한다.
도 9f는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, 건강한 인간 공여자로부터 단리한 PBMC에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 결합의 결과를 도시한다.
도 9g는 인간 (좌측 패널) 및 마모셋 (우측 패널) 간 조직에서의 F45D9-γ4 (상단) 및 인간 IgG4 이소형 대조군 (하단)의 반응성을 보여주는 면역조직화학 염색의 결과를 도시한다.
도 10a는 마모셋 B 세포주 (9505)에서의 F45D9-γ1에 의한 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 측정한 실험의 결과를 도시하며; F45D9-γ1는 단독으로는 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 10b는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, 마모셋 B 세포주 (9505) 및 인간 B 세포주 (SKW6.4)에서의 F45D9-γ4에 의한 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 측정한 실험의 결과를 도시하며; F45D9-γ4는 단독으로는 마모셋 세포의 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 10c는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, F45D9-γ4에 의한 활성화된 마모셋 림프구 (마모셋 1196)의 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신(Annexin)-V 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 이후의 아팝토시스를 측정한 실험의 결과를 도시한다 (배지 단독에서의 세포의 아팝토시스는 차감함). F45D9-γ4는 단독으로는 활성화된 마모셋 림프구의 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 10d는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, F45D9-γ4에 의한 활성화된 마모셋 림프구 (마모셋 1181)의 rFasL-유도 아팝토시스의 차단을 보여주는, 아넥신-V 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 이후의 아팝토시스를 측정한 실험의 결과를 도시한다 (배지 단독에서의 세포의 아팝토시스는 차감함). F45D9-γ4는 단독으로는 활성화된 마모셋 림프구의 아팝토시스를 유도하지 않는다.
도 11a는 인간 T 세포의 활성화에 대한 F45D9-γ1 효과를 측정하는 실험에서 CD4+ T 세포에 대한 CD25 및 CD69 이중 양성 세포의 백분율을 도시한다.
도 11b는 인간 T 세포의 활성화에 대한 F45D9-γ1 효과를 측정하는 실험에서 CD8+ T 세포에 대한 CD25 및 CD69 이중 양성 세포의 백분율을 도시한다.
도 12a는 3H-티미딘 혼입을 측정하는 것에 의한 Fas-매개 T 세포 증식, 및 F45D9-γ1의 증강 효과를 측정한 실험의 결과를 도시한다.
도 12b는 CFSE 염색 후에 측정한, Fas-매개 T 세포 증식을 측정한 실험의 결과를 도시한다.
도 13은 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 측정한 실험 결과를 도시한다. 사각형: IgG4; 원형: IgG1.
도 14는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 측정한 실험의 결과를 도시한다.
도 15는 F45D9-γ1 (좌측 패널) 및 APO-1-3 (우측 패널 - 마우스 항-Fas 항체, 양성 대조군으로서 사용됨)의 시험관내 간독성의 측정의 결과를 도시한다.
도 16a는 미스매치 세팅하고 MLR 및 피부 체외이식편 웰에 F45D9 항체를 첨가한 조건하에서 인간 GVHD의 피부 체외이식편 모델을 이용한 6 종의 실험 중 3 종 (화살표로 표시)으로부터의 피부 조직 절편에서 GvHR을 하향 조절하는데 있어서의 인간 F45D9-γ1 항-Fas 항체의 효과를 도시한다.
도 16b는 인간 GVHD의 대표적인 실험용 피부 체외이식편 모델로부터의 피부 조직 절편에서 GvHR을 하향 조절하는데 있어서의 인간 F45D9-γ1 항-Fas 항체의 효과를 도시한다.
도 16c는 인간 GVHD의 피부 체외이식편 모델에서의 F45D9-γ1 또는 대조군 인간 IgG1로 처리한 MLR로부터의 상층액 내 IL-10 측정의 결과를 도시한다.
도 16d는 인간 GVHD의 피부 체외이식편 모델에서의 F45D9-γ1 또는 대조군 인간 IgG1로 처리한 MLR로부터의 상층액 내 IL-2 측정의 결과를 도시한다.
도 16e는 미스매치 세팅하고 MLR 및 피부 체외이식편 웰에 F45D9 항체를 첨가한 조건하에서 인간 GVHD의 피부 체외이식편 모델을 이용한 9 종의 실험 중 4 종 (화살표로 표시)으로부터의 피부 조직 절편에서 GvHR을 하향 조절하는데 있어서의 인간 F45D9-γ4 항-Fas 항체의 효과를 도시한다.
도 17a는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, F45D9-γ4 mAb에 의한 HLA-A2 발현 LCL BK-B5의 Ates B 매개 사멸의 차단을 보여주는, 51Cr 방출 검정에 있어서의 특이적 용해 백분율 (％ 사멸 억제로 나타내어지는 결과)을 측정한 실험의 결과를 도시한다.
도 17b는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, F45D9-γ4 mAb에 의한 BK-B5 표적의 CMA 처리된 동종이형 T 세포 클론 (310905/Mon-B1)에 의해 매개되는 세포용해의 차단을 보여주는, 51Cr 방출 검정에 있어서의 특이적 용해 백분율 (％ 사멸 억제로 나타내어지는 결과)을 측정한 실험의 결과를 도시한다.
도 17c는 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 적정한, F45D9-γ4 mAb, 항-FasL NOK-2 mAb, 및 Fas-Fc 융합 단백질에 의한 BK-B5 표적 세포의 Ates B 매개 사멸의 차단을 보여주는, 51Cr 방출 검정에 있어서의 특이적 용해 백분율 (사멸％)을 측정한 실험의 결과를 도시한다.
하기 서열을 본원에서 개시한다:
서열 1 F45D9 VH 코딩 뉴클레오티드 서열
서열 2 F45D9 VH 아미노산 서열
서열 3 F45D9 VL 코딩 뉴클레오티드 서열
서열 4 F45D9 VL 아미노산 서열
서열 5 F45D9 VH CDR1 아미노산 서열
서열 6 F45D9 VH CDR2 아미노산 서열
서열 7 F45D9 VH CDR3 아미노산 서열
서열 8 F45D9 VL CDR1 아미노산 서열
서열 9 F45D9 VL CDR2 아미노산 서열
서열 10 F45D9 VL CDR3 아미노산 서열
서열 11 인간 Fas 항원 아미노산 서열
서열 12 JPT31 펩티드 아미노산 서열
서열 13 JPT32 펩티드 아미노산 서열
서열 14 JPT33 펩티드 아미노산 서열
서열 15 JPT31, 32 및 33 펩티드 공통 영역 아미노산 서열
서열 16 F45D9-IgG4 중쇄 아미노산 서열
한 측면에서, 본 발명은 인간 Fas에 결합하고 F45D9 VH 도메인 (서열 2) 및/또는 F45D9 VL 도메인 (서열 4)을 포함하는 결합 요소를 제공한다.
일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여 항체 항원 결합 부위를 제공하지만, 이하에서 추가로 논의하는 바와 같이 VH 도메인이 단독으로 항원 결합에 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, F45D9 VH 도메인 (서열 2)은 F45D9 VL 도메인 (서열 4)과 쌍을 형성하여, F45D9 VH 및 VL 도메인 둘 모두를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 다른 실시양태에서, F45D9 VH는 F45D9 VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄 불규칙성(promiscuity)은 당업계에 잘 확립되어 있다.
F45D9 VH 또는 VL 도메인으로부터 하나 이상의 CDR을 골라서 적합한 프레임워크에 혼입시킬 수 있다. 이는 이하에서 추가로 논의한다. F45D9 VH CDR의 1, 2 및 3을 각각 서열 5, 6 및 7에 나타낸다. F45D9 VL CDR의 1, 2 및 3을 각각 서열 8, 9 및 10에 나타낸다.
그 서열이 본원에 제시되고 인간 Fas에 대한 결합 요소로 사용될 수 있는 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법으로 수득할 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 방법을 제공한다.
그 서열이 본원에 구체적으로 개시된 VH 및 VL 도메인 중 임의의 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 논의되는 바와 같이 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 아마도 약 20개 미만의 변경, 약 15개 미만의 변경, 약 10개 미만의 변경 또는 약 5개 미만의 변경, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 변경을 포함할 수 있다. 변경은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 임의의 결합 요소와 항원에 대한 결합을 경쟁하는 것일 수 있으며, 이들은 둘 모두 항원에 결합하고, 결합 요소, 본원에서 개시하는 VH 및/또는 VL 도메인, 또는 본원에서 개시하는 VH CDR3, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체를 포함한다. 결합 요소 사이의 경쟁은, 예를 들어 ELISA를 이용하고/거나, 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 결합 요소의 확인이 가능하도록 다른 비태깅된 결합 요소(들)의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 특이적인 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관 내에서 쉽게 검정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 인간 Fas에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 요소를 제공한다.
인간 Fas에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁할 수 있는 인간 Fas에 대한 항체를 수득하기 위하여 당업계의 다양한 방법을 이용할 수 있다.
주지된 바와 같이, F45D9에 의해 인식되는 에피토프는 SNTKCKEEGSRSNLGWLCLL (서열 15) 내에 존재한다. 본 발명은 F45D9가 결합하는 서열 12, 13 및/또는 14의 펩티드 또는 이들의 임의의 하나 이상의 단편에 결합하는 결합 요소, 및 F45D9가 결합하는 서열 12, 13 및/또는 14의 펩티드 또는 이들의 임의의 하나 이상의 단편에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁하는 결합 요소를 제공한다.
본 발명의 결합 요소는 하기의 임의의 것 중 하나 이상일 수 있거나, 또는 임의의 조합일 수 있다:
- 인간 Fas에 결합함;
- 비인간 영장류 코먼 마모셋 Fas에 결합함;
- 비인간 영장류 침팬지 Fas에 결합함;
- F45D9가 결합하는 서열 12의 펩티드 또는 그의 단편에 결합함;
- F45D9가 결합하는 서열 13의 펩티드 또는 그의 단편에 결합함;
- F45D9가 결합하는 서열 14의 펩티드 또는 그의 단편에 결합함;
- F45D9가 결합하는 서열 12의 펩티드 또는 그의 단편에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁함;
- F45D9가 결합하는 서열 13의 펩티드 또는 그의 단편에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁함;
- F45D9가 결합하는 서열 14의 펩티드 또는 그의 단편에의 결합에 대해 F45D9와 경쟁함;
- 시험관내 및/또는 SCID 마우스 모델에서 세포, 예를 들어 T 세포 및/또는 B 세포의 인간 Fas-매개 아팝토시스를 억제하거나 길항작용함 (세포는 인간 또는 비인간, 예를 들어 코먼 마모셋의 것임);
- 시험관내 및/또는 SCID 마우스 모델에서 세포, 예를 들어 T 및/또는 B 세포의 rhFasL-유도 아팝토시스를 억제하거나 길항작용함 (세포는 인간 또는 비인간, 예를 들어 코먼 마모셋의 것임);
- 인간 T 세포의 증식에 있어서, 예를 들어 항-CD3 항체 분자와 함께 공동-자극 신호를 매개함;
- 보체 의존성 세포독성을 유도하지 않음;
- 0.15 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml의 농도에서 보체 의존성 세포독성을 유도하지 않음;
- 예를 들어 XTT 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 1차 인간 간세포에서 간독성을 유도하지 않음;
- 예를 들어 XTT 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 0.1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml 범위의 농도에서 1차 인간 간세포에서 간독성을 유도하지 않음;
- IgG1 이소형 형태에서 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도함;
- IgG4 이소형 형태에서 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하지 않음;
- 인간 GVHD의 실험용 피부 체외이식편 모델로부터의 피부 조직 절편에서 GvHR을 억제함;
- 인간세포독성 T 세포 (CTL) 활성을 억제하거나 길항작용함.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 요소의 라이브러리와 항원을 접촉시키는 단계, 및 상기 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합 요소를 선별하는 단계를 포함하는, 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 요소를 수득하는 방법을 제공한다.
라이브러리는 박테리오파지 또는 다른 생물학적 입자의 표면 상에 디스플레이될 수 있으며, 이때 각각의 입자는 그의 표면 상에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 또한 존재한다면, 임의로 디스플레이된 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 대체물은 리보좀 또는 펩티드 디스플레이를 포함하며, 이로써 항체 가변 도메인은 코딩 핵산이 또한 결합되는 선별가능한 물질에 결합된다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 다른 입자 상에 디스플레이되거나, 또는 리보좀 또는 다른 선별가능한 물질에 결합되는 결합 요소를 선별한 후, 상기 선별된 결합 요소를 디스플레이하거나 또는 그에 결합된 입자, 리보좀 또는 다른 선별가능한 물질로부터 핵산을 수득할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선별된 결합 요소를 디스플레이하는 입자 또는 선별된 결합 요소가 결합된 다른 선별가능한 물질로부터 수득한 핵산 서열과 함께 핵산을 발현시키는 것에 의해 결합 요소 또는 항체 VH 가변 도메인 (임의로 항체 VL 가변 도메인)을 후속 생산하는데 사용될 수 있다.
이같은 VH 도메인을 포함하는 결합 요소와 마찬가지로, 상기 선별된 결합 요소의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인을 단리된 형태로 제공할 수 있다.
인간 Fas에 결합하는 능력은 추가로 시험할 수 있으며, 또한 결합 요소가 인간 Fas에의 결합에 대해 F45D9 VH 및 F45D9 VL 도메인으로 구성된 항원 결합 부위와 경쟁하는 능력도 추가로 시험할 수 있다. 이하에서 추가로 논의하는 바와 같이, Fas의 작용을 길항하는 능력을 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 F45D9의 친화성을 갖는 인간 Fas와 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 결합 요소의 친화성은 저캣 세포주의 표면 상의 Fas 분자에 결합하는 항체의 비아코어, Fas 특이적 ELISA 및/또는 유세포분석 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 F45D9의 효능에 의해 아팝토시스를 억제할 수 있다. 이는 아넥신-V 및 프로피듐 요오다이드 염색, 및 저캣 세포주의 재조합 FasL-유도 아팝토시스의 유세포분석 검정에 의해 측정될 수 있다.
상이한 결합 요소의 결합 친화성 및 효능은 적절한 조건 하에 비교될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 Fas-매개 아팝토시스를 억제할 수 있으며, 이는 아넥신-V 및 프로피듐 요오다이드 염색, 및 저캣 세포주의 재조합 FasL-유도 아팝토시스의 유세포분석 검정에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소는 항체 서열 이외에도 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 폴딩된 도메인을 형성하거나 또는 항원에 결합하는 능력 이외의 다른 기능적 특성을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 요소는 검출가능한 표지를 가질 수 있거나, 또는 독소 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 접합될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 상기 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 생산하는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키고, 그를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 결합 요소, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 결합 요소는 환자에게 유효량의 본 발명의 결합 요소를 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 치료 또는 진단 방법, 예컨대 인간 환자에서 질환 또는 질병의 치료 (예방적 치료를 포함할 수 있음) 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 상태에는 본원에서 논의된 것이 포함한다. 본 발명은 이러한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 결합 요소를 포함하는 조성물, 및 이러한 방법에 따라 진단 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 결합 요소의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 본원에 개시된 항체 VH 가변 도메인 및/또는 VL 가변 도메인을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열, 특히 서열 5, 6 및 7로부터 선택된 VH CDR 또는 서열 8, 9 및 10으로부터 선택된 VL CDR, 가장 바람직하게는 F45D9 VH CDR3 (서열 7)을 코딩하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.
추가의 측면은 본 발명의 핵산에 의해 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면은 항체 VH 가변 도메인의 생성 방법을 제공하고, 이 방법은 코딩 핵산으로부터 발현의 유도를 포함한다. 상기 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 요소의 생성을 위한 유사한 방법이 본 발명의 추가의 측면으로서 제공된다.
생성 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
생성 방법은 생성물을 적어도 하나의 추가의 성분, 예를 들어 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 측면을 아래에서 보다 상세하게 설명한다.
용어
결합 요소
결합 요소는 서로 결합하는 한쌍의 분자의 요소를 기재한다. 결합쌍의 요소는 천연적으로 유래되거나 또는 완전히 또는 부분적으로 합성하여 생성될 수 있다. 분자쌍의 한 요소는 분자쌍의 다른 요소에 결합하여 다른 요소의 특정 공간적 및 극성 구조에 상보성인, 그의 표면 상의 영역 또는 공간을 갖는다. 따라서, 상기 쌍의 요소는 서로 결합하는 성질을 갖는다. 결합쌍 유형의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본원은 항원-항체 유형 반응에 관심이 있다.
항체 분자
이는 이뮤노글로불린 (천연인 것인지, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성된 것인지와는 무관함)을 기재한다. 상기 용어는 또한 항체 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편, 예컨대 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; 및 디아바디(diabody)가 있다.
모노클로날 및 다른 항체를 취하고, 재조합 DNA 공학 기술을 사용하여 원래의 항체의 결합 능력을 유지하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성하는 것이 가능하다. 이러한 기술은 상이한 이뮤노글로불린의 불변 영역에, 또는 불변 영역과 프레임워크 영역에 항체의 이뮤노글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 DNA를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400을 참고한다. 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화를 겪을 수 있는데, 이는 생성되는 항체의 결합 특이성을 변경하거나 또는 변경하지 않을 수 있다.
항체는 수많은 방식으로 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 에피토프 또는 항원에 대해 요구되는 결합을 갖는, 항체 항원 결합 도메인을 갖는 임의의 결합 요소 또는 물질을 포괄하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연적이건 또는 완전히 또는 부분적으로 합성되건 간에, 이뮤노글로불린 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드에 융합된 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 등가물이 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 기술되어 있다.
전체 항체의 단편이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편 (2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); (vii) 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 두 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결됨) (문헌 [Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988]; [Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]); (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디" (유전자 융합에 의해 구축되는 다가의 또는 다중특이적인 단편) (WO94/13804; 문헌 [P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993])이 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 연결의 도입에 의해 안정화될 수 있다 (문헌 [Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디(Minibody) 또한 만들 수 있다 (문헌 [S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]).
이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는, 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조되는 통상적인 이중특이적 항체일 수 있거나 (문헌 [Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)]), 또는 상기 언급된 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 Fc 영역 없이 가변 도메인만을 사용하여 구축될 수 있고, 잠재적으로 항-이디오타입 반응의 효과를 저하시킬 수 있다.
또한, 이중특이적 전체 항체와 달리, 이중특이적 디아바디는 이. 콜라이(E. coli)에서 용이하게 구축되어 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성을 갖는 디아바디 (및 많은 다른 폴리펩티드, 예컨대 항체 단편)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 이용하여 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어 Fas에 대해 지정된 특이성을 갖는 디아바디의 한 아암(arm)이 일정하게 유지되어야 할 경우에, 다른 아암이 변경되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 놉스-인투-홀즈(knobs-into-holes) 공학에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [J. B. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996]).
항원 결합 도메인
이는 항원의 일부 또는 모두에 결합하고 그에 대해 상보적인 영역을 포함하는 항체 분자의 부분을 기재한다. 항원이 큰 경우, 항체는 에피토프로 불리는 부분인, 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인 (예를 들어, VH 도메인으로 이루어진 소위 Fd 항체 단편)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
포함하다
이는 포함하다의 의미로 일반적으로 사용되고, 다시 말해서 하나 이상의 특징 또는 구성성분의 존재를 허용하는 것이다.
단리된
이는 본 발명의 결합 요소, 또는 상기 결합 요소를 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 상태임을 나타낸다. 요소 및 핵산에는 천연적으로 회합되는 물질, 예컨대 천연 환경에서, 또는 시험관내 또는 생체내 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 그들이 제조되는 환경 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 요소 및 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제제화될 수 있고, 실제 목적을 위해 계속 단리될 수 있으며, 예를 들어 요소는 면역검정에 사용하기 위한 마이크로타이터 플레이트의 코팅에 사용될 경우 보통 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 것이거나, 또는 진단 또는 요법에 사용될 때 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 결합 요소는 천연적으로, 또는 이종성 진핵세포 (예를 들어 CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 원핵세포 내에서의 발현에 의해 생산될 경우) 비글리코실화될 수 있다.
"실질적으로 제시된 것과 같은"은 본 발명의 관련 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 본원에 제시된 서열의 특정 영역과 동일하거나 매우 유사할 것이라는 것을 의미한다. "매우 유사한"은 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3, 또는 1 또는 2, 또는 3 또는 4개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에서 일어날 수 있음을 의미한다.
본 발명의 CDR을 가진 구조는, 일반적으로 재배열된 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 천연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR에 상응하는 위치에 CDR이 위치하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이들의 실질적인 부분일 것이다. 이뮤노글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987] 및 그의 최신 개정판 (현재 인터넷으로 입수가능함; http://immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진을 이용하여 "Kabat"를 검색함)에 따라 결정할 수 있다.
바람직하게는, 실질적으로 본원에서 제시된 것과 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분에서 CDR로서 보유될 수 있다. 실질적으로 본원에서 제시된 것과 같은 VH CDR3 서열은 본 발명의 바람직한 실시양태이며, 이들 각각이 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분에서 VH CDR3으로서 보유되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR (예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다.
예를 들어, 문헌 [Marks et al ., Bio / Technology, 1992, 10:779-783]은 가변 도메인 영역의 5' 말단에서 또는 그에 인접하여 작용하는 컨센서스 프라이머가 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하기 위해서 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용되는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생성하는 방법을 기재하고 있다. 마르크스(Marks) 등은 상기 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 조합될 수 있는 방법을 또한 설명하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유래된 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 셔플링될 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 결합 요소를 제공할 수 있다. 이후, 상기 레퍼토리는 적합한 결합 요소가 선택될 수 있도록 적합한 숙주 시스템, 예컨대 WO92/01047의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이될 수 있다. 상기 레퍼토리는 예를 들어 104 이상의 개별 요소, 예를 들어 106 내지 108 또는 1010 요소로부터의 임의의 것으로 이루어질 수 있다.
유사한 셔플링 또는 조합 기술은 또한 문헌 [Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391]에 개시되어 있으며, 이는 β-락타마제 유전자와 관련된 기술을 기재하지만, 상기 접근법이 항체의 생성에 사용될 수 있는 것으로 관찰된다.
추가의 대안은 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 생성시키기 위해 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위한 돌연변이 유발을 사용하여 본 발명의 CDR-유래된 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 그러한 기술은 오류-유발 PCR을 이용하는 문헌 [Gram et al ., 1992, Proc . Natl . Acad. Sci ., USA , 89:3576-3580]에 의해 기재되어 있다.
이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Barbas et al ., 1994, Proc . Natl. Acad . Sci ., USA , 91:3809-3813] 및 [Schier et al ., 1996, J. Mol . Biol . 263:551-567]에 개시되어 있다.
인간 항체 기술, 특히 메다렉스(Medarex)에 의한 HuMAb-마우스 기술은 F45D9 항체를 생성하기 위해 본 발명에서 사용되었다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 항체를 생성하기 위한 마우스 유전자는 인간 항체 유전자에 의해 비활성화되고 대체되었다. HuMAb-마우스 트랜스제닉 균주는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 재배열되지 않은 인간 항체 유전자로부터의 핵심 유전자 서열을 함유한다. 이어서, 이러한 트랜스제닉 마우스는 인간 항체 단백질을 만든다. 이는 뮤린 모노클로날 항체를 인간화하는 필요를 없애고, HuMAb-마우스에서의 인간 유전자가 안정적이기 때문에, 이들은 마우스의 자손으로 전해진다. 따라서, 상기 마우스는 비교적 적은 비용으로 및 추가의 유전 공학 없이 무한히 번식될 수 있다.
상기 기재된 모든 기술은 당업계에서 그대로 공지되어 있고, 그 자체로 본 발명의 일부를 형성하지는 않는다. 당업자는 당업계에서 통상적인 방법론을 이용하여 본 발명의 결합 요소를 제공하기 위해 이러한 기술을 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에서 제시된 것과 같은 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하고, 임의로 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하고, 및 인간 Fas에 대한 결합 요소 또는 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위해 및 임의로 하나 이상의 바람직한 특성, 바람직하게는 Fas-매개 아팝토시스를 억제하는 능력에 대해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하는 것을 포함하는, 인간 Fas 항원에 대한 항체 항원 결합 도메인을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에서 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 측면은
(a) 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하고;
(b) VH CDR3에 대해 실질적으로 본원에서 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여 핵산과 상기 레퍼토리를 조합하여, 상기 공여 핵산을 레퍼토리의 CDR3 영역으로 삽입함으로써, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하고;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키고;
(d) Fas에 대한 결합 요소를 선택하고;
(e) 상기 결합 요소 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는
것을 포함하는, 인간 Fas에 대한 결합 요소를 제조하는 방법을 제공한다.
다시, 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 본 발명의 VL CDR3을 조합시키는 유사한 방법을 사용할 수 있다.
유사하게, 3개의 CDR 중 하나 이상 또는 모두가 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리로 그라프팅될 수 있고, 이는 후속적으로 Fas에 대한 결합 요소 또는 결합 요소들에 대해 스크리닝된다.
이뮤노글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그들 사이에 개재된 프레임워크 영역과 함께 적어도 3개의 CDR 영역을 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 약 50％를 포함할 것이고, 상기 50％는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50％ 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단부의 추가의 잔기는 천연 발생 가변 도메인 영역과 보통 회합하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 결합 요소의 구축에는, 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계는 이뮤노글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디의 생산시에) 또는 하기에 보다 상세하게 논의되는 단백질 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면에서 한쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 결합 요소가 바람직하지만, VH 또는 VL 도메인 서열 중 하나를 기재로 하는 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 단일 이뮤노글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다고 알려져 있다.
단일쇄 결합 도메인 중 어느 하나의 경우에, 이들 도메인은 Fas에 결합할 수 있는 2-도메인 결합 요소를 형성할 수 있는 상보성 도메인의 스크리닝에 사용될 수 있다.
이는 H 또는 L 쇄 클론 중 하나를 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄 (L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-쇄 결합 요소를 참고문헌에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택하는, WO92/01047에 개시되어 있는, 소위 계층 이중 조합 접근법을 이용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 이 기술은 문헌 [Marks et al ., ibid]에도 개시되어 있다.
본 발명의 결합 요소는 추가로 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄, 바람직하게는 Cκ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. 이와 유사하게, VH 도메인을 기재로 하는 결합 요소는 임의의 항체 이소형, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소형 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG4 (바람직하게는 IgG4임)로부터 유래된 이뮤노글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 대해 그의 C-말단부에서 부착될 수 있다. Fc 영역, 예컨대 WO99/58572에 개시된 Δnab 및 Δnac가 사용될 수 있다.
본래의 IgG4 이소형이 동적 Fab 아암 교환에 의해 초래된 기능적으로 1가인 항체 종을 형성한다는 것이 문헌에서 널리 수립되어 있다 (문헌 [Van der Neut Kolfschoten 2007, Science, 317,1554]). IgG4 항체의 상기 성질은 IgG4 절반 분자와의 평형으로 이어지는 분자의 중쇄간 디술피드 결합의 고유한 불안정성에 기인하였다. (약물 개발 및 제조 관점으로부터) 상기 원치않는 성질을 회피하기 위해, 이전에는 연구자들에 의해 돌연변이가 도입되었고 (문헌 [Angal 1993, Mol . Immunol., 30, 105]), 이는 IgG4 항체를 안정시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Schuurman 2001, Mol Immunol., 38, 1]; [Aalberse 2002, Immunol ., 105, 9]). 상기 돌연변이는 본래의 IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys 서열과 비교하여 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys와 같이 더욱 안정한 IgG1에 상응하며 (S228P 돌연변이; EU 인덱스), 이는 명백히 쇄간 디술피드 결합을 안정화시킨다.
본 발명의 상이한 측면 및 실시양태에 사용된 바람직한 Fc 영역은 S228P 돌연변이 (EU 인덱스)를 함유하는 IgG4 이소형을 가지며, 따라서 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys가 본래의 IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys 서열 대신에 존재한다.
본 발명의 결합 요소는 검출가능한 또는 기능적 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지의 예에는 방사성표지, 예컨대 131I 또는 99Tc가 포함되고, 이는 항체 영상화, 효소 표지, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 특이적 동족체 검출가능한 잔기, 예를 들어 표지된 아비딘과의 결합을 통해 검출될 수 있는 화학적 잔기, 예컨대 비오틴, 형광색소, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)의 당업계에 공지된 통상적인 화학을 이용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다.
본 발명의 결합 요소는 인간 또는 동물 대상체, 바람직하게는 인간의 진단 또는 치료 방법에 사용하도록 고안된다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 제시된 것과 같은 결합 요소의 투여를 포함하는 치료 방법, 상기 방법에 사용하기 위해 결합 요소를 포함하는 조성물, 상기 결합 요소를 포함하는 제약 조성물, 및 투여를 위한 의약의 제조에서의, 예를 들어 결합 요소를 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는 의약 또는 제약 조성물의 제조 방법에서의 상기 결합 요소의 용도를 제공한다.
항-Fas 항체를 이용하여 치료적 이점을 제공할 수 있는 임상적 징후에는, 아팝토시스 및/또는 Fas가 병리학적 결과를 갖는 임의의 상태, 예를 들어 (1) GVHD, (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 및 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체, (3) 스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 및 독성 표피 괴사용해 (TEN), (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)을 위한 치료로서 섬 이식, (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 특히 심장, 신장, 간, 폐, 소화관 또는 뇌의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환 (예를 들어, 졸중); 및 수술 또는 이식과 관련된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 및 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 관련된 허혈성 재관류 손상, (6) 심장 질환, 및 바람직하게는 허혈성 심장 질환, 및 특히 심근경색; 심부전; 및 허혈성 재관류 손상, (7) 신장 질환, 및 바람직하게는 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상 및 급성 신부전, (8) 신경계 장애 및 손상, 특히 뇌 또는 척수 손상 및 졸중, (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈이 포함된다.
또한, 세포 사멸과 관련된 질환 및 다른 임상 조건이 개선될 수 있다.
이식편-대-숙주 질환 (이후 GVHD로 언급됨)은 이식편 대 숙주 반응 (GVH 반응)에 의해 초래된 질환이며, 이는 공여자 또는 이식편의 림프구의 이식시에 숙주의 조직 항원에 대하여 발생할 수 있는 면역반응이다. 예시적인 GVHD는 골수 이식 후의, 예컨대 동종 골수 이식에 의한 또는 선천성 면역 결핍 증후군에서의 골수 이식으로 인한 GVHD; 기관 이식 후의 GVHD; 수혈 후의 GVHD (다량의 혈액이 면역저하 환자에게 수혈됨) 등이다. GVHD는 GVH 반응에 기초한 기관 또는 조직 실패와 관련이 있으며, 설사, 탈진, 예컨대 체중 감소 및 쇠약, 발진, 비장 비대증 및 간 기능장애가 임상적으로 관찰된다. GVHD는 또한 조직학적 증상, 예컨대 골수 및 림프양 조직의 분열 및 소장융모의 위축과 관련이 있다.
이식편-대-숙주 질환 (GVHD)은 동종 공여자로부터의 조혈성 세포 이식과 관련있는 합병증이다. 급성 GVHD (aGVHD)의 복잡한 병태생리학은 3-상 과정으로 기재되었다 (검토: 문헌 [Jaksch and Mattsson, Scand. J. Immunol., 61:398, 2005]; [Shlomchick, W. D., Nat. Rev. Immunol. 7:340, 2007]). 제I상은 화학요법 및/또는 방사선 조사로 이루어지는, 줄기-세포 이식 (SCT) 이전의 컨디셔닝의 직접적인 결과이다. 이러한 치료는 환자의 조직에 대해 독성이며, 손상 및 세포 활성화로 이어진다. 상기 상 동안, 염증전 사이토카인, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF)-α 및 인터류킨 (IL)-1이 분비된다. 제II상은 공여자 세포가 활성화되기 시작할 때 수용자 내로 공여자 조혈 줄기 세포 및 T 세포의 이식 후에 발생한다. 공여자 및 수용자의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 사이의 불일치는 공여자 T 세포 활성화에 대한 주요 원인이다. 그러나, 심지어 인간 백혈구 항원 (HLA)-동일성 쌍에서도, 항원들의 적은 차이가 T 세포 반응으로 이어질 수 있다. 제I상 및 제II상은 이펙터 상인 제III상으로 이어진다. 이펙터 상을 담당하는 주요 세포는 조직을 침윤 및 손상시키는 세포독성 T 림프구 (CTL)이다. Fas는 퍼포린 및 그랜자임과 함께 그의 표적을 사멸시키기 위한 세포독성 T-림프구 (CTL)에 대한 결정적인 분자이다. 세포 매개 세포독성 이외에도, TNF-α, IFN-γ, IL-1 및 산화질소 (NO)의 방출 이후의 염증 반응 또한 조직 손상을 담당한다.
Fas는 특징적 GVHD 표적 기관: 피부, 간, 장 및 흉선에서의 발현을 비롯하여 폭넓게 발현된다. 실험 동물 모델로 GVHD의 생리병리학에서 Fas/FasL 경로의 핵심적 역할이 입증된다. 숙주 세포에서 Fas 또는 FasL의 결핍시, 이식 마우스에서 상승된 이환율 및 사망률이 관찰되었다 (문헌 [van den Brink, M.R., et al., Transplantation, 70:184, 2000]; [van den Brink, M.R., et al., J. Immunol. 164: 469, 2000]). 그러나, FasL 결핍 공여자 세포를 주입함으로써 또는 FasL 중화 항체를 사용하여 경로를 차단함으로써, GVHD는 현저하게 감소되었다 (문헌 [Baker, M.B:, et al., J. Exp. Med., 183:2645, 1996]; [Via, C.S., et al. J. Immunol. 157: 5387, 1996]). 항-FasL 및 항-TNF-α 항체의 조합물로 aGVHD를 앓는 마우스를 처리함으로써, 하토리(Hattori) 등은 사망률의 완전한 억제 및 병변의 감소를 관찰하였다 (문헌 [Hattori, K. et al., Blood, 91:4051, 1998]). 개별 투여시, 항-FasL 항체는 간 병변에 대해 보다 효력이 있었고, 항-TNF-α는 장 병변을 개선시켰으나, 두 항체는 모두 피부 및 비장 병변에 대해 작용하였다. 다양한 마우스 균주 및 항-FasL 모노클로날 항체를 사용하여, 미와(Miwa) 등은 대조군과 비교하여 처리 마우스에서 감소된 사망률 및 체중 감소를 확인하였으나, 피부 병변을 비롯한 aGVHD의 다른 징후에 대해서는 어떠한 유의한 개선도 보고되지 않았다 (문헌 [Miwa, K. et al., Int. Immunol., 11:925, 1999]). 인간 연구에서, Fas 상향조절이 관찰되었고, 이는 위장관에서의 GVHD와 관련되었다 (문헌 [Socie, G., et al., Blood, 103:50, 2004]). 이러한 연구들을 근거로 GVHD의 치료 표적으로서의 Fas의 사용 가능성이 제기되어 왔다 (문헌 [French and Tschopp, Schweiz Med. Wochenschr., 130:1656, 2000]). 또한, 퍼포린/그랜자임 또는 TNF-α를 차단하는 것과 비교하여, Fas를 표적화 하는 것은, 동물 연구에서 밝혀진 바와 같이 영향받지 않는 이식편-대-백혈병 (GVL) 효과를 남기는 유익한 효과를 갖는다 (문헌 [Schmaltz, C. et al., Blood, 97:2886, 2001]).
임상적 상황에서의 GVHD 등급 I-II는 잠재적으로 치유력이 있는 것으로 간주되고 (즉, 면역억제에 의해), 질환은 통제하에 있을 수 있다. 그러나 이것이 III-IV의 GVHD 등급으로 악화되면 질환은 매우 치료하기 어려워지고, 생명을 위협하게 된다. 사실상, 이러한 진행 중인 면역 반응을 역전시킬 수 있을 수 있는 약물은 거의 존재하지 않으며, 게다가 약물에 대한 반응은 대개 단지 일시적이다. 또한, 스테로이드 불응성 GVHD에 있어서도 치료 수단이 거의 없고 (한 가지로는 체외 광선요법이 있음), 이러한 상황에서 치료제로서 지속적으로 유용한 약물이 거의 없다.
CD3/T 세포 수용체 복합체를 통한 촉발시에 활성화된 인간 T 세포가 유도되어 아팝토시스를 겪게 된다 (활성화 유도 세포 사멸 (AICD)로 불리는 과정). AICD는 HIV-감염 개체로부터 신선하게 단리된 T 세포에서 관찰되지만, 비감염 개체로부터의 것에서는 관찰되지 않는다 (문헌 [Groux, et al. J. Exp. Med. 175: 331, 1992]). 따라서, 아팝토시스는 HIV 감염 개체에서의 AIDS로의 진행 및 CD4 T 세포의 고갈에 있어서 역할을 담당하는 것으로 보인다. 따라서, Fas 길항제를 사용한 HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 및 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체에 대한 치료적 개입이 가능할 수 있다.
스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 및 독성 표피 괴사용해 (TEN)는, 발병률은 낮지만 사망률이 높은 것을 특징으로 하는 심각한 약물 유해 반응이다. TEN의 발병기전의 연구는, 표피에서의 파괴가 Fas-매개 각질세포 아팝토시스로 인한 것이며, 아마도 각질세포의 아팝토시스 또한 SJS에 관여한다는 것을 시사한다. IVIG는 시험관내 세포 사멸 및 Fas-FasL 상호작용을 억제하고, 따라서 인간에서 사용하기 위한 이론적 근거를 제공한다 (문헌 [French, L.E Allergology Int. 55:9, 2006]).
섬 이식은 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)을 위한 효과적인 치료이다. 성공적인 섬 이식에 대한 2가지 주요 장애물은 섬 원발성 비기능 (PNF) 및 이식편 거부반응이다. PNF는 이식편 거부반응 이외의 이유로 인한 이식 후 섬 기능의 손실로서 정의된다. Fas-매개 아팝토시스가 섬 원발성 비기능에 있어서 중요한 역할을 한다. FasL은 시험관내에서 및 Fas 또는 FasL 결핍 마우스에서 베타 세포에서의 아팝토시스를 유도하고, 섬 이식이 보다 효과적이었다 (문헌 [Wu, Y., Diabetes, 52:2279, 2003]).
허혈성 재관류 손상은 실질적으로 모든 조직 및 기관에서 발견되고, 다양한 질환에 관련된다. 허혈성 재관류 손상은 또한 기관의 보존 및 이식에서 문제가 된다. 이러한 허혈성 재관류 손상 중, 간, 심장, 신장 또는 뇌의 경색과 관련된 것들, 및 수술 또는 이식과 관련된 것들, 및 특히 특정 기관에서의 조직 손상 및 기능장애 (예컨대, 심부정맥)는 심각한 경우 개체의 사망으로 이어질 수 있고, 따라서 이러한 경우는 심각한 사회 문제가 된다. 기관 이식의 과정 중 기관 보호 및 재관류는 아팝토시스의 발생과 관련되는 것으로 알려져 있다. 또한, Fas 또는 FasL 발현의 조절이 일부 실험 모델에서 보고되었고, Fas-매개 아팝토시스가 뇌, 심장, 신장 및 장을 비롯한 다양한 조직에서의 허혈성 조직의 재관류 중 경색 크기 확장에 연루됨을 나타내는 증거들이 증가하고 있다 (문헌 [Martin-Villalba, et al. Cell Death Differ., 8:679, 2001]; [Hamar P. et al. PNAS, 101: 14883, 2004]; [Castaneda, M.P: et al., Transplantation, 76:50, 2003]). 폐 허혈-재관류 손상은 이식, 수술 및 쇼크 후 급성 폐 기능상실의 유인 사건이다. Fas 결핍 마우스는 생체내 허혈-재관류 폐 손상 중에 유도 아팝토시스를 나타내었다. 또한, 항-FasL 항체가 시험관내 폐 무산소 중에 유도 아팝토시스를 억제하였다 (문헌 [Zang, X. et al. J. Biol. Chem, 278:22061, 2003]).
심근세포의 아팝토시스, 및 특히 Fas-매개 아팝토시스의 연루는 여러 실험 모델에서 심장 질환과 관련되는 것으로 나타났다. 심근세포의 아팝토시스가 Fas 발현의 증가와 관련하여, 개 심부전 및 심근경색 모델에서 발견되었다 (문헌 [Kajstura J, Lab. Invest. 74:86, 1996]; [Lab. Invest. 73: 771, 1995]). 또한, 심장 허혈성 재관류 손상 모델의 래트 실험 모델에서 심근경색 병변에 대한 하나의 항-FasL 항체의 억제 효과가 나타났다 (US 7,128,905 B2). lpr 마우스 (기능적 Fas가 결핍됨)로부터 분리된 심장, 또는 동일한 마우스를 이용한 생체내 허혈 재관류 모델로부터의 심장은 야생형 대조군과 비교하여 허혈 및 재관류 후에 세포 사멸에 있어서 두드러진 감소를 보여주었다 (문헌 [Jeremias I, et al., Circulation, 102: 915, 2000]; [Lee P., et al. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol. 284: H456, 2003]).
아팝토시스의 연루는 또한 신장 질환에 대해 나타나며, Fas mRNA 발현의 증가가 신장 허혈성 재관류 손상의 실험 모델에서 보고되었고, Fas를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA는 신장 허혈-재관류 손상에 대해 마우스를 보호한다 (문헌 [Hamar P. et al. PNAS, 101: 14883, 2004]). Fas 발현 결핍 마우스는 야생형 마우스에 비해 허혈-재관류 후에 더 적은 신장 조직 손상을 갖는다 (문헌 [Miyazawa, S. et al., J. Lab. Clin. Med., 139:269, 2002]).
간 허혈-재관류 손상은 이식을 비롯한 간 수술에 대한 중요한 문제로 남아 있고, 아팝토시스는 이러한 유형의 간 손상에 연루되어 왔다. 항-Fas를 사용한 Fas/FasL 상호작용 차단, 또는 항-FasL 항체의 중화는 허혈성-재관류 래트 간 모델에서 간세포 아팝토시스, 대식세포 및 NK 세포의 간 침투, 뿐만 아니라 간 손상을 억제한다 (문헌 [Nakajima H., Apoptosis,13: 1013, 2008]). 간 허혈-재관류 손상이 종종 외상, 암 또는 이식을 위한 간 수술에서 발생하며, 임상적으로 심각한 문제가 되지만, 치료를 위한 효과적인 요법은 그의 복잡한 발병 메커니즘으로 인해 이해하기 어려운 채로 남아 있다.
아팝토시스성 세포 사멸은 척수 손상 (SCI) 후의 속발성 손상 및 신경학적 기능장애에 기여한다. 다른 신경변성 모델 (예컨대, 졸중)의 아팝토시스성 프로그램의 주요 유도제 (문헌 [Martin-Villalba, et al. Cell Death Differ., 8:679, 2001])는 TNF 및 FasL/Fas 시스템이다. SCI 후, TNF, Fas 및 FasL의 발현은 병변 부위에서 증가된다. Fas의 발현이 경부 SCI 후에 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 소교세포에서 발견되었다 (문헌 [Casha, W.R., et al. Neuroscience, 103: 203, 2001]). SCI의 설치류 모델에서, FasL 단독, 또는 Fas 및 TNF 둘 다의 치료학적 중화가 임상 결과를 유의하게 개선시켰고, 척수 손상 후에 기능적 복구를 촉진하였다 (US 2006/0234968 A1). 이러한 처리는 SCI 후 아팝토시스성 세포 사멸을 감소시켰다. 상기 연구의 FasL 중화는 뉴런을 보호하고, 탈수초를 억제한다. 40세 미만의 인구에서의, 대부분의 경우의 사망 및 영구 장애는 척수 및 뇌 외상으로 인한 것이다. 사회에 대한 결과는 파괴적이다. 현재, 척수 병변의 복구를 목표로 하는 전략은 신경보호, 개선된 재생, 또는 탈수초의 치료에 중점을 둔다. 척수 손상의 복잡성으로 인해, 손상의 다양한 공급원을 표적으로 하는 다중 개입이 요구될 것이다. FasL/Fas 시스템의 중화 (단독으로 또는 다른 유형의 치료와 함께)는 인간 척수 외상에 대한 신규 요법을 제공할 수 있다.
암 자체가 면역억제성일지라도, 세포독성 항신생물 요법은 암 환자에서 관찰되는 임상적 면역결핍에 대한 주된 기여자이다. 세포독성 항신생물 요법에 의해 유발된 면역결핍은 특히 CD4 T 세포에서 T-세포 고갈과 주로 관련된다. 암 환자에서의 용량-집중 화학요법은 림프구의 활성화 및 아팝토시스에 대한 더 높은 감수성과 관련된 극적인 T-세포 고갈을 유발하며, 이는 AICD가 CD4 소실의 가능한 메커니즘임을 시사한다 (문헌 [Mackall C. L. et al. Blood, 96:754, 2000]; [Mackall C. L., Stem Cells 18:10, 2000]). 잔류 종양을 근절하고 기회 감염에 맞서기 위하여 화학요법 중에 면역 재구성을 개선하기 위한 특이적 접근법이 필요하다. 따라서, 항-Fas 항체를 차단하는 처리는 암 환자에서 세포독성 항신생물 요법과 관련된 심각한 장기간 CD4+ 고갈을 개선할 것이다.
Fas-매개 아팝토시스의 억제에 의해 GVHD를 치료하는, GVHD에 대한 어떠한 치료제 및 요법도 현재까지 공지된 바 없다. 또한, 선택적 면역억제를 이용하여 GVHD를 치료하는, GVHD에 대한 어떠한 치료제 및 요법도 현재까지 공지된 바 없다.
허혈성 재관류 손상을 기반으로 하는 질환과 관련하여, 시판되는 약물은 주로 혈전용해 및 순환의 개선을 목표로 삼고 있으며, 직접적으로 손상을 예방 또는 치료하는 이용가능한 약물은 존재하지 않는다.
기관 손상을 기반으로 하는 질환에 사용되는 약물은 주로 고식적 치료를 목표로 삼고 있으며, 기관 손상을 기반으로 하는 질환을 예방하거나 근본적으로 치료하는 이용가능한 약물은 존재하지 않는다. 또한, 다양한 조직 및 기관에 대해 폭넓게 효과적인 이용가능한 예방제 또는 치료제도 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 치료를 이용하여 환자에게 명백한 이익을 제공할 수 있다. 치료는 주사 (예를 들어, 정맥내)에 의해 또는 국부 전달 방법 (예를 들어, 스텐트 또는 다른 내재 장치의 사전-코팅)에 의해 제공될 수 있다. 항체 분자는 임의의 적합한 경로를 통해, 예를 들어 전신적으로, 예를 들어 복강내로 또는 정맥내로, 또는 국부적으로, 예를 들어 경막내로 또는 요추 천자에 의해 투여될 수 있다. 경막내 투여가 바람직할 수 있는 신경계 장애 및 손상의 치료를 제외하고는, 정맥내 투여가 바람직할 수 있다.
항-Fas는 유전자-매개 기술에 의해 전달될 수 있다. 대안적인 제제화 전략은 경구 또는 좌제 경로에 적합한 제제를 제공할 수 있다. 투여 경로는 치료제의 물리화학적 특성, 질환에 대한 특수한 고려사항, 효능 최적화 또는 부작용 최소화를 위한 요건에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따라서, 제공된 조성물은 개체에게 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 "치료 유효량"으로 이루어지고, 이는 환자에게 이익을 주기에 충분한 양이다. 이러한 이익은 하나 이상의 증상을 적어도 개선시키는 것일 수 있다. 투여되는 실질적인 양, 및 투여 속도 및 기간은 치료 대상의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량의 결정 등은 일반의 및 다른 의사의 책임하에 있다. 항체의 적절한 용량은 당업계에 널리 공지되어 있으며; 문헌 [Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664]; [Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922]을 참조한다.
정확한 용량은 항체가 진단용 또는 치료용인지의 여부, 치료되는 영역의 크기 및 위치, 항체 (예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디)의 정확한 특성 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 다른 분자의 특성을 비롯한 수많은 요인에 따라 달라질 것이다. 전형적인 항체 용량은 0.5 mg 내지 1.0 g의 범위에 있을 것이며, 이는 볼루스로서 정맥내로 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에는 수시간에 걸친 (유사한 총 누적 용량이 달성되도록) 정맥내 주입이 포함된다. 이는 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량이며, 어린이 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해 조정될 수 있다. 치료는 의사의 판단에 의해 매일, 주 2회, 매주 또는 매달 간격으로 반복될 수 있다.
추가 투여 방식 (내재 장치의 사전 코팅, 또는 다르게는 내재 장치로의 혼입)이 이용되며, 이에 대한 항체의 최적량은 적절한 실험에 의하여 결정될 것이다.
본 발명의 결합 요소는 결합 요소 이외에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 대개 투여될 것이다.
따라서, 본 발명에 따라서 사용되는 본 발명에 따른 제약 조성물은 활성 성분 이외에, 제약상 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 본질은 경구 투여 또는 주사에 의한 투여, 예를 들면 정맥내 투여일 수 있는 투여 경로에 따라 좌우될 것이다.
경구 투여를 위한 제약 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체의 형태일 수 있다. 정제는 고형 담체, 예를 들면 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들면 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 식용수, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예를 들면 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 통증 부위로의 주사를 위해, 활성 성분은 무발열원이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들면 등장성 비히클, 예를 들면 나트륨 클로라이드 주사, 링거 주사, 유산을 가한 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요한 만큼, 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
조성물은 스텐트 또는 다른 유치 장치를 포함할 수 있다.
조성물은 치료되는 상태에 따라서 단독으로 또는 다른 치료와 조합으로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료는 적합한 용량의 통증 완화 약물, 예를 들면 비-스테로이드성 항-염증 약물 (예를 들면, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 아편제, 예를 들면 모르핀 또는 항-구토제의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 급성 질환 또는 손상의 경우에 투여될 수 있다. 치료는 가능한 빨리, 예를 들면 기관 또는 조직 손상의 발생, 또는 허혈의 검출 바로 후에 개시될 수 있다. 조성물은 1회 또는 1회 초과로 투여될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 Fas 길항제를 그의 유효 성분으로서 포함하는 것에 의해 특징지어지는, 기관, 예를 들면 심장, 신장, 간 또는 섬을 위한 방부제로서 제공한다.
본 발명은 Fas에 본원에 제공된 결합 요소의 결합을 야기하거나 또는 허용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 언급된 바와 같이, 이러한 결합은 예를 들면, 결합 요소 또는 결합 요소를 코딩하는 핵산의 투여에 이어서 생체내에서 이루어질 수 있거나, 또는 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역세포화학, 면역-침전 또는 친화성 크로마토그래피에서 시험관내에서 이루어질 수 있다.
Fas으로의 결합 요소의 결합의 양은 측정될 수 있다. 정량은 진단적 관심일 수 있는 시험 샘플에서의 항원의 양에 연관될 수 있다.
샘플 상의 항체의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 측정될 수 있다. 방사능면역 검정법 (RIA)이 하나의 가능한 수단이다. 방사성 표지된 항원은 표지되지 않은 항원 (시험 샘플)과 혼합되고 항체에 결합되도록 한다. 결합된 항원은 결합되지 않은 항원으로부터 물리적으로 분리되고, 항체에 결합된 방사성 항원의 양이 측정된다. 시험 샘플에서 항원이 많을수록 항체에 결합되는 방사성 항원이 적어질 것이다. 경쟁적 결합 검정은 또한 항원 또는 리포터 분자에 연결된 동족체를 사용하여, 비-방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼 단리된 흡수 또는 방출 특징이 있는 형광색소, 인광체 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광색소는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)를 포함한다. 적합한 유색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터는 고분자 콜로이드 입자 또는 미립자의 물질, 예를 들면 검출가능한 신호가 시각적으로 관찰되거나, 전자적으로 검출되거나 또는 그렇지 않으면 기록되는 것을 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 착색되었거나, 자성 또는 상자성 라텍스 비드(latex bead) 및 생물학적 또는 화학적 활성제를 포함한다. 이들 분자는 예를 들면, 색을 발생 또는 변화시키거나, 또는 전기적 성질의 변화를 야기하는 반응에 촉매 작용을 하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기되어, 에너지 상태 사이의 전자 전이가 특징적 스펙트럼 흡수 또는 방출을 야기할 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학 물질을 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼리 포스파타제 검출 시스템이 사용될 수 있다.
개별 항체-리포터 접합체에 의해 발생되는 신호는 샘플 (정상 및 시험)에서 관련된 항체 결합의 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이터를 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 경쟁 검정에서 항원 수준의 측정을 위한 상기의 결합 요소의 용도, 즉 경쟁 검정에서 본 발명에 의해 제공되는 결합 요소를 사용함으로써 샘플에서 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이는 결합되지 않은 항원으로부터의 결합의 물리적 분리가 요구되지 않는 경우일 수 있다. 결합 요소에 리포터 분자를 연결하여 결합 상에 물리적 또는 시각적 변화가 발생하는 것이 하나의 가능성이다. 리포터 분자는 검출가능하고, 바람직하게는 측정가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 발생시킬 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들면 펩티드 결합을 통한 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합의 재조합 발현에 의해 야기될 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들면, 바이오센서 시스템에서 본 발명에 따른 결합 요소를 사용함으로써 항원의 수준의 직접적인 측정을 제공한다.
결합 측정 방식은 본 발명의 특성이 아니고, 당업자는 그들의 선호 및 일반적인 지식에 따라서 적합한 방식을 선택할 수 있다.
본 발명은 추가로 항원을 결합하고, 또한 본원에 실질적으로 제시된 것과 같은 아미노산을 갖는 CDR을 포함하는 V 도메인 또는 본원에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 V 도메인을 포함하는 임의의 결합 요소와 Fas로의 결합에 대해 경쟁하는 결합 요소로 확장된다. 결합 요소 사이의 경쟁은 동일한 에피토프 또는 중복되는 에피토프를 결합하는 결합 요소의 확인을 가능하게 하기 위해 예를 들면, 특정 리포터 분자를 다른 비태깅된 결합 요소(들)의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 요소에 태깅함으로써 시험관내에서 쉽게 검정될 수 있다. 경쟁은 예를 들면 ELISA 또는 유세포분석을 사용하여 측정될 수 있다.
경쟁 반응은 하나 이상의 추가적 또는 개선된 성질을 가질 수 있는 하나 이상의 결합 요소, 예를 들면 F45D9의 유도체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
경쟁에 대한 시험에 있어서, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심의 에피토프를 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열에 추가로 하나 이상의 아미노산을 양측 말단 중 한곳에 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 이러한 펩티드는 명시된 서열로 "본질적으로 이루어져 있다"고 말할 수 있다. 본 발명에 따른 결합 요소는 항원에 대한 그들의 결합이 주어진 서열을 갖거나 또는 포함하는 펩티드에 의해 억제되는 것일 수 있다. 이를 시험하기 위해, 둘 중 하나의 서열에 추가로 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다.
특정 펩티드를 결합하는 결합 요소는 예를 들면 펩티드(들)로 패닝함으로써 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 결합 요소를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 본 발명의 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기의 하나 이상의 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 임의의 CDR, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산, 또는 제공된 결합 요소는 자체적으로 본 발명의 측면을 형성하고, 코딩하는 핵산으로부터의 발현을 포함하는 코딩된 생성물의 생산 방법 또한 본 발명의 측면을 형성한다. 발현은 편리하게는, 적절한 조건하에 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. VH 또는 VL 도메인의 발현에 의한 생산에 이어서, 또는 결합 요소는 적절하게 사용된, 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 요소, VH 및/또는 VL 도메인 및 코딩하는 핵산 분자 및 벡터는 예를 들면, 그들의 자연적 환경으로부터, 실질적으로 순수하거나 또는 동종의 형태로, 또는 핵산의 경우에는, 요구된 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 다른 핵산 또는 유전자 근원이 없거나 또는 실질적으로 없이 제공되거나, 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 본원에 제시된 것과 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 인용은, 본문에서 달리 요구하지 않는 한 명시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, T가 U로 치환된 명시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
다양한 다른 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템이 있다. 이종 조직 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 입수가능한 포유동물 세포주로는 중국 햄스터 난소 세포, 헬라(HeLa) 세포, 아기 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포 및 많은 다른 것들이 있다. 흔히, 바람직한 박테리아 숙주는 이. 콜라이이다.
원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 밝혀져 있다. 검토를 위해, 예컨대 문헌 [Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다. 또한, 결합 요소의 생성을 위한 옵션으로서 배양 중 진핵 세포에서의 발현이 당업자들에게서 이용가능하고, 최근의 고찰에 대해서는 예를 들어 문헌 [M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576], [Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]을 참조한다.
적합한 것으로서의 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 다른 서열들을 포함하는, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터들이 선택 또는 구축될 수 있다. 벡터는 적합한 것으로서 플라스미드, 바이러스, 예컨대 파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 자세한 내용을 위해, 예컨대 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예컨대, 핵산 구축물의 제조, 돌연변이 유발, 서열화, DNA의 세포로의 도입 및 유전자 발현 및 단백질의 분석에서, 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기술들 및 프로토콜들이 문헌 [Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999]에 자세히 기재되어 있다. 샘브루크(Sambrook) 등 및 아우수벨(Ausubel) 등의 내용이 본원에 참고로 포함되었다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 본원에 기재된 것으로서의 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또다른 추가의 측면은 그러한 핵산을 숙주 세포로 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 가능한 기술을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술로는 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포솜-매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예컨대 벡시니아(vaccinia), 또는 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스를 이용한 형질도입이 포함될 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술로는 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 사용한 형질감염이 포함될 수 있다.
도입을 한 후, 예컨대 유전자의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써, 핵산으로부터 발현을 일으키거나 가능하게 한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예컨대, 염색체)으로 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라, 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포접시킴으로써 촉진될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 것으로서의 결합 요소 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 발현 시스템에서 상기 언급된 바와 같은 구축물의 이용을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 측면 및 실시양태는 본 발명의 범주에 제한 없이, 하기의 실험을 참조로 실시예의 방법에 의해 본원에 예시될 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 문서들은 참고로 포함된다.
실시예 1: 인간 항-Fas F45D9 모노클로날 항체의 발생.
실시예 2: F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb는 인간 T 세포를 발현시키는 Fas의 표면에 결합한다.
실시예 3: F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb는 특정한 방식으로 Fas 분자에 결합한다.
실시예 4: F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 Fas 결합 친화도.
실시예 5: F45D9-γ1 mAb의 에피토프 매핑.
실시예 6: 인간 T 및 B 세포에서 rhFasL-유도 아팝토시스의 F45D9-γ1 mAb의 F(ab)2 및 Fab 단편들뿐만 아니라, F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 시험관내 길항적 활성.
실시예 7: 인간 T 세포에서 활성화 유도 세포 사멸 (AICD)의 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 시험관내 길항적 활성.
실시예 8: FasL-유도 세포 사멸 (SCID 마우스 모델)에서 F45D9-γ1 mAb의 시험관내 길항적 활성.
실시예 9: F45D9-γ1 및 F45D9-γ4와 다양한 종들, 비-인간 영장류 코먼 마모셋 및 침팬지의 Fas 분자들과의 반응성. F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb와 마모셋 PBMC 및 B 세포주의 Fas 분자와의 반응성. 마모셋 및 인간 림프구 사이에서 결합 친화도의 비교. 인간 및 마모셋 조직에서 F45D9-γ4 mAb로의 면역조직화학적 교차-반응성 연구.
실시예 10: 비-인간 영장류 코먼 마모셋으로부터의 B 세포 및 활성화된 림프구에서의 rhFasL-유도 아팝토시스에서의 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 시험관내 길항적 활성.
실시예 11: 인간 T 세포의 활성 및 증식에서 F45D9-γ1-매개 공동-자극 신호.
실시예 12: 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)의 유도에서 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 효과.
실시예 13: 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 유도에서 F45D9-γ1 mAb의 효과
실시예 14: 1차 인간 간세포에서, F45D9-γ1 mAb의 독성 시험.
실시예 15: 마모셋에서 F45D9 mAb로의 파일롯 독성 연구.
실시예 16: 인간 GVHD의 피부 체외이식편 모델에서 인간 F45D9 항-Fas 항체의 효과.
실시예 17: 시험관내의 인간세포독성 T 세포 (CTL) 활성에서의 F45D9-γ4 mAb의 효과.
실시예 1
인간 항-Fas F45D9 모노클로날 항체의 발생
재조합 인간 Mab T17/B2-1G4 (감마-1 이소형) 및 Mab T19/B5-1F9 (감마-4 이소형)의 후속적인 개발을 이끄는 항-인간 Fas 모노클로날 항체 (F45D9/1F8/6)를 노벨스 배그 16, 스톡홀름, 스웨덴 (Nobels vaeg 16, Stockholm, Sweden)의 마이크로바이올로지 앤드 튜머바이올로지 센터 (Microbiology and Tumorbiology Center) (MTC) 실험실 및 동물 시설에서 면역화 (표 1에 나타낸 면역 스케쥴)시킨 메다렉스 사 (Medarex Inc.; 코튼우드 드라이브, 캘리포니아주, 미국 (Cottonwood Drive, CA, USA))로부터의 두 마리의 (2) HuMAb 트랜스제닉 마우스 (두 개의 다른 배치: 배치 2 및 배치 3)들을 이용한 하이브리도마 항체 기술에 의해 발생시켰다. 마우스들의 유전자형은: 마우스 3 (3번째 배치) 유전자형 I [(CMD)++; (HCo12)15087+;(JKD)++;(KCo5)9272+] 및 마우스 18 (2번째 배치) 유전자형 II [(CMD)++; (HCo12)15087+;(HCo7)11952; (JKD)++;(KCo5)9272+]이었다. 각각의 마우스는 CMD 및 JKD로 고안된, 파괴된 마우스 중쇄 좌위 및 마우스 카파 경쇄 좌위를 각각 포함하였다. 이러한 분열은 완전히 뮤린인 임의의 항체의 발현을 억제하였다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분열은 여전히 두 개의 다른 유형의 마우스의 이뮤노글로불린 서열을 발현하도록 했다. 마우스 비-무 중쇄 이소형 서열을 키메라 인간/마우스 중쇄의 성분으로서 발현시켰고, 마우스 람다 경쇄를 하이브리드 인간/마우스 항체로서 발현시켰다.
트랜스제닉 마우스 18 (2번째 배치)을 마우스 당 10 ㎍의 재조합 인간 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드, 영국 런던 W6 8LL, (PeproTech EC Ltd., London W6 8LL, UK) 카탈로그 (Cat.) 310-20에서 입수가능한 재조합 인간 가용성 Fas), 또는 rhFas/Fc 키메라 (알앤디 시스템즈 (R&D Systems), 미네아폴리스, 미네소타주 55413, 미국; 카탈로그 번호. 326-FS/CF에서 입수가능한 재조합 인간 (NSO-유도됨))와 조합된, 인간 Fas 표면 수용체 (마우스 당 PBS 중의 107의 살아있는 세포)를 발현시키는 모든 저캣 세포 (인간 T 세포 백혈병 세포주, DSMZ ACC 282)로 복강내 주사 (i.p.)에 의해 면역화시켰다. 마우스 당 5 또는 10 ㎍의 재조합 인간 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드, 영국 런던 W6 8LL에서 입수가능함), 또는 rhFas/Fc 키메라 (알앤디 시스템즈, 미네아폴리스, MN 55413, 미국)를 마우스 당 10 ㎍의 펩티드 FP5, FP8, FP9, FP11, FP18 (US6846637B1에서의 서열) (펩티드 FP5-KLH, 시그마제노시스 (SigmaGenosys), #94519-1; 펩티드 FP9-KLH, 시그마제노시스, #96221-1; 펩티드 FP11-KLH, 시그마제노시스, #94519-3 ; 펩티드 FP8-KLH (펩티드 3-KLH, 열 하이바이드 (Thermo Hybaid),), 펩티드 FP18-KLH (펩티드 5-KLH, 열 하이바이드, 354/3)와 더하여, 보조 RIBI MPL + TDM 에멀전 (시그마 (SIGMA), M-6536)과 함께, 4번째 내지 7번째의 면역화를 수행하였다. 마우스 당 10 ㎍의 재조합 인간 sFas (페프로테크 EC 리미티드) 및 비-접합 펩티드 FP5, FP8, FP9, FP11, FP18로 정맥내 주사 (i.v.)를 추가로 3회 실시하였다.
트랜스제닉 마우스 3 (3번째 배치)을 보조 RIBI MPL + TDM 에멀전 (시그마, M-6536)과 함께, 마우스 당 10 또는 20 ㎍의 재조합 인간 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드, 영국 런던 W6 8LL, 카탈로그 번호. 310-20에서 입수가능함)로 복강내 주사 (i.p.)에 의해 면역화시켰다. 마우스 당 10 ㎍의 재조합 인간 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드에서 입수가능함)에 마우스 당 10 ㎍의 펩티드 FP5, FP8, FP9, FP11, FP18을 더하여, 보조 RIBI MPL + TDM 에멀전 (시그마, M-6536)과 함께, 3번째 및 5번째 면역화를 수행하였다. 마우스 당 10 ㎍의 재조합 인간 sFas (페프로테크 EC 리미티드) 및 비-접합 펩티드 FP5, FP8, FP9, FP11, FP18로 정맥내 주사 (i.v.)를 추가로 3회 실시하였다.
면역화 및 원하는 항-Fas 항체의 혈청 수준의 증가 (ELISA에 의해)를 확인한 후, 비장세포를 동물로부터 단리시키고, 세포 융합을 하였다. 2마리의 마우스들 (마우스 18 및 3)로부터의 비장 세포를 융합에 사용하였다. 비장 세포를 골수종 세포주 Sp2/0 세포 (유로피안 콜렉션 오브 셀 컬처 (European Collection of Cell Cultures (ECACC))와 2:1의 비율로 PEG 및 RPMI-1640 매질의 존재 하에 융합한 후, 20％의 FBS/RPMI/OPI/HAT에서 배양하였다. 비장세포와 융합된 모세포는 임의의 특정한 유형으로 제한되지 않지만, 융합 파트너로서는 Sp2/0 골수종 세포주가 바람직하다.
이어서, 본 발명에 사용되는 표적 항체를 생성하는 것을 위하여 ELISA에 의해 하이브리도마를 Fas 결합을 위해 스크리닝한 후, 클로닝하였다. 클론 F45D9를 ELISA 스크리닝, 세포 성장 특징, 및 FACS 분석의 자료를 기준으로 하여 추가의 개발을 위해 선택하였다. F45D9 하이브리도마로부터의 상등액은 ELISA에서 재조합 인간 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드)와 결합할 수 있고 (하기의 방법을 참조함), 세포 표면에서 인간 Fas를 발현시키는 유르캇 세포에 결합할 수 있고 (실시예 2에 따른 FACS 분석), 그것의 아팝토시스의 유도없이, 유르캇 셀에서 FasL-유도 아팝토시스를 억제할 수 있었다 (실시예 6에 따른 아팝토시스 검정).
융합 후의 양성 세포 클론의 스크리닝을 위한 ELISA:
코팅 완충액 (탄산나트륨 완충액 0.1 M; pH 9.6)에서 희석된 0.56 ㎍/mL (14 ng/웰)의 인간 재조합 가용성 Fas (페프로테크 EC 리미티드, 영국 런던 W6 8LL, 카탈로그 번호. 310-20)를 웰 당 25 ㎕로 마이크로타이터 플레이트 웰을 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 웰을 비우고, 실온 (RT)에서 1시간 동안 PBS 중의 2％ 오브알부민으로 차단하였다. 물 완충액 (0.02 M 트리스 ; NaCL 0.15 M ; 0.05％ 트윈 (Tween) 20)으로 3회 세척한 후, 하이브리도마 세포를 함유한 웰로부터 40 ㎕의 배양 배지를 실온에서 90분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 웰을 세척 완충액으로 6회 세척하고, 과산화물-접합된 래빗 항-인간 IgG (다코 (Dako), 카탈로그. P0214) 또는 과산화물-접합된 래빗 항-인간 카파 경쇄 (다코, 카탈로그. P0219) 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 기질을 세척한 후, 3,5-테트라메틸벤지딘 (BD Opt EIATM 기질, BD 바이오사이언씨스 파밍겐 (BD Biosciences PharMingen))을 함유한 완충액을 첨가하였다. 30분 후 1 M의 H2SO4를 첨가함으로써, 반응을 중단시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
F45D9 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝하고, 서브클론을 (상기 기재된) ELISA에서 재조합 인간 sFas에의 결합에 대해 추가로 스크리닝하였다. 추가의 개발을 위해 서브클론 1F8 (F45D9/1F8)을 선택하였다. 클론을 증가시키고, 혈청 무함유 및 단백질 무함유 CD 배지 (기브코(Gibco), 11279-023)에 적응시키고, 안전 은행 저장을 위해 냉동시켰다. F45D9/1F8 클론을 한계 희석에 의해 재클로닝하여 모노클로날화를 보장하였다. F45D9/1F8 서브클론을 ELISA에 의해 스크리닝하여, 이전의 ELISA에 사용한 래빗 항-인간 IgG (다코, Cat. P0214) 항체 대신에 퍼옥시다제-접합된 고트 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), cat. 109-035-098); 또는 퍼옥시다제-접합된 래빗 항-인간 카파 경쇄 (다코, Cat. P0219); 또는 퍼옥시다제-접합된 고트 항-마우스 IgG Fcγ 단편 특이적 항체 (잭슨 이뮤노리서치, cat. 115-035-071)를 사용하여 (재조합 인간 sFas에 결합하는) 완전한 인간 항-Fas 항체를 검출하였다. 이들 고트 항체를 이용한 스크리닝 시험은 F45D9 항체와 항-마우스 IgG Fcγ 단편 특이적 항체와의 반응성을 보여주었지만, 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 항체와의 반응성은 보여주지 않았는데, 이는 항체가 키메라 인간/마우스 IgG 중쇄를 함유할 가능성을 나타낸다. F45D9 항체는 또한 항-인간 카파 경쇄 특이적 항체와의 반응성을 보여주지 않았다. 스크리닝 후, 추가의 개발을 위해 서브클론 "6" (F45D9/1F8/6)을 선택하여 인간 Fas에 대한 완전한 인간 항체를 생성하였다. 클론을 증가시키고, 혈청 무함유 및 단백질 무함유 CD 배지에 적응시키고, 안전 은행 저장을 위해 냉동시켰다.
재조합 인간 Mab T17 /B2-1 G4 (감마-1 이소형 )의 생성:
F45D9/1F8/6 클론의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대해 cDNA를 클로닝하고 서열분석하였다. (11개 클론으로부터) 3개의 서열 패턴을 VL에 대해 수득하고, 3개의 클론으로부터 1개의 VH 서열을 관찰하였다. 본 작업은 RT 프로토콜 및 5' RACE 프로토콜을 사용하였다. F45D9/1F8/6 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 단편의 cDNA 서열을 진뱅크(GenBank)로 체크하였으며, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 인간 기원이었다. 항체의 불변 영역은 마우스 이뮤노글로불린 서열과 일치하였다.
F45D9/1F8/6 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 단편을 pCR®2.1-TOPO® 벡터 (인비트로겐(Invitrogen), cat. K4500) 내로 클로닝하고, 이.콜라이 (원 샷(One Shot)® 적격 세포, 인비트로겐, cat. 44-0301) 내로 형질전환시켰다. 인간 항체를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 단편을, SR 알파 프로모터 및 인간 카파 경쇄 및 γ1fa 동종이형인 인간 감마1 중쇄의 불변 영역을 함유하는 메다렉스(Medarex)로부터의 pIESRαγ1fa 벡터 내로 재클로닝하였다.
pIE 벡터 삽입을 위해 VL (카파 경쇄 가변 영역) 단편에 제한 부위를 첨가하고자 PCR을 수행하였다. VL-RACE-7 단편을 RACE-7_F 및 VL-RACE-7_R 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 단편을 pCR®2.1-TOPO® 벡터 (인비트로겐 cat. 46-0801)에 다시 재클로닝하여 추가의 작업을 위한 충분한 물질을 얻었다. 정제된 VL-RACE-7-B 플라스미드 DNA로부터의 Bg1 II/Bsi WI 효소를 사용하여 정확한 VL 단편을 절단하고, T4 DNA 리가제 (인비트로겐, Cat. 15224-017)를 사용하여 pIESRαγ1fa-(KV#1/VH-S1) 벡터 (Bg1 II/Bsi WI 효소에 의해 소화됨) 내에 삽입하였다. VH-S1 세그먼트를 pIESRαγ1fa 벡터 내에 삽입하여 pIESRαγ1fa-(KV#1/VH-S1) 벡터를 재구축하였다. pIE-F 및 PIE-KV-R 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 벡터 내로의 정확한 삽입을 체크하였다. 재구축된 벡터를 VL-RACE-7-pIESRαγ1fa(VH-S1)라 명명하였다. 형질감염 및 예비 저장을 위한 충분한 물질을 얻기 위해, 맥스 이피션시(MAX Efficiency) Stb12 적격 세포 (인비트로겐 Cat. #10268-019)를 VL/VH 삽입된 pIESRαγ1fa 벡터 (VL-RACE-7-pIESRαγ1fa(VH-S1))로 형질전환시켰다.
재구축된 플라스미드 (VL-RACE-7-pIESRαγ1fa(VH-S1))를 24-웰 플레이트에서 리포펙타민™ 2000 (인비트로겐, cat. 11668-027)을 사용하여 CHO DG44 세포 (미국 10027 뉴욕주 뉴욕 MC2433 소재의 콜럼비아 유니버시티의 로렌스 체이신 교수로부터 직접 획득함) 내로 형질감염시켰다. ELISA를 적용하여 형질감염된 CHO DG44 클론을 스크리닝하였다. 페프로테크 EC 리미티드로부터 획득한 재조합 인간 가용성 Fas 및 래빗 항-인간 카파 경쇄-HRP (다코, cat. P0129)를 사용하여 인간 항-인간 Fas 항체를 검출하기 위해 이전과 동일한 ELISA 절차를 사용하였다. 또다른 ELISA를 적용하여, 특이적 고트 항-인간 IgG F(ab)2 단편 (잭슨 이뮤노리서치, cat. 109-005-097)를 이용하여 코팅하고, 특이적 2차 항체 퍼옥시다제-접합된 고트 항-인간 IgG Fcγ 단편 (잭슨 이뮤노리서치, cat. 109-035-098)을 이용하여 검출함으로써 전체 인간 IgG 이뮤노글로불린을 검출하였다. 클론 T17/B2 (T17/L18/B2)로부터의 상층액은 ELISA에서 rFas에 대해 양성을 나타내었고, 전체 인간 카파/IgG인 것으로 보였다. 또한, 항체의 예상되는 생물학적 활성을 확인하였다: T17/B2 (T17/L18/B2) 클론으로부터의 상층액은 저캣 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 억제할 수 있다 (실시예 6에서의 방법).
T17/B2 (T17/L18/B2) 클론을 3x 96-웰 플레이트에서 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 29개의 T17/B2 (T17/L18/B2) 서브클론을 기재된 ELISA에 의해 스크리닝하고, 서브클론 "T17/L18/B2-1G4"를 ELISA 스크리닝; 세포 성장 특징; 및 생물학적 활성의 데이타에 기초하여 추가의 개발을 위해 선택하였다. 서브클론 "T17/L18/B2-1G4"로부터의 상층액은 저캣 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 억제할 수 있으며 아팝토시스 그 자체를 유도할 수 없다. 서브클론 "T17/L18/B2-1G4"를, 화학적으로 한정된 단백질-무함유 배지 - CD DG44 배지에 적응시킨 후 FBS를 함유하는 F-12 (햄(Ham)) 배지 (기브코, cat. 31765-027)에서 배양하였다. 적응 동안 T17/L18/B2-1G4 클론을 5％ FCS-F-12 배지에서 5 계대; 2.5％ FCS-F-12 배지에서 5 계대; 및 1.25％ FCS-F-12 배지에서 9 계대; 및 마지막으로 100％ CD DG44 배지에서 배양하였다. 100％ CD DG44 배지에 적응시킨 세포는 잘 성장하였고, 양호한 생물학적 활성을 갖는 항체를 생산하였다.
재조합 인간 Mab T19 /B5-1F9 (감마-4 이소형 )의 생성:
재조합 인간 T19/B5-1F9 (감마-4 이소형) 항체를 얻기 위해, T17/L18/B2-1G4 클론으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 단편을, SR 알파 프로모터 및 인간 카파 경쇄 및 γ4P 동종이형인 인간 감마4 중쇄의 불변 영역을 함유하는 메다렉스로부터의 pIESRαγ4P 벡터 내로 재클로닝하였다.
정제된 VL-RACE-7-pIESRαγ1fa(VH-S1) 플라스미드 DNA로부터의 Nhe I/Not I 효소를 사용하여 정확한 VH 단편 (VH-S1)을 절단하고, T4 DNA 리가제 (인비트로겐, Cat. 15224-017)를 사용하여 pIESRαγ4P 벡터 (Nhe I/Not I 효소로 소화됨) 내로 삽입하였다. 재구축된 벡터를 pIESRαγ4P-VH-S1이라 명명하였다. 추가의 작업 및 예비 저장을 위한 충분한 물질을 얻기 위해, 맥스 이피션시 Stb12 적격 세포 (인비트로겐 Cat. #10268-019)를 pIESRαγ4P-VH-S1 벡터로 형질전환시켰다. pIE-F 및 VH_R 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 벡터 내로의 정확한 삽입을 체크하였다. 정제된 VL-RACE-7-pIESRαγ1fa(VH-S1) 플라스미드 DNA로부터의 Bg1 II/Bsi WI 효소를 사용하여 정확한 VL 단편 (VL-RACE-7)을 절단하고, T4 DNA 리가제 (인비트로겐, Cat. 15224-017)를 사용하여 pIESRαγ4P-VH-S1 벡터 (Bg1 II/Bsi WI 효소로 소화됨) 내로 삽입하였다. pIE-KV_F 및 pIE-KV_R 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 벡터 내로의 정확한 삽입을 체크하였다. 재구축된 벡터를 VL-RACE-7-pIESRαγ4P(VH-S1)라 명명하였다. 형질감염 및 예비 저장을 위한 충분한 물질을 얻기 위해, 맥스 이피션시 Stb12 적격 세포 (인비트로겐 Cat. #10268-019)를 VL/VH 삽입된 pIESRαγ4P 벡터 (VL-RACE-7-pIESRαγ4P(VH-S1))로 형질전환시켰다.
재구축된 플라스미드 (VL-RACE-7-pIESRαγ4P(VH-S1))를 리포펙타민™ 2000 (인비트로겐, cat. 11668-027)을 사용하여 CHO DG44 세포 내로 형질감염시켰다. ELISA를 적용하여 형질감염된 세포를 스크리닝하였다. 페프로테크 EC 리미티드로부터 획득한 재조합 인간 가용성 Fas 및 래빗 항-인간 카파 경쇄-HRP (다코, cat. P0129)를 사용하여 인간 항-인간 Fas 항체를 검출하기 위해 이전과 동일한 ELISA 절차를 사용하였다. 또다른 ELISA를 적용하여, 특이적 고트 항-인간 IgG F(ab)2 단편 (잭슨 이뮤노리서치, cat. 109-005-097)을 이용하여 코팅하고, 특이적 항-인간 IgG Fcγ 단편의 2차 항체 퍼옥시다제-접합된 고트 [F(ab')2 단편] (잭슨 이뮤노리서치, cat. 109-036-098)을 이용하여 검출함으로써 전체 인간 IgG 이뮤노글로불린을 검출하였다. 클론 T19/B5 (T19/L22/B5)로부터의 상층액은 ELISA에서 rFas에 대해 양성을 나타내었고, 전체 인간 카파/IgG인 것으로 보였다. 또한, T19/B5 (T19/L22/B5) 클론의 IgG4 이소형을, ELISA에 의해 특이적 쉽(sheep) 항-인간 IgG4 (더 바인딩 사이트(THE BINDING SITE), cat. PC009)를 사용하여 코팅하고, 2차 항체 래빗 항-인간 카파 경쇄-HRP (다코, cat. P0129)를 사용하여 검출함으로써 확인하였다. 또한, 항체의 예상되는 생물학적 활성을 확인하였다: T19/B5 (T19/L22/B5) 클론으로부터의 상층액은 저캣 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 억제할 수 있다 (실시예 6에서의 방법 참조).
T19/B5 (T19/L22/B5) 클론을 2x 96-웰 플레이트에서 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 18개의 T19/B5 (T19/L22/B5) 서브클론을 기재된 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 서브클론 "T19/L22/B5-1F9"를 ELISA 스크리닝, 세포 성장 특징 및 생물학적 활성의 데이타에 기초하여 추가의 개발을 위해 선택하였다. 서브클론 "T19/L22/B5-1F9"로부터의 상층액은 저캣 (ATCC로부터, 저캣, 클론 E6-1, ATCC-TIB-152, 인간 T 백혈병 세포주) 및 SKW6.4 세포 (ATCC로부터, ATCC-TIB-215, 인간 B 림프아구양 세포주) (둘 다 세포 표면에 인간 Fas를 발현함)에 결합할 수 있고, SKW6.4 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 억제할 수 있으며, 이들 세포에서 아팝토시스 그 자체를 유도할 수 없다 (각각 실시예 2 및 6에서의 방법 참조). T19/L22/B5-1F9 클론을 FBS를 함유하는 F-12 (햄) 배지 (기브코, cat. 31765-027)에서 배양하였다. 세포를 화학적으로 한정된 단백질-무함유 배지 - CD DG44 배지 (기브코, Cat. 12610-010)에 적응시켰다. 적응 동안 T19/L22/B5-1F9 클론을 2.5％ FCS-F-12 배지에서 3 계대; 1.25％ FCS-F-12 배지에서 7 계대; 및 0.3％ FCS-F-12 배지에서 3 계대; 및 마지막으로 100％ CD DG44 배지에서 배양하였다. 세포는 잘 성장하였고, 양호한 생물학적 활성을 갖는 항체를 생산하였다.
실시예 2
F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB는 FAS 발현 인간 T 세포의 표면에 결합한다.
Fas 발현 저캣 세포 (ATCC로부터, 저캣, 클론 E6-1, ATCC-TIB-152, 인간 T 백혈병 세포주) 및 Fas 발현 SKW6.4 세포 (ATCC-TIB-215, 인간 B 림프아구양 세포주)의 표면에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 결합을 면역형광 염색 및 유세포분석 검정에 의해 조사하였다. 세포를 2 mM 글루타맥스 (기브코), 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (시그마(Sigma)) 및 5-10％ 소 태아 혈청 (기브코)으로 보충된 RPMI 1640 배지 (기브코, Cat. 3105205)에서 37℃ 및 5％ CO2 하에 배양하였다. PBS에서 세척한 후, 저캣 또는 SKW6.4 세포 (0.2 x 106 세포/웰)를, 30분 동안 얼음 상의 96-웰 U-바닥 플레이트에서 웰 당 100 μl 부피로 F45D9-γ1, F45D9-γ4 또는 인간 IgG 대조군 항체 (인간 IgG1, 카파, 시그마, Cat. I5154 또는 인간 IgG4, 카파, 시그마, Cat. I4639)를 함유하는 염색 완충액 (PBS/1％ FBS)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하고, FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 IgG (다코사이토메이션 (DakoCytomation) Cat. F0056)의 1:30 희석액으로 얼음 상에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. PBS에서 세척하고 1％ 포름알데히드로 고정시킨 후, 세포를 FACScan (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 분석하였다. 저캣 세포의 표면에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4의 반응성을 정량화하였고, 배경 공제 후의 기하 평균 형광 강도 (MFI) (도 1a) 및 히스토그램 (도 1b)을 도시한다. 굵은 실선은 F45D9-γ1 mAb에 의한 염색을 나타내고, 가는 실선은 이소형 대조군 항체에 의한 염색을 나타낸다. 도 1c는 SKW6.4 세포의 표면에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 결합을 도시하며; 결과는 배경 공제 후 기하 평균 형광 강도 (MFI)로서 도시한다. 전방 및 측방 산란 게이트는 사멸 세포를 제외하도록 설정하였다. 대표적인 두 실험으로부터의 데이타를 도시한다.
실시예 3
F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB는 특이적 방식으로 FAS 분자에 결합한다.
염색 완충액 (PBS/1％ FBS) 중에 희석된 F45D9-γ1 mAb를 40 μg/ml의 재조합 sFas (재조합 인간 가용성 Fas 수용체, 페프로테크 EC 리미티드, Cat. 310-20)와 함께 1시간 동안 96-웰 U-바닥 플레이트에서 사전-인큐베이션하거나 하지 않았다. 이어서, 0.2 x 106개 (도 2a) 저캣 (도 2b) SKW6.4 세포 (악성 인간 림프아구양 B 세포)를 웰 마다 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하고, FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 카파 (다코사이토메이션 Cat. F0434)의 1:30 희석액을 사용하여 얼음 상에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. PBS에서 세척하고 1％ 포름알데히드로 고정시킨 후, 세포를 FACScan (벡톤 디킨슨, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 분석하였다. 전방 및 측방 산란 게이트는 사멸 세포를 제외하도록 설정하였다. 데이타는 (인간 IgG 대조군 항체 (인간 IgG1, 카파, 시그마, Cat. I5154)를 사용하여) 배경 평균 형광 강도 (MFI)의 공제 후 특정 MFI를 나타낸다. 도 2a 및 2b는 대표적인 두 실험으로부터의 데이타를 도시한다.
Fas 발현을 넉-다운(knock-down)시키기 위한 항-Fas siRNA를 이용한 형질도입 (문헌 [Dotti G., et al, Blood, 105:4677-4684, 2005]) 후 상이한 수준의 Fas를 발현하는 상이한 저캣 세포주의 표면에 대한 F45D9-γ4의 결합을 면역형광 염색 및 유세포분석 검정에 의해 조사하였다. 저캣 p 수퍼 (비어있는 벡터로 형질도입됨), 저캣 FasR10 (항-Fas siRNA10으로 형질도입됨) 및 저캣 FasR10/FasR8GFP (항-Fas siRNA10 및 GFP-siRNA8로 순차적으로 형질도입됨)를 지. 도티(G. Dotti) 박사의 실험실 (세포 및 유전자 요법을 위한 센터; 미국 텍사스주 휴스턴 소재의 베일러 컬리지 오브 메디신(Baylor College of Medicine))로부터 수득하고, 37℃ 및 5％ CO2 하에 2 mM 글루타맥스 (기브코), 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (시그마) 및 5-10％ 소 태아 혈청 (기브코)으로 보충된 RPMI 1640 배지 (기브코, Cat. 3105205)에서 배양하였다. PBS에서 세척 후, 저캣 세포를 30분 동안 얼음 상의 96-웰 U-바닥 플레이트에서 웰 당 100 μl의 부피로 10 μg/ml의 F45D9-γ4를 함유하는 염색 완충액 (PBS/1％ FBS)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하고, 얼음 상에서 PE-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 카파 (다코사이토메이션 Cat. F0436)의 1:30 희석액으로 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서 PE-라벨링된 마우스 항-CD95 mAb (BD 파밍겐 (BD Pharmingen) Cat. 555674)를 사용하였다. PBS에서 세척하고 1％ 포름알데히드로 고정시킨 후, 세포를 상기 기재된 바와 같은 FACScan에서 분석하였다. 도 2c는 상이한 수준의 Fas를 발현하는 저캣 세포의 표면에 대한 F45D9-γ4 mAb 결합의 히스토그램을 도시한다. 굵은 실선은 F45D9-γ4 mAb 또는 항-CD95 양성 대조군 mAb에 의한 염색을 나타내고, 채워진 히스토그램은 대조군 항체에 의한 염색을 나타낸다.
결과
도 2a 및 2b는 F45D9-γ1 mAb와 재조합 sFas의 사전-인큐베이션이 Fas 발현 저캣 또는 SKW6.4 세포주의 표면에 대한 항체의 결합을 완전히 차단하였음을 도시한다.
도 2c는 Fas의 발현이 완전히 넉-다운된 저캣 세포 (저캣 FasR10/FasR8GFP)에 대해 F45D9-γ4 mAb가 결합하지 않음을 보여주는데, 이는 Fas 분자에 대한 F45D9-γ4 mAb의 특이적 결합을 증명한다.
실시예 4
F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB 의 FAS 결합 친화도
F45D9 mAb (γ-γ1 및 γ4 - 아이소타입)와 고정화된 가용성 인간 Fas 수용체의 상호작용을 비아코어 (BIAcore) 3000 기기를 이용하여 표면 플라스몬 공명 검출로 모니터하였다. 재조합 인간 가용성 Fas 수용체 (srFas) (페프로테크, cat. 310-20)를 아민 커플링 키트 (비아코어, Cat. BR-1000-50)를 사용하여, 1000110 공명 단위 (RU)의 표면 밀도로 CM5 센서 칩 (비아코어 BR-1001-14) 상에 고정화하였다 (고정화 완충액: 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 중 5 ug/ml 농도). 1.0 M 에탄올아민 히드로클로라이드 (pH 8.5)를 첨가하여 칩 표면 상의 과량의 반응성 기를 불활성화하였다. F45D9 mAb-γ1 mAb를 평형 결합 실험에서 2.123 내지 68132 nM 범위의 농도로 유속 30 ul/분으로 상기 표면에 통과시켰다. 0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005％ P-20 (비아코어 계면활성제, BR-1001-88) 중에서 희석 및 결합 실험을 실시하였다. 각 사이클 사이에 100 mM HCl을 유속 30 ul/분으로 사용하여 표면을 재생하였다. 비아코어 모델 (비아이밸루에이션(BIAevaluation))을 사용하여 2가 피팅 (fitting)으로 F45D9 mAb-γ1 mAb의 KA 및 KD를 측정하였다.
결과
IgG1에 대해 계산된 결합 상수 KD는 4.11 x 10-11 M이고, 카이(Chi) 값은 139이며; IgG4에 대한 KD는 5.87 x 10-11 M이고, 카이 값은 51이다.
비아코어 결합 친화도 분석으로부터 수득한 값은, KA 6.5 x 109 M-1 및 KD 1.53 x 10-10 M, 카이 값 0.75이다.
도 3a는 Fas/IgG1 상호작용 데이타의 센소그램 및 2가 분석 대상물 피트 (fit)를 제시한다 (중첩됨). 유색 선은 상이한 농도의 IgG1을 주입한 것으로서, Fas 수용체 표면 상에서 3, 6, 33, 66, 132 nM mAb 농도에서 Fas에 대한 F45D9-γ1 mAb의 결합을 보여준다. IgG1 농도는 2.12, 4.25, 17 및 68 nM이다. 흑색 선은 2가 분석 대상물 모델에 대한 결합 데이타의 최상의 피트를 나타낸다.
도 3b는 Fas/IgG4 상호작용 데이타의 2가 분석 대상물 피트를 제시한다. 유색 선은 Fas 수용체 표면에 대해 다양한 농도의 IgG4를 주사한 것이다. IgG4 농도는 2.12, 4.25, 17 및 68 nM이다. 흑색 선은 2가 분석 대상물 모델에 대한 결합 데이타 및 친화도 상수를 계산하는, 비아코어 모델 적용 결과의 최상의 피트를 나타낸다. 1:1 결합 모델은 3, 6 및 33 nM을 사용하여 우수한 피트를 제공하였다.
일반적인 구조의 항체는 통상 Fc 영역에서 탄수화물 쇄를 함유한다. 또한, ...TNY... (N58) 및 ...LNL... (N81)에서의 인실리코 (in silico) 모델링 (N-글리코실화)에 의해 F45D9에서 중쇄 (Fab)의 가변 영역 내 잠재적인 2개의 글리코실화 부위가 시사되었다. 이들 아스파라긴은 둘 모두가 베타-시트에서 표면 노출된 잔기이며, 따라서 구조적 관점에서도 또한 실제 글리코실화 부위일 수 있다. 이들 탄수화물 구조는 Fas 수용체에 대한 항체의 실제 결합에 직접적으로 영향을 미칠 수 있을 것이다.
상기 제안된 특이적 부위에서의 탄수화물 구조는 아직 밝혀지지 않았으나, Fab 영역 내 탄수화물의 존재는 비특이적으로 확립되었으며, 이는 상기 제안된 부위 중 하나 또는 둘 모두에서의 탄수화물의 존재를 제안하는 것을 매우 타당하게 한다.
실시예 5
F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB 에 대한 에피토프 맵핑
JPT 펩티드 테크놀로지로부터의 펩티드 마이크로어레이를 사용하여 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb에 대한 에피토프 맵핑을 실시하였다. 이 마이크로어레이는 유리 표면 상에 고정화된 TNR6_인간 단백질 (FAS 분자, 등록 번호 P25445; 문헌 [Oehm A. et al. J. Biol. Chem. 267:10709, 1992])의 여러 상이한 펩티드 스캔물로 구성되어 있다. 이 마이크로어레이를 차단 완충액 (피어스(Pierce), 슈퍼블록(Superblock))으로 실온에서 2시간 예비-처리한 후, TBS 완충액 (pH 8.0) 및 물로 세척하였다 (각각 3회). 예비-처리한 어레이를 엑손(Axon)-4000B-마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캔하여 배경 대조군으로 하였다. 그런 다음, 어레이를 F45D9-γ1 mAb (검정 완충액 (피어스, 슈퍼블록) 중 최종 농도 50 ug/ml)와 함께 인큐베이션한 후, TBS 완충액 (pH 8.0)으로 세척하고, 2차 항체인 항-인간-Cy5 (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch) 209-175-082)와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 2차 항체만을 이용한 대조 인큐베이션을 병행하여 실시하였다. 적절한 파장으로 설정된 엑손-4000B-마이크로어레이 스캐너를 사용하여 모든 마이크로어레이를 스캔하였다. 데이타 분석을 위해 스팟 (SPOT) 인식 소프트웨어 패키지 어레이프로 (ArrayPro)를 사용하였다. 각 마이크로어레이 이미지에 대한 3개의 동일한 하위어레이로부터의 신호 강도의 평균을 데이타 평가에 사용하였다.
결과
에피토프 맵핑 분석은 TNR6_인간 단백질 영역 aa169-aa191에 대한 F45D9-γ1 mAb의 결합을 제시하는데 (문헌 [Oehm A. et al. J. Biol. Chem. 267:10709, 1992]), 이는 선형 에피토프인 것으로 보인다. Fas 단백질 서열 (서열 11; 문헌 [Itoh, N. et al., Cell, 66:233-243, 1991])과의 정렬은 F45D9-γ1 mAb가 31, 32 및 33 결합 펩티드 (각각 서열 12, 13 및 14)의 공통의 영역에 결합한다는 것을 제시하는데, 이 영역은 aa145-aa164, 즉 SNTKCKEEGSRSNLGWLCLL (서열 15)에 상응한다 (도 4 및 5).
실시예 6
인간 T 및 B 세포에서 RHFASL -유도 아팝토시스에서의 F45D9-γ1, F45D9-γ4 MAB 및 FAB 단편의 시험관내 길항 활성.
아팝토시스에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 영향을 평가하기 위해서, 인간 T 및 B 세포주를 재조합 인간 FasL (rhFasL)을 이용하여 시험관내에서 사멸하도록 유도하였다. 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후에 아팝토시스를 측정하였다. 저캣 (도 6a, 도 6b 및 도 6c) 또는 SKW6.4 세포 (도 6d) (0.2 x 106개 세포/웰)를 2 mM 글루타맥스(glutamax), 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 5％ 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 100 ul/웰이 단독으로 또는 200 ng/ml의 rhFasL (알 앤 디 시스템스(R & D Systems), Cat. 126-FL) + 10 μg/mL 항-6X 히스티딘 mAb (알 앤 디 시스템스, Cat. MAB050)와 함께 담긴 96-웰 U-바닥 플레이트에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 아팝토시스에 대한 항체의 영향을 평가하기 위해, 세포를 상이한 농도의 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb 또는 인간 IgG 대조군 항체 (인간 IgG1, 카파)와 함께 37℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 아넥신-V-FITC 아팝토시스 검출 키트 (BD 바이오사이언씨스, Cat. 556547)를 이하와 같이 제조자의 지시에 따라 사용하여 아넥신-V 및 PI 염색으로 아팝토시스를 측정하였다: 세포를 PBS로 세척하고, 2 ul의 아넥신-V-FITC 용액 및 2 μl의 프로피디움 요오다이드 용액을 함유한 50 μl의 결합 완충액 (10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) 중에서 실온에서 어두운 곳에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 결합 완충액을 첨가한 후, 세포를 즉시 FACScan으로 분석하였다 (도 6a, 6b, 6c 및 6d).
저캣 세포에서 각각 실시예 2 및 실시예 6에 기재된 실험 절차를 따라, F45D9-γ1, F45D9-γ4 mAb, 및 F45D9-γ1 F(ab')2 및 Fab 단편의 결합 역가 (도 6e) 및 FasL-유도 아팝토시스에 대한 영향 (도 6f)을 연구하였다. 도 6e에서는 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 IgG (다코사이토메이션, Cat. F0056)를 2차 항체로 사용하였다. 항체 농도는 완전한 분자의 항체 및 항체 단편을 비교할 수 있도록 nM 단위로 표시되어 있다.
결과
F45D9-γ1 mAb 또는 F45D9-γ4 mAb는 인간 T 세포주 저캣에서 시험관내 FasL-유도 아팝토시스를 0.1 ug/ml 내지 25 ug/ml 범위의 농도 (IC50: 10-40 pM)에서 용량 의존적 방식으로 및 인간 B 세포주 SKW6.4에서는 0.4 ug/ml 내지 25 ug/ml 범위 (IC50: 200 pM)에서 억제하는 것으로 나타났다. 또한, F45D9-γ1 mAb 또는 F45D9-γ4 mAb 단독은 이들 세포 유형에서 아팝토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다.
도 6f에서, 5D9-γ1 Fab는 저캣 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 5D9-γ1, 5D9-γ4 및 5D9-γ1 F(ab')2의 경우보다 100배 더 큰 농도에서 차단한다는 것이 제시되어 있다. 이 농도는 5D9-γ1 Fab와의 결합에서의 포화도와 상관관계가 있다 (도 6d). 그러나 5D9-γ1, 5D9-γ4 및 5D9-γ1 F(ab')2의 경우 아팝토시스의 완전한 차단은 12,5％ 이상의 결합능이 존재할 때 달성된다 (도 6e 및 6f). 이러한 결과는 5D9 Fab의 작용 메카니즘이 FasL을 차단함에 의한 것일 수 있으나, 5D9-γ1, 5D9-γ4 및 5D9-γ1 F(ab')2의 경우, 이는 아팝토시스 억제를 유도하는 신호의 활성화와 관련된 어떤 다른 메카니즘 (예컨대, DISC 형성 관련 메카니즘; 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), NFkB, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), AKT의 활성화와 같은, 생존으로 유도하는 비-아팝토시스성 Fas-매개 신호전달의 유발)일 수 있음을 시사한다.
실시예 7
인간 T 세포에서의 활성화 유도 세포 사멸 ( AICD )에서의 F45D9-γ1 MAB 및 F45D9-γ4 MAB 의 시험관내 길항 활성.
도 7a 및 도 7c는 각각 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4에 의한 인간 T 세포에서의 활성화 유도 세포 사멸 (AICD)의 차단을 입증하는 실험 결과를 제시한다.
1차 T 세포의 제조: 림포프렙 (Lymphoprep) (악시스-쉴드 피오씨 에이에스 (Axis-Shield PoC AS) 대신 프레제니우스 카비 노르제 에이에스 (Fresenius Kabi Norge AS), 노르웨이 오슬로) 밀도 구배 원심분리를 이용하여 자원한 건강한 공여자로부터의 정맥 혈액 샘플로부터 인간 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)를 단리하였다. 이어서, 판트 (Pant) T 세포 단리 키트 II (인간, MACS, 밀테니 바이오테크 인크.(Miltenyi Biotech Inc.), Cat. 130-091-156)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 음성 선택에 의해 T 세포를 수득하였다. 이 단리 절차에 의해 유세포분석으로 측정시 90％ CD3 양성인 T 세포 집단이 의례적으로 생성되었다.
문헌 [Schmitz, I, et al, J. Immunol., 171:2930-2936, 2003]에 기재된 바와 같이 하여 T 세포를 활성화하였다. 간략히, 휴지상태의 T 세포 (제0일)를 T25 플라스크에서 1 ug/ml PHA를 함유하며 2 mM 글루타맥스, 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 10％ 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 2 x 106개 세포/ml로 16시간 동안 배양하였다 (제1일). 이어서, 제1일 T 세포 (> 95％ CD3 양성)를 PBS로 3회 세척하고, 25 U/ml IL-2의 존재 하에서 추가 5일 동안 배양하였다 (제6일). 제6일에, 사멸한 세포를 밀도 원심분리로 제거하였다. 세포를 배지로 세척하고, 새로운 배지에 재현탁시켰다. 그런 다음, 실시예 6에 기재된 바와 같이 활성화된 T 세포를 사용하여 재조합 인간 FasL (rhFasL)로 시험관내에서 유도 아팝토시스에 대한 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb의 영향을 평가하였다. 활성화된 인간 T 세포를 또한 F45D9-γ1 (도 7b) 또는 F45D9-γ4 (도 7d) mAb로 염색한 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 카파 경쇄 또는 항-IgG Fc 항체 (다코사이토메이션 Cat. F0434 또는 F0056)로 염색하였다. Fas 항원에 대한 F45D9의 반응성을 유세포분석으로 정량화하고, MFI로 나타내었다. 전방 및 측방 산란 게이트를 사멸한 세포를 제외하도록 설정하였다. 상이한 공여자를 이용한 2회의 실험의 대표 실험으로부터의 데이타가 제시되어 있다.
결과
F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb는 활성화된 인간 T 세포에서의 시험관내 FasL-유도 아팝토시스를 0.1 ug/ml 내지 15 ug/ml 범위의 농도 (IC50: 20 pM)에서 용량 의존적 방식으로 억제하는 것으로 나타났다. 또한, F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb 단독은 활성화된 인간 T 세포에서 아팝토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 8
FASL -유도 세포 사멸에서 F45D9-γ1 MAB 의 생체내 길항 활성 ( SCID 마우스 모델)
SCID 마우스에서 종양 접종 및 항체 처리: 4-5 주령의 암컷 CB.17 SCID/SCID 마우스 (할란(Harlan); 이탈리아 코레자나, 밀라노)를 특정 병원체-무함유 조건 하에서 유지시켰다. 0.2 ml의 RPMI-1640에서 재현탁된 4 x 106개 헬라 세포 (인간 자궁경부 암종 세포주; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 구입)를 각각의 마우스에게 오른쪽 측복부에 피하로 주사하였다. 10일 후, 약 0.5 cm의 종양 직경을 갖는 마우스를 선택하였다. PBS에서 100 ul 부피로 재현탁된 F45D9-γ1 mAb (50 또는 5 ug)를 종양에 직접 주사한 다음, 1시간 후 PBS에서 희석되고 1시간 동안 37℃에서 사전-인큐베이션된 rhFasL (알 앤 디 시스템(R & D System), Cat. 126-FL) 5 ug/마우스 및 모노클로날 항-6X 히스티딘 (알 앤 디 시스템, Cat. MAB050) 50 ug/마우스의 믹스 100 ul/마우스를 동일한 곳에 주사하였다. 대조군으로부터의 각각의 동물에게 오직 100 ul/마우스 PBS를 종양에 주사하였다. 24시간 후, 동물을 희생시키고, 조직 절편을 튜넬 검정에 의한 아팝토시스 검출을 위해 가공하였다. 각각의 처리군에 대해 세마리의 마우스를 사용하였다.
튜넬 검정: 동결된 절편을 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1％ 트리톤(Triton) X-100, 0.1％ 나트륨 시트레이트로 투과화하였다. 제조 지시사항 (계내 세포 사멸 검출 키트, TMR 레드 (로슈(Roche), Cat. 2 156792)에 따라 튜넬 반응을 수행하였다. 슬라이드를 헹구고, 대비 염색하고, 광학 현미경 하에 분석하였다. 각각의 검정에 포함된 양성 대조 절편을 DNase 처리하였다.
결과
도 8에 나타낸 바와 같은 이미지에 의해 입증된 바와 같이, F45D9-γ1 mAb의 존재하에 세포 염색 감소가 존재하며, 이는 F45D9 처리된 종양 대 비처리된 종양 (오직 rhFasL이 주사됨)에서 FasL-유도된 세포 사멸 수준의 감소를 나타낸다. 이들 결과는 F45D9-γ1 mAb가 FasL을 통해 아팝토시스를 차단할 수 있다는 암시를 제공하는 시험관내 데이터를 확실하게 하였다. F45D9-γ1 mAb 단독에 의한 처리는 배경 수준보다 세포 사멸을 증가시키지 않았으며, 이는 F45D9-γ1 mAb 단독에 의해 아팝토시스가 유도되지 않는다는 시험관내 데이터를 확실하게 한다.
실시예 9
비인간 영장류 마모셋 및 침팬지의 FAS 분자와의 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB의 반응성
1차 혈구 또는 림프구 세포주를 사용하여 다양한 종의 Fas 분자와의 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb의 반응성을 초기에 스크리닝하였다. 인간 PBMC, 정제된 인간 휴지 T 세포, 활성화된 인간 T 세포, BALB/c 마우스, 래트, 개 및 돼지로부터 유래된 말초혈 림프구 (PBL)에서, 및 커먼 마모셋, 사이노몰구스 원숭이 (cynomolgus macaque), 올리브 개코원숭이 (olive baboon), 붉은털 원숭이 (rhesus macaque) 및 침팬지로부터 유래된 B 세포주 또는 PBL에서, 면역형광 염색 및 유세포분석 검정에 의해 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb의 결합을 탐구하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이 휴지 및 활성화된 인간 T 세포를 제조하였다. 원숭이로부터의 B 세포주를 생물의학 영장류 연구 센터 (Biomedical Primate Research Center; 네덜란드 라이스윅)로부터 얻고, 37℃ 및 5％ CO2에서 2 mM 글루타맥스(glutamax), 100 UI/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10％ 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. PBS 세포 (0.2-0.4 x 106개 세포/웰)에서 세척 후 F45D9-γ1 또는 인간 IgG 대조 항체 (10-20 ug/ml)를 함유하는 염색 완충액 (PBS/1％ FBS)에서 100 ul/웰 부피에서 얼음 상에서 30분 동안 96-웰 U-바닥 플레이트에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하고, 추가로 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 카파 (다코사이토메이션, Cat. F0434) 또는 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 IgG (다코사이토메이션 Cat. F0056)의 1:30 희석으로 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 인간 및 원숭이 세포에서 Fas 염색을 위해 양성 대조군으로서 FITC-접합된 마우스 항-인간 CD95 mAb (클론 DX2, BD 바이오사이언씨스, cat. 555673)를 사용한 반면, 마우스 PBL에서 양성 Fas 염색을 위해 20 ug/ml의 햄스터 항-마우스 Fas (Jo2 mAb, BD 파밍겐, Cat. 15400D), 이어서 20 ug/ml FITC-접합된 항-아르메니아 및 시리아 햄스터 IgG (BD 파밍겐, Cat. 444011)를 사용하였다. Fas 항원에 대한 항체의 반응성을 유세포분석에 의해 정량하였으며, 히스토그램은 도 9a 및 도 9b에 나타낸다. 굵은 실선은 항-Fas 항체에 의한 염색을 나타내고, 가는 실선은 이소형 대조 항체에 의한 염색을 나타낸다. 사멸된 세포를 제외시키도록 전방 및 측면 산란 게이트를 설정하였다. 2개의 실험의 대표로부터의 데이터를 표시하였다.
인간세포와 마모셋 세포 간의 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 결합 친화도의 비교를 위해, 상기 기재된 바와 같이 2차 항체로서 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 IgG (다코사이토메이션 Cat. F0056)를 사용하여, 인간 B 세포주 (SKW6.4) 및 마모셋 B 세포주 (두 동물, 9505 및 9601로부터 확립됨) 상의 Fas에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 상이한 농도의 반응성을 유세포분석에 의해 정량하였다. 대조 인간 γ1 및 γ4에 의한 배경 염색의 공제 후 MFI의 결과는 도 9c 및 9d에 나타낸다. 사멸된 세포를 제외시키도록 전방 및 측면 산란 게이트를 설정하였다. 2개의 실험의 대표로부터의 데이터를 표시하였다.
인간과 마모셋 간의 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 결합 친화도의 비교를 위해, 1마리의 마모셋 동물 및 인간 건강한 공여자로부터 단리된 PBMC를 사용하여 결합 적정 (40-0.0015 ug/ml의 범위)을 또한 수행하였다. 염색 절차는 2차 항체로서 FITC-접합된 래빗 F(ab')2 항-인간 IgG (다코사이토메이션 Cat. F0056)를 사용하여 상기 기재된 바와 같았다. 결과는 대조 인간 γ1 및 γ4에 의한 배경 염색의 공제 후 MFI로서 도 9e (마모셋 PBMC) 및 9f (인간 PBMC)에 나타낸다.
면역조직화학적 교차-반응성 연구에서 인간 및 마모셋 조직에 대한 F45D9-γ4 mAb의 결합을 평가하였다. 동결된 인간 및 마모셋 조직을 8 ㎛로 동결 절단하고, 냉 아세톤에서 고정 후 절편을 FIT-표지된 F45D9-γ4 mAb 또는 이소형 대조로 각각 염색하고, 2차 마우스 항-FITC 및 항-마우스-HRP 항체를 사용하여 현상하였다.
결과
본 발명자들은 F45D9 항체, γ1 및 γ4 이소형 양자 모두는 인간 림프구 및 또한 비인간 영장류 침팬지 및 커먼 마모셋으로부터의 림프구 상의 Fas에 결합한다는 것을 입증하였다. 그러나, 매우 낮은 백분율의 마우스 (도 9a), 래트, 개, 돼지 또는 기타 비인간 영장류 종 (도 9b 및 표 2)으로부터의 림프구의 F45D9 mAb와 반응하거나 또는 전혀 반응하지 않았다. 도 9c 및 9d에 나타낸 결과는 인간세포와 마모셋 세포 간의 F45D9의 유사한 결합 친화도를 나타낸다. 또한, 도 9e 및 9f는 마모셋 및 인간 1차 림프구 상의 F45D-γ1 및 γ4 항체에 대한 유사한 결합 적정 곡선을 나타낸다.
인간 및 마모셋 조직에서 면역조직화학적 교차-반응성 연구는 F45D9-γ4 mAb가 연구된 조직 중 많은 것들과 반응하였다는 것을 나타내었다. 모든 림프 기관은 현저한 반응성을 나타내었고, 기타 양성 조직은 특히 간, 부신, 피부의 상피, 식도 및 자궁 경부였다. 인간 및 마모셋 조직을 비교시 반응 패턴이 유사하였다. 인간 및 커먼 마모셋 간 조직과의 F45D9-γ4 mAb 반응성은 도 9g에 예시한다.
실시예 10
비인간 영장류 커먼 마모셋으로부터 B 세포 및 활성화된 림프구에서 RHFASL-유도 아팝토시스에서 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB의 시험관내 길항 활성
rhFasL-유도 아팝토시스에 대한 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb의 길항 활성을 실시예 6에 기재된 바와 같이 커먼 마모셋으로부터 단리된 불멸화된 B 세포에서 시험관내에서 평가하였다. 두 커먼 마모셋 원숭이 (도 10a에서 마모셋 9601; 도 10b에서 마모셋 9505))로부터 유래된 B 세포주를 생물의학 영장류 연구 센터 (네덜란드 라이스윅)로부터 얻었으며, 이를 검정에서 사용하기 전에 37℃ 및 5％ CO2에서 2 mM 글루타맥스, 100 UI/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10％ 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 인간 및 마모셋 B 세포주 양자 모두에서 F45D9-γ4 mAb의 길항 활성을 비교하기 위해 인간 B 세포주 SKW6.4를 또한 사용하였다 (도 10b). 아팝토시스에 대한 항체 효과를 평가하기 위해, 1시간 동안 37℃에서 100 ul/웰의 배지에서 F45D9-γ1 mAb (10 ug/ml) 또는 상이한 농도의 F45D9-γ4 mAb (25-0.006 ug/ml)와 함께 또는 대조로서 배지 단독과 함께 세포를 사전-인큐베이션하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 아넥신-V 및 프로피디움 요오다이드 (PI) 염색 및 유세포분석 검정 후 아팝토시스를 측정하였다. 2개의 실험의 대표로부터의 데이터는 도 10a 및 10b에 나타낸다.
실시예 6에 기재된 바와 같이 커먼 마모셋으로부터 단리된 활성화된 림프구에서 재조합 인간 FasL (rhFasL)에 의해 시험관내에서 유도 아팝토시스에 대한 F45D9-γ4 mAb의 길항 활성을 또한 연구하였다. PBMC를 두 커먼 마모셋 동물 (마모셋 1196 및 마모셋 1181)로부터 단리하고, 실시예 7에 기재된 바와 같이 활성화시켰다.
결과
F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb가 6 ug/ml 내지 25 ug/ml 범위의 농도에서 용량 의존적 방식으로 마모셋 B 세포에서 FasL-유도 아팝토시스를 시험관내에서 억제한다는 것이 입증되었다 (도 10a 및 10b). 또한, F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb는 단독으로 이러한 세포 유형에서 아팝토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다.
도 10c (마모셋 1196) 및 도 10d (마모셋 1181)에서, F45D9-γ4 mAb는 0.1 ug/ml 내지 10 ug/ml 범위의 농도에서 용량 의존적 방식으로 활성화된 마모셋 림프구의 FasL-유도 아팝토시스를 시험관내에서 억제하는 것으로 나타났다. 또한, F45D9-γ4 mAb는 단독으로 활성화된 마모셋 림프구에서 아팝토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다. 결과는 인간 및 마모셋 림프구에서 F45D9-γ4 mAb의 유사한 길항 활성을 나타낸다.
실시예 11
인간 T 세포의 활성화 및 증식에서 F45D9-γ1-매개 공동-자극 신호
Fas가 T 세포 활성화 동안 공동-자극 인자로서 기술되어 왔기 때문에, 본 발명자들은 T 세포 활성화 및 증식을 공동-자극하는 F45D9-γ1 mAb의 잠재성을 연구하였다.
인간 T 세포를 실시예 7에 기재된 바와 같이 정제하고, F45D9-γ1과 함께 또는 상기 없이 준최적의 농도의 고체상-결합된 항-CD3 모노클로날 항체 또는 대조로서 작용하는 잘 특징화된 마우스 항-Fas mAb인 CH-11 mAb와 함께 3일 동안 배양하였다. 활성화 마커, 즉 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD25 (IL-2 수용체) 및 CD69의 발현을 측정하여 T 세포 활성화를 평가하였다. CFSE 표지된 세포의 3H-티미딘 혼입 및 FACS 분석을 측정하여 T 세포 증식을 평가하였다.
1. 인간 T 세포의 활성화에 대한 F45D9-γ1 mAb의 효과
96-웰 평면 바닥 플레이트 (코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 코스타(Costar) 3590)를 F45D9-γ1과 함께 또는 상기 없이 100 ㎕ PBS 중 500 또는 50 ng/ml의 농도의 마우스 항-인간 CD3 mAb (클론 HIT3a, BD 파밍겐, Cat. 555336) 또는 농도 1 ug/ml의 마우스 항-Fas CH-11 (MBL, Cat. SY-001) 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 배지로 1회 세척한 후, 200 ㎕ 배지 (2 mM 글루타맥스, 100 UI/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10％ 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지)에 재현탁된 1.5 x 105개 정제된 T 세포를 시딩하였다. 배양 3일 후, 세포를 수확하고, PBS로 세척하고, APC-접합된 항-CD4 또는 -CD8, PE-Cy5-접합된 항-CD69 및 PE-접합된 항-25 (BD 파밍겐)로 염색하였으며, 세포를 암실에서 +4℃에서 30분 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBS에서 세척한 후, 세포를 PBS 중 1％ 파라포름알데히드에서 고정시켰다. 팩스칼리버(FACScalibur) 유세포분석기 및 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro) (벡톤-딕킨슨(Beckton-Dickinson)) 소프트웨어를 사용함으로써 FACS 분석을 수행하였다. 통상적으로는, 10,000개 세포를 분석을 위해 수집하고, 측면/전방 산란을 사용하여 게이팅하고; 추가로 CD25 및 CD69 발현의 분석 전에 CD4 또는 CD8 양성 세포를 게이팅하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포 상의 CD25 및 CD69 이중 양성 세포의 백분율을 각각 도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험의 대표이다.
결과
T 세포의 완전 활성화 및 증식를 허용하는 신호를 그 자신 혼자 힘으로 제공하지 않기 위해 항-CD3의 준최적의 농도 (50 및 500 ng/ml)를 선택하였다. 어떠한 활성화도 없이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 양자 모두의 10％ 미만이 CD25 및 CD69를 발현하였다. 고체 결합된 항-CD3 및 F45D9-γ1 mAb에 의한 T 세포의 활성화는 코팅된 항-CD3 단독과 함께 배양된 세포와 비교하여 심지어 50 ng/ml 항-CD3 mAb의 낮은 농도에서도 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 활성화 마커 양자 모두의 극적 증가에 이르게 하였다. 흥미롭게도, CD8+ T 세포는 CD4+ T 세포보다 더 많이 CD25 및 CD69의 막 발현을 상향조절하였다. F45D9-γ1 및 CH-11 mAb 양자 모두는 활성화 마커 발현에 대해 유사하게 작용하였다. 그러므로, F45D9-γ1 mAb는 인간 T 세포의 활성화에서 공동-자극 신호를 매개할 수 있었다.
2. 인간 T 세포의 증식에 대한 F45D9-γ1 mAb의 효과
96-웰 평면 바닥 플레이트 (코닝 인코포레이티드, 코스타 3590)를 F45D9-γ1과 함께 또는 상기 없이 100 ㎕ PBS 중 500 또는 50 ng/ml의 농도의 마우스 항-인간 CD3 mAb (클론 HIT3a, BD 파밍겐, Cat. 555336) 또는 농도 1 ug/ml의 마우스 항-Fas CH-11 (MBL, Cat. SY-001) 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 인간 IgM 또는 인간 IgG1카파 (각각 시그마(Sigma), Cat. 18260 및 I5154)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 웰을 배지로 1회 세척한 후, 200 ㎕ 배지에 재현탁된 1.5 x 105개 정제된 T 세포를 시딩하였다. 오직 항-CD3 mAb에 의해 코팅된 일부 웰에서, 항-Fas 항체를 그의 가용성 형태의 항체 효과를 평가하기 위해 세포와 함께 첨가하였다. 3H-티미딘 혼입을 측정하여 배양 3일 후 증식을 평가하였으며, 세포를 50 μCi/ml [메틸-3H]-티미딘 (시그마) 20 ㎕/웰 (1 μCi/웰)로 마지막 18시간 동안 펄싱하였다. 세포를 제3일에 유리 섬유 필터 상으로 수확하고, 액체 섬광 칵테일 (베타플레이트(Betaplate) Scint.)로 밀봉하였다. 그 후, 액체 섬광 계수기 (1450 마이크로베타(Microbeta))를 사용하여 3H-티미딘 흡수를 측정하였으며, 결과는 cpm으로 표시한다. 실험을 삼중으로 수행하였다.
동시에, 정제된 T 세포를 CFSE로 염색하였다. 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 1회 세척하고, 0.1 μM CFSE (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))를 함유하는 예비가온된 PBS 10 ml에서 희석하였다. 37℃에서 15분 인큐베이션 후, T 세포 현탁액을 예비가온된 배지로 세척하고, 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. CFSE-염색된 T 세포를 계수하고, 플레이트에 첨가되는 (1.5 x 105개/웰) 배지 10％ FCS에서 재현탁하고, 상기 언급된 바와 동일한 조건에서 활성화하였다. 배양 3일 후, CFSE-표지된 세포를 수확하고, 증식을 평가하기 위해 FACS (벡톤-딕킨슨)에 의해 분석하였다. 도 12b에 나타낸 데이터는 2개의 상이한 실험의 대표이다.
결과
CH-11의 경우 약간 더 높았으나, F45D9-γ1 및 CH-11 mAb 둘 다 항-CD3의 준최적 농도 (500 ng/ml)로 세포 배양물의 증식을 증가시켰다. 흥미롭게도, 낮은 항-CD3 (50 ng/ml)에 대해서는, F45D9-γ1 mAb만이 증식 신호를 T 세포에 제공하나, 반응은 공여자 간에 달랐다. 또다른 항-Fas 블로킹 항체인 ZB4와 함께 인큐베이션시킨 세포는 항-CD3의 준최적 농도로 배양된 세포의 증식 반응에서 단지 약간의 증가를 나타냈다. 항-Fas mAb로서 APO-1-1에 대해, 관찰된 증식은 이소형 대조군의 경우보다 높지 않았다. F45D9-γ1 또는 CH-11 mAb가 가용성 형태로 코팅된 항-CD3 배양물에 첨가되는 경우, CH-11에 대해 이전에 보고된 바와 같이 [33], 증식 반응의 증가는 관찰되지 않았다. 따라서, F45D9-γ1 mAb를 사용하여 인간 T 세포의 증식에서의 공동-자극 신호를 매개할 수 있다.
실시예 12
항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)의 유도에 대한 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 MAB의 효과
PBMC 및 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 용해된 SKW6.4 세포로부터 51Cr의 방출을 정량하여 ADCC의 유도에서 F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 mAb의 효과를 평가하였다.
충분한 부피의 SKW6.4 세포를 대략 200 g에서 5 내지 8분 동안 원심분리한 후, RPMI1640 배지로 세척하였다. 상등액을 폐기하고, 여분의 배지의 첨가 없이 튜브를 탭핑하여 세포를 재현탁시키고, 최대 15분 동안 공기 중 5％ CO2에서 37±2℃에서 평형이 되도록 하였다. 51Cr을 세포에 첨가하여 106 개 세포 당 1.11 MBq의 활성을 제공하였고, 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 대략 15분마다 온화하게 진탕시킨 다음, 배지에서 3회 세척하여 과잉의 51Cr을 제거하였다. 세척된 세포를 ml 당 2 x 105 개 세포로 배지에 재현탁시켰다.
PBMC를 수득하기 위해, 인간 혈액을 EDTA 튜브에 채취하고, PBS 중 1/2로 희석한 다음 피콜(ficoll) 밀도 구배에 의해 PBMC를 단리하였다. 분리된 세포를 PBS로 2회 세척하고, ml 당 1 x 107 개 세포로 배지에 재현탁시켰다. 분석은 U-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 3회 반복 수행하였다. 표적 세포 현탁액 50 μl (1 x 104 개 세포)를 각각 다양한 농도 (1; 0.5; 0.25; 0.125; 0.06; 0.03; 0.015 및 0.008 μg/ml)의 5D9-γ1 또는 5D9-γ4 항체의 존재하에 각각의 웰에 첨가하였다. 표적 세포를 양성 대조군 항체 (리툭시맙) 또는 비-결합 IgG1 또는 IgG4 음성 대조군 항체 (20 ug/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 공기 중 5％ CO2의 습윤 분위기에서 37±2℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, PBMC를 50:1의 비로 첨가하였다 (50 μl, 1 x 107 개 세포/ml). 이어서, 배양물을 공기 중 5％ CO2의 습윤 분위기에서 37±2℃에서 추가 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 4시간의 인큐베이션 기간의 말기에, 분석 플레이트를 400 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 중 100 μl의 부피를 감마 계수를 위해 5 ml 바이알 안으로 서서히 제거하였다. 음성 대조군으로서 비-결합 항체를 사용하였고, 양성 대조군 항체로서 리툭시맙을 사용하였다. 표적 세포와 함께 인큐베이션시킨 PBMC를 사용하나 항체는 없는 추가 대조군 웰을 제조하여 비-항체 의존성 세포 용해물의 배경 수준을 측정하였고, 표적 세포 및 항체를 함유하나 PBMC는 없는 웰을 항체의 임의의 세포용해 효과에 대한 대조군으로서 제조하였다. SKW6.4 세포를 PBMC 없이 인큐베이션시켜 51Cr의 자연 방출 데이터를 얻었고, 1％ 트리톤 X-100을 사용하여 최대 방출량을 확립하였다.
결과를 (실험 방출량 - 배경 방출량 / 최대 방출량 - 배경 방출량) x 100의 특정 용해물의％로 표시하였다. 특정 용해물의％의 평균으로서 표시된 5개의 공여자로부터의 결과를 도 13에 나타내었다.
결과
6개의 공여자의 사용시, F45D9-γ4 mAb에 의해 매우 미미한 특정 용해물 유도가 입증되었다. 그러나, 모든 6개의 공여자에서 F45D9-γ1 mAb의 존재하는 경우 용해물의 용량-관련 증가가 관찰되었다. 용해물의 피크는 0.06 uM의 F45D9-γ1 mAb에 도달하는 것으로 발견되었다. 도 13에 제시된 결과는 5개의 공여자로부터의 특정 용해물의 평균을 나타낸다 (공여자 중 하나는 F45D9-γ1 mAb의 존재하에 미미한 반응을 나타내며, 이에 따라 평균 반응 플롯으로부터 제거됨).
본 발명자들은 표적 세포로서 SKW6.4 세포를 사용하여 F45D9-γ1 mAb가 용량-의존성 ADCC 효과를 유발한다는 것을 입증하였다. F45D9-γ4 mAb는 SKW6.4 세포의 ADCC를 거의 유발하지 않는다.
실시예 13
보체 의존성 세포독성 (CDC)의 유도에서의 F45D9-γ1 MAB의 효과
저캣 표적 세포로부터의 51Cr의 방출량을 사용한 분석에 의해 CDC의 유도에서 F45D9-γ1 mAb의 효과를 평가하였다. 저캣 세포 펠렛을 37℃에서 1시간 동안 1 x 106 개 세포 당 100 μCi의 51Cr (Na2 51CrO4 보존 10 mCi/ml, 아머샴(Amersham))로 표지하였다. 세포를 완전 배양 배지 (2 mM 글루타맥스, 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 5％ 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지)로 3회 세척한 후, 웰 당 50 ul의 다양한 농도의 5D9-γ1 또는 APO-1-3 (마우스 IgG3 항-인간 Fas, 알렉시스(Alexis), Cat. ALX-805-020-C100) 항체 (배지 중에 희석됨)로 미리 충전된 96-웰 U-바닥 플레이트 (코닝 인코포레이티드, 코스타)에 배지 100 μl 중 1 x 104 개 세포를 분배하였다. 분석의 양성 대조군으로서 APO-1-3 mAb를 사용하였다. 이어서, 1/25의 최종 희석으로의 웰 당 50 μl의 래빗 혈청 보체 (시그마 Cat. S-7764) 또는 배양 배지를 첨가하였다. 플레이트를 5％ CO2에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 수득한 각 상등액의 50 μl의 분취량에서 방사능을 측정하였다. 배지에서만 배양된 표지된 저캣 세포의 웰은 자연적 방출로서의 역할을 한다. 1％ 트윈-20 (시그마-알드리치, Cat. P1379) 100 μl로 세포를 용해시켜 최대 51Cr-방출량을 측정하였다. 모든 시험은 3회 반복하였다. 특정 용해물의 백분율은 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00001
결과
도 14로부터의 결과는 0.15 ug/ml 내지 20 ug/ml 범위의 농도에서 F45D9-γ1 mAb가 보체 의존성 세포독성을 유도하지 않음을 입증한다 (여기에서 10 ug/ml까지 제시됨). 이전에 기재된 바와 같이 (문헌 [Dhein, J., et al. J. Immunol., 149:3166-3173, 1992]), 양성 대조군으로서 사용된 APO-1-3 mAb는 CDC를 유도하며, 이는 0.04 ug/ml 내지 10 ug/ml 범위의 농도에서 래빗 혈청 보체의 부재하의 항체에 의해 유도되는 세포독성보다 2배 더 높았다.
실시예 14
1차 인간 간세포에서 F45D9-γ1 MAB의 시험관내 독성 시험
F45D9-γ1 mAb의 간독성 효과를 1차 인간 간세포 및 XTT 검정을 사용하여 시험관 내에서 시험하여 세포 생존율을 측정하였다. 1차 인간 간세포는 캠브렉스(Cambrex) (Cat. No. CC-2591)로부터 얻었다. 간세포를 150 ㎕/웰의 인간 표피 성장 인자 (hEGF)-재구성된 간세포 배양 배지 (HCM) (불러키트(Bullekit), 캠브렉스, Cat. No. CC-3198) 중 6 x 104 세포/웰로 유형 I의 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 (벡톤 디킨슨, Cat. 354407)에 분배하였다. 37℃에서 3시간 인큐베이션 후, 플레이트를 가온 배지로 세척하여 미부착된 세포를 제거하였다. 간세포를 37℃에서 7시간 동안 다양한 농도의 5D9-γ1 또는 마우스 항-Fas APO-1-3 mAbs를 함유하는 150 ㎕/웰의 EGF-재구성된 HCM으로 인큐베이션하였다. 마우스 항-Fas 항체 APO-1-3은 간독성을 유도하며 양성 대조군으로 사용되었다 (문헌 [Galle, P.R., et al., J.E.M 182:1223-1230, 1995]). 간세포의 생존율은 75 ㎕/웰의 XTT 시약을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, A492nm 내지 A690nm에서 흡광도를 판독하여, XTT 검정에 의해 측정하였다. 3회의 평균 및 SD를 계산하였다. 도 15에 도시된 결과는 항체가 없는 배지에서 세포가 배양되는 대조군의％로 나타내었다.
결과
F45D9-γ1 mAb가 0.1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 범위의 농도에서 간독성을 유발하지 않는다는 것이 증명되었다. 일찍이 기재된 바와 같이 (문헌 [Galle, P.R., et al., J.E.M 182:1223-1230, 1995]), 양성 대조군으로 사용되는 APO-1-3 mAb는 0.002 ㎍/㎖ 내지 0.2 ㎍/㎖ 범위의 농도에서 간독성이었다.
실시예 15
F45D9 mAb를 이용한 마모셋에서의 파일럿 독성 연구
이전 연구 결과는 마모셋이 F45D9-γ4의 안정성 및 생물학적 활성을 시험하기에 적합함을 나타낸다. 따라서, 커먼 마모셋 (칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus); 생물의학 영장류 연구 센터, 네덜란드 라이스윅 소재)에서 내약성 연구를 수행하였다. 연구의 제1 부분에서는, 용량 증가 연구에서 마모셋 원숭이 3마리에게 각각 0.05, 0.5 및 5 mg/kg의 5D9-γ1을 대략 2개월 기간에 걸쳐 (0일, 35일 및 70일에) 순차적으로 주사하였다 (i.v.). 마모셋 원숭이 1마리에게는 IVIG 조절 IgG (감마가드 S/D(Gammagard S/D), 벨기에 백스터 소재)와 동시에 각각의 용량으로 주사하였다. 혈액 채취 일정은 각 투약 주기에 대해 동일하였다. 혈액 샘플을 주사 3일 전, 주입 1시간 후 및 주사 후 1일 및 3일에 채취하였다. 임상 화학 및 혈액학을 이용하고 혈청을 약물 동태학 측정을 위해 저장하였다. 77일 또는 78일에 완전한 검시 및 병리학 시험을 위해 동물을 안락사시켰다. PBMC를 단리하고 저장하였다.
연구의 제2 부분에서는, 동물 3마리에 5 mg/kg 단일 용량의 이소형 IgG4 (5D9-γ4)의 F45D9를 주사하였다 (i.v.). 이전 연구에서와 동일한 혈액 채취 일정을 실행하고 7일 또는 8일에 완전한 검시 및 병리학 시험을 위해 동물을 안락사시켰다. PBMC를 또한 얻었다.
일반적인 안녕(well-being)을 매일 기록하고, 동물의 매 취급시 체중 및 체온을 기록하였다. 모든 임상 화학 분석을 코바스 인테그라(COBAS INTEGRA)-400+ (로슈(Roche), 네덜란드 알미르 소재) 상에서 실행하였고, 측정은 나트륨, 칼륨, 클로라이드, 칼슘, 이산화탄소, 포스페이트, 알칼리 포스파타제, 빌리루빈 총량, 감마 GT, ASAT (SGOT), ALAT (SGTP), LDH, 콜레스테롤, 총 단백질, 알부민, 글루코스, 크레아티닌, 우레아, 크레아틴 키나제 (CKL)를 포함하였다. 모든 혈액학 분석을 시스멕스(Sysmex) XT-2000i 상에서 수행하였고, 측정은 전체 백혈구 계수 및 차이, 적혈구 계수, 망상적혈구, 혈소판, 적혈구용적율, 헤모글로빈, 평균 세포 부피를 포함하였다. 완전한 병리학 시험을 부신, 대동맥, 뇌 (뇌간, 대뇌 및 소뇌), 맹장, 결장, 십이지장, 표피, 심장, 회장, 공장, 신장, 간, 폐, 림프절, 식도, 난소, 췌장, 귀밑 침샘, 뇌하수체, 전립선, 좌골 신경, 골격근 (넓적다리), 피부 (옆구리), 비장, 흉골 (골수 포함), 위, 침샘 (상악하 기관), 방광, 모든 육안 병변에 대해 실행하였다.
결과
F45D9-γ1 및 F45D9-γ4 투여는 동물을 일반적인 안녕에서 벗어나게 하지 않았다. 치료 기간 동안 투약-후 징후 또는 치료-관련 임상 징후는 없었다. 조기에 사망하는 동물은 없었다. 치료와 관련하여 혈액학 값 및 임상 화학에서 큰 편차는 관측할 수 없었다.
F45D9-γ1 투여는 간, 췌장, 십이지장, 비장, 림프절, 폐 및 신장에서 비정상적인 병리학적 소견을 유도하였다. 이러한 소견은 상기 기관의 감염을 포함한다. 가장 극심히 감염된 동물의 간에서, 출혈 및 담즙 울혈을 동반한 간세포성 괴사, 아팝토시스 및 변성이 관측되었고, 비장에서는 백색 속질 형성저하증을 동반한 림프구 아팝토시스 및 괴사가 관측되었고, 림프절에서는 림프구 아팝토시스 및 괴사를 동반한 모낭 증식이 관측되었다. F45D9-γ1로 처리한 다른 2마리의 동물에서는 병변은 유사하였지만 보다 덜 현저하였다.
F45D9-γ4 투여는 아팝토시스 또는 괴사를 유도하지 않았고 병리학적 소견은 온화하였다.
인간 항-Fas 항체 F45D9-γ4 mAb가 5 mg/kg 단일 투약 후 마모셋에서 독성을 나타내지 않은 사전 독물학 연구 결과에 기초하여, 4주 기간 동안 F45D9-γ4를 반복 투약하여 또다른 독성 연구를 수컷 커먼 마모셋에 대해 수행하였다. 수컷 커먼 마모셋 (칼리트릭스 자쿠스; 헌팅던 라이프 사이언스(Huntingdon Life Science), 영국 헌팅던 소재)에 1.5 또는 5 또는 15 mg/kg/4주 동안 매 7일마다 1회, 즉, 총 4회 (1, 8, 15 및 22일에 투약함)의 용량으로 F45D9-γ4 mAb을 정맥내 (볼루스) 투여하였다. 치료는 3군 (용량 당 1군)으로 수행하였고, 동물 3마리를 각 군에 배정하였다.
일반적인 안녕 및 체중을 주 2회 기록하였다. 임상 화학 및 혈액학 분석을 예비처리시 및 종결시 실시하였다. 29일에 완전한 검시 및 병리학 시험을 위해 동물을 안락사시켰다.
결과
F45D9-γ4의 반복적인 용량의 투여는 동물을 일반적인 안녕에서 벗어나게 하지 않았다. 치료 기간 동안 투약-후 징후 또는 치료-관련 임상 징후는 없었다. 조기에 사망하는 동물은 없었다.
치료 4주 후의 혈액학 조사는 치료 이전 값과 독물학적으로 유의한 차이를 드러내지 않았다. 임상 화학은 15 mg/kg의 F45D9-γ4를 이용한 치료 4주 후 동물 2마리에서 증가된 간 효소 (ASAT, ALAT, ALP 및 또한 빌리루빈)를 나타내었다.
수컷 커먼 마모셋에 F45D9-γ4 mAb를 4회, 주 1회 i.v. (볼루스) 투여하는 것은 15 mg/kg까지의 용량을 잘 견뎠다는 결론에 도달하였다.
본 연구 후, 1.5 또는 5 또는 15 또는 45 mg/kg의 F45D9-γ4 mAb의 단일 용량 투여를 사용하여 파일럿 약동학 및 수용체 수용력 연구를 실행하였다. 상기 연구는 또한 단일 45 mg/kg 용량 투여에 대한 내약성을 주요 목적으로 하였다. 치료는 4군 (용량 당 1군)으로 수행하였고, 수컷 동물 2마리를 각 군에 배정하였다. 5 mg/kg 용량 군에는, 또다른 암컷 동물 2마리를 배정하였다. 동물들을 22일에 안락사시켰다.
본 연구 결과는 치료 기간 동안 투약-후 징후 또는 치료-관련 임상 징후를 나타내지 않았다. 조기에 사망하는 동물은 없었다. 본 연구는 마모셋에서의 45 mg/kg의 단일 용량 투여를 잘 견뎠음을 증명하였다.
F45D9-γ4로의 치료와 관련된 것으로 간주되는 병리학적 소견은 없었다.
실시예 16
인간 이식-대-숙주 질환 (GVHD)의 피부 체외이식편 모델에서 인간 F45D9 항-Fas 항체의 효과
본 연구의 목적은, 뉴캐슬 대학의 앤 디킨슨 교수에 의해 개발된 확립된 피부 체외이식편 모델을 사용하여, GvH 반응 (GvHR)의 억제 및 또한 혼합 림프구 반응 (MLR)에서의 사이토카인 방출 및 피부 체외이식편 상등액에 대한 항-Fas 모노클로날 항체 F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4의 효과를 조사하는 것이었다. 피부 체외이식편에서의 GvHR과 임상 GvHD 등급 사이에 유의한 상관 관계가 나타났기 때문에, 이러한 피부 체외이식편 모델은 시험관내 GvHD를 모방하고 GvHD 결과를 예측한다 (문헌 [Sviland L. et al, 1990, Bone Marrow Transplant 5:105-109]; [Wang X.N. et al, 2006, Biol Blood Marrow Transplant 12:152-159]).
피부 체외이식편 검정은 임상 GvHD 등급의 시나리오 III 내지 IV를 시험하기 위해 완전한 미스매치 조건으로 설정하였다. HLA-매칭된 환자 및 공여자 쌍 및 피부를 사용하여 "보다 온화한" 설정을 또한 시험하였다. 본 피부 체외이식편 모델은 GvHD 반응의 제2 및 제3 단계, 즉, 공여자-동종특이성 T 세포의 활성화에 의한 환자 및 공여자 세포의 1차 관여, 및 GvHD의 표적 기관, 즉 피부에 대한 활성화된 공여자 T 세포의 효과를 연구하기 위한 독특한 검정이다.
피부 체외이식편 모델
피부 체외이식편 모델은 이미 상세히 기재되어 있고 (문헌 [Dickinson A.M. et al, 1988, Bone Marrow Transplant 3:323-329]; [Sviland L. et al, 1990, Bone Marrow Transplant 5:105-109]) 하기 개략 흐름도에 개괄되어 있다. 본 모델은 공여자-동종특이성 T 세포를 활성화하기 위한 1차 MLR, 이식-대-숙주 (GvH)-유형의 조직 손상을 유도하기 위한 활성화된 공여자 T 세포와 환자 피부의 공동배양, 및 동일계 피부 조직 손상 심각성의 조직병리학적 평가를 포함하는 3개의 주요 단계로 이루어진다. 간략하게, MLR은 환자 PBMC를 자극 세포로서 (20 Gy의 조사량) 및 동등한 수의 공여자 PBMC를 반응 세포로서 사용하여 GvH 방향으로 설정하였다. MLR 5일 내지 7일에, 환자로부터 표준 4 mm의 펀치 피부 생검 샘플을 얻었다. 과잉의 진피의 피부 생검 샘플을 자르고, 동일한 크기의 작은 단편으로 절개하고, MLR-프라이밍된 공여자 반응자 세포로 공동배양하였다. 배지 단독으로 배양된 피부 단편을 배경 대조군으로서 사용하였다. 공동 배양 3일 후, 피부 단편을 10％ 완충 포르말린에 고정시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 두 관찰자에 의해 피부 단편의 조직병리학적 평가를 블라인드로 수행하고, 독립적인 조직병리학자에 의해 확증하였다. 조직병리학적 변화의 중증도를 기초로 하여, 러너 (Lerner) 등급 시스템 (문헌 [Lerner, K.G. et al, 1974 Transplant Proc, 6:367-371])에 따라 피부 GvHR을 등급 I 내지 IV로 정의하였다. 모든 배경 대조군은 등급 I 이하의 피부 GvHR를 나타내었다. 등급 0 또는 I의 피부 GvHR을 음성으로 간주하고, 등급 II 이상의 피부 GvHR을 양성으로 간주하였다. HLA-미스매치 상황의 경우에, 자극자로서 자가 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 또는 성형 수술을 겪은 환자로부터의 PBMC 및 반응자로서 관련되지 않은 건강한 혈액 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 MLR을 설정하였다. 이어서, MLR-프라이밍된 세포를 해당 자극자로부터 취한 피부 단편으로 공동배양하였다.
피부 체외이식편 검정의 개요
MLR - HLA 미스매치 설비에서 또는 HLA 매치 환자 및 공여자 세포를 사용하여 MLR을 설정하였다. MLR 단독에서의 A (이어서 피부-1 실험에 첨가되지 않음) 또는 B (피부에 반응자 세포를 첨가할 때 MLR 후에) 또는 A+B (MLR의 개시시 및 피부에 반응자 세포를 첨가할 때)에서 F45D9 또는 대조군 항체를 첨가하였다.
1x107 수용자 세포 X 1x107 보통 실험실 공여자 세포
± 시험될 항체 (대조군 또는 F45D9 항체)-A
7 일 배양
제7일에 환자 피부에 반응자 세포 첨가
환자로부터의 4 mm 펀치 생검
B - 3일 공동 배양 ± 시험될 항체 (대조군 또는 F45D9 항체)
일상적인 조직병리학
GvHR 판독 - 등급 I- IV
GvHR에 대한 영향을 시험하는데 사용된 항체는 F45D9-γ1 (시험한 농도는 0.15; 1.5; 5 및 15 μg/ml이었음), 또는 F45D9-γ4 (시험한 농도는 1.5 및 15 μg/ml이었음) 또는 이들의 각각의 음성 대조군 항체: 인간 IgG1 카파 (시그마로부터, Cat. I5154) 또는 인간 IgG4 카파 (시그마로부터, Cat. I4639)였다. MLR의 개시시 (이어서 피부에 첨가되지 않음) 또는 피부에 반응자 세포를 첨가할 때 MLR 후에, 또는 이들 두 단계 모두에서 F45D9 또는 대조군 항체를 첨가하였다. GvHR에서의 F45D9-γ4 mAb의 영향은 단지 HLA-미스매치 설비에서 연구하였다.
결과
HLA 미스매치 및 매치 조건 모두에서 수행된 30 실험의 총량으로부터, 26 실험은 양성 GvHR (F45D9-γ1 연구 중 21의 17 및 F45D9-γ4 연구 중 9의 9)을 나타내었다. F45D9-γ1 또는 F45D9-γ4 mAb 항체의 영향에 대한 결과는 이들 실험을 기준으로 하였다.
연구 결과는 하기 지시를 제공하였다.
47％ 양성 효과를 나타내는 8/17 양성적으로 평가된 샘플에서 반응의 제1 및/또는 제2 단계 (활성화 세포가 피부에 배양되는 경우, MLR 시작시 및 MLR 후)에서 HLA-매치 및 HLA-미스매치 반응자 유도 피부 GvHR에서 F45D9-γ1은 피부 GvHR을 하향조절하는 것으로 보였다.
MLR 및 피부 체외이식편 모두 또는 단지 피부 체외이식편에 첨가된 항체가 있는 HLA-미스매치 설비에서, F45D9-γ1은 50％ 양성 효과를 나타내는 7/14 양성적으로 평가된 샘플에서 GvHR을 하향조절하는 것으로 보였다. 도 16a는 MLR 및 피부 체외이식편 벽에 항체를 첨가한 HLA-미스매치 설비를 사용한 6 실험 외에 3 실험에서 GvHR을 하향조절하는 F45D9-γ1의 영향을 나타내었다. 도 16b는 단지 피부 체외이식편 상에 항체를 첨가한 미스매치 설비에서 III에서 II (0.15 μg/ml) 및 III에서 I (1.5 μg/ml)의 GvHR의 하향조절하는 F45D9-γ1의 영향을 나타내었다.
MLR 또는 및 피부 상등액에서 F45D9-γ1의 존재는, 각각 용량 의존적 방식으로 IL-10 생성을 상향조절하고, Il-2 생성을 하향조절하는 경향이 있었다. MLR 상등액으로부터의 결과를 도 16c 및 도 16d에 나타내었다.
HLA-미스매치 설비에서 MLR 및 피부 체외이식편 모두에 첨가된 F45D9-γ4는 44％ 양성 효과를 나타내는 4/9 양성적으로 평가된 샘플에서 GvHR을 하향조절하는 것으로 보였다. 농도 의존도는 F45D9-γ4 1.5 μg/mL와 비교해서 15 μg/ml에서 보다 큰 효과를 나타내었다. 도 16e는 MLR 및 피부 체외이식편 벽에 항체를 첨가하는 HLA-미스매치 설비를 사용한 9 실험 외에 4 실험에서 GvHR을 하향조절하는 F45D9-γ4의 영향을 나타내었다.
피부 체외이식편에 단지 항체가 첨가되는 경우, F45D9-γ4는 단지 1/9 실험에서 GvHR를 다소 차단하였다.
F45D9 mAb는 임상적으로 전조가 되는 절편 분석에서 GvHR을 억제하는 것으로 나타났다. 실험은 F45D9가 임의로는 다른 예방 요법과 함께 사용하여 GvHD를 방지하였고 (즉, MLR의 시작시 항체를 첨가함으로써 나타나는 바와 같음), 또한 GvHD를 치료학적으로 감소시킬 수 있었음 (세포가 활성화되는 경우, MLR 후 항체를 첨가함으로써 나타나는 바와 같음)을 나타냈다.
GvHD는 공여자 T 세포에 의해 야기되는 병리학적 손상 및 사이토카인에 의한 그 이후의 손상을 포함한다. IL-2는 증식 및 확장을 돕는 T 세포에 의해 생성되는 주요 초기 사이토카인 중 하나이다; IL-10은 IL-2, TNFα 및 IFNγ의 영향을 하향조절한다. 본 발명자들의 결과에서 나타난 바와 같이 F45D9에 의해 유도된 사이토카인 조절, 특별히 IL-2의 하향조절 및 IL-10의 상향조절은 F45D9 항체가 GvHD에서 병적 손상을 감소시키는 방법에 관한 것일 것이다.
실시예 17
시험관내 인간세포독성 T 세포 ( CTL ) 활성에 대한 F45D9-γ4 mAB 의 영향
급성 GVHD의 이펙터 상에서 포함되는 주요 메카니즘 중 하나는 활성화된 공여자 T 세포 (CTL)에 의한 숙주 표적 세포의 직접 세포 매개 세포독성이다. Fas/FasL은 이들의 표적을 사멸시키는 이들 T 세포 (및 다른 세포용해 세포)를 사용하는 세포용해 메카니즘 중 하나였다.
이러한 연구의 목적은 표적 세포의 특이적 T 세포 세포독성 활성을 차단하는 F45D9-γ4의 용량 의존적 능력을 조사하는데 있었다. 이를 위해, 본 발명자들은 표적 세포로서 닥터. 빅터 레비트스키 (Dr. Victor Levitsky) (미국 볼티모어 소재 존스 홉킨스 스쿨 오브 메디신 (Johns Hopkins School of Medicine)으로부터)로부터 수득된 동종이형 폴리클로날 HLA-A2-제한 T 세포주 및 HLA-유형 EBV 형질전환된 림프아구양 세포주 (LCL)를 사용하였다.
효과 및 표적의 16 시간 배양 후 10:1 또는 5:1의 비로 표적 세포 (HLA-A2 양성 EBV EBNA-4-발현 림프아구양 세포주 BK-B5)로부터의 51Cr 방출을 사용하여 동종이형 CTL에 의해 표적 세포의 사멸을 차단하는 F45D9-γ4 항체의 능력을 조사하였다. 이펙터 세포 중 하나 (Ates B)는 전사에서 조기 정지를 야기하고, 기능적 퍼포린 단백질이 없는 퍼포린 유전자에서 유전학적 돌연변이가 있는 환자로부터 유발된다. 따라서, Ates B는 퍼포린 의존성 방식으로 표적 세포를 사멸시킬 수 없었다. 별법으로, 건강한 공여자 (310905/Mon-B1)로부터 유도된 동종 T 클론에서 퍼포린 매개 세포용해를 차단하는데 코카나마이신 A (CMA; 시그마, Cat. C9705)를 사용하였다. 실험에서, F45D9 F(ab')2 단편, 항-FasL 마우스 모노클로날 항체 NOK-2 (BD 바이오사이언씨스, Cat. 556375), 및 이소형 인간 IgG4 카파 대조군 항체 (시그마, Cat. I4639)를 또한 사용하였다.
결과
도 17a는 0.1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 농도에서 용량 의존적 방식으로 F45D9-γ4 mAb가 HLA-A2 발현 LCL BK-B5의 Ates B 사멸을 효과적으로 차단하였음을 나타낸다. 10 μg/ml의 농도에서 사멸의 평균 50％가 차단될 수 있었다. 유사한 결과를 F45D9 F(ab)2 단편에서 발견하였으나, 이소형 대조군에서는 이와 유사하지 않았다.
도 17b는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 농도에서 용량 의존적 방식으로 F45D9-γ4 mAb가 BK-B5 표적의 건강한 공여자 (310905/Mon-B1)로부터 CMA 처리된 동종이형 T 세포 클론에 의해 매개 세포용해를 또한 차단하였음을 나타낸다. 10 μg/ml의 농도에서 사멸의 평균 40％가 차단될 수 있었다.
F45D9-γ4 mAb는 항-FasL 마우스 모노클로날 항체 NOK-2에 비해 T 세포 세포용해의 차단에서 보다 효과적인 것으로 나타났다 (이펙터 CTL로서 Ates B를 사용한 도 17a 및 도 17c 및 310905/Mon-B1를 사용한 도 17b).
F45D9-γ4 mAb는 또한 BK-B5 표적 세포의 Ates B 사멸의 차단에서 가용성 단량체 Fas과 비교할 경우, 몰 기준으로 보다 우수하였다 (도 17c).
동종이형 CTL을 사용한 이러한 결과는 F45D9 mAb가 있는 GVHD의 이펙터 상에서 FasL/Fas을 억제하기 위한 이론을 지지하였다.
면역화 프로토콜
나타낸 일자는 면역화 일자이다 (연-월-일)
rFas (프리프로테크 (PreproTech)
마우스 18
(제2 배치 마우스)		 마우스 3
(제3 배치 마우스)
일련번호 일자 면역원 일련번호 일자 면역원
제1 03-07-25 전체 저캣 세포 + 10 μg rFas 제1 03-10-09 20 μg rFas + 아쥬반트
제2 03-08-05 전체 저캣 세포 + 10 μg rFas 제2 03-10-21 10 μg rFas + 아쥬반트
제3 03-08-12 전체 저캣 세포 + 10 μg rFas 제3 03-10-30 10 μg rFas + 10 μg FP5,8,9,11,18 + 아쥬반트
제4 03-08-21 5 μg rFas + 10 μg FP5,8,9,11,18 + 아쥬반트 제4 03-11-06 10 μg rFas + 아쥬반트
제5 03-08-28 5 μg rFas + 10 μg FP5,8,9,11,18 + 아쥬반트 제5 03-11-13 10 μg rFas + 10 μg FP11,18 + 아쥬반트
제6 03-10-30 10 μg rFas + 10 μg FP5,8,9,11,18 + 아쥬반트 - 없음 -
제7 03-11-13 10 μg rFas + 10 μg FP11,18+아쥬반트 - 없음 -
부스트-1 03-12-03 rFas + FP5,8,9,11,18 부스트-1 03-12-03 rFas + FP5,8,9,11,18
부스트-2 03-12-09 rFas + FP5,8,9,11,18 부스트-2 03-12-09 rFas + FP5,8,9,11,18
부스트-3 03-12-12 rFas + FP5,8,9,11,18 부스트-3 03-12-12 rFas + FP5,8,9,11,18
인간 이외의 영장류 세포에 대한 F45D9의 반응성
항체 인간 이외의 영장류
붉은털 원숭이 사이노몰구스 원숭이 올리브 개코원숭이 침팬지 마모셋
B 세포주 PBL 활성화 T 세포 B 세포주 PBL B 세포주 B 세포주 B 세포주 PBMC
마우스 항-인간 CD95 (클론 DX2) + + + + + + + + +
F45D9 - - - - - - + + +
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> IMED AB Osorio, Lyda Ruan, Maorong Chiodi, Francesca Ekre, Hans-Peter <120> Human Antibodies Against Human FAS and Their Use <130> SMW/FP6685143 <140> PCT/EP2010/001470 <141> 2010-03-10 <150> US 61/159762 <151> 2009-03-12 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence: F45D9 VH encoding nucleotide sequence <400> 1 caggtgcagc tgcagcagtg gggagccggc ctgctgaagc cctctgagac actgagcctg 60 atctgcgctg tgtacggcgg atctttcagc acctactact ggacctggat taggcagccc 120 ccaggcaagg gcctggaatg gatcggcgag atcaaccaca ggggcaccac caactacagc 180 cccagcctga agagcagagt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca catcagcctg 240 aacctgacca gcgtgacagc cgccgacacc gccctgtact actgcgcccg cggactgctg 300 tggattgggg agggcgacta cggcctggac gtgtggggac agggcaccac cgtgaccgtg 360 tccagc 366 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence: F45D9 VH amino acid sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 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Claims (40)

  1. VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인, 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하며, 여기서 VH CDR3은 서열 7의 VH CDR3이며, 임의로 VH CDR1은 서열 5의 VH CDR1이고/거나, VH CDR2은 서열 6의 VH CDR2인, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소.
  2. 제1항에 있어서, VH 도메인이 서열 5의 VH CDR1, 서열 6의 VH CDR2 및 서열 7의 VH CDR3을 포함하는 것인 결합 요소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 2의 VH 도메인을 포함하는 결합 요소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 8의 VL CDR1, 서열 9의 VL CDR2 및 서열 10의 VL CDR3을 포함하는 것인 결합 요소.
  5. 제4항에 있어서, 서열 4의 VL 도메인을 포함하는 결합 요소.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 2의 VH 도메인 및 서열 4의 VL 도메인에 의해 형성된 인간 Fas 항원 결합 부위의 친화도와 동일하거나 또는 보다 큰 친화도로 인간 Fas에 결합하며, 결합 요소의 친화도 및 항원 결합 부위의 친화도는 동일한 조건 하에서 측정되는 것인 결합 요소.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fas-매개 아팝토시스 (apoptosis)를 억제하는 결합 요소.
  8. 제7항에 있어서, 서열 2의 VH 도메인 및 서열 4의 VL 도메인에 의해 형성된 Fas 항원 결합 부위의 효력과 동일하거나 또는 보다 큰 효력으로 인간 Fas-매개 아팝토시스를 억제하며, 결합 요소의 효력 및 항원 결합 부위의 효력은 동일한 조건 하에서 측정되는 것인 결합 요소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 T 세포의 증식에서 항-CD3 항체와의 공동-자극 신호를 매개하는 결합 요소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 의존성 세포독성을 유발하지 않는 결합 요소.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 GVHD의 실험적 피부 체외이식편 모델로부터의 피부 조직 절편에서 GVHR을 억제하는 결합 요소.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 인간 간세포에서의 간독성을 유발하지 않는 결합 요소.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체 분자를 포함하는 결합 요소.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는 결합 요소.
  15. 제14항에 있어서, 항체 불변 영역이 IgG4 이소형의 영역인 결합 요소.
  16. 제15항에 있어서, IgG4 이소형의 항체 불변 영역이 돌연변이 S228P를 갖는 것인 결합 요소.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 항체를 포함하는 결합 요소.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 요소 또는 결합 요소의 항체 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  19. 제18항에 따른 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
  20. 제19항에 따른 숙주 세포를 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생성을 위한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 단리하고/거나 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 결합 요소 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화화는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 서열 2의 VH 도메인의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 통해, 각각이 서열 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VH 도메인을 제공하고, 임의로 이에 따라 제공된 하나 이상의 VH 도메인 아미노산 서열 변이체를 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합물을 제공하는 단계; 및/또는
    서열 4의 VL 도메인의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 통해 서열 4의 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VL 도메인을 제공하고, 이에 따라 제공된 하나 이상의 VL 도메인 아미노산 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 도메인 조합물을 제공하는 단계; 및
    인간 Fas에 결합하는 결합 요소의 확인을 위해 VH 도메인 아미노산 서열 변이체 또는 VH/VL 조합물(들)을 시험하는 단계
    를 포함하는, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소를 얻는 방법.
  24. 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 하나 이상의 VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산을 제공하고, 상기 출발 핵산을 서열 7의 VH CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 공여체 핵산과 조합하여, 상기 공여체 핵산을 출발 핵산에서의 CDR3 영역에 삽입하여 VH 도메인을 코딩하는 생성물 핵산을 제공하는 단계; 또는
    대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 하나 이상의 VL 도메인을 코딩하는 출발 핵산을 제공하고, 상기 출발 핵산을 서열 10의 VL CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 공여체 핵산과 조합하여, 상기 공여체 핵산을 출발 핵산에서의 CDR3 영역에 삽입하여 VL 도메인을 코딩하는 생성물 핵산을 제공하는 단계;
    VH 도메인을 코딩하는 상기 생성물 핵산의 핵산을 발현하고, 임의로 이에 따라 생성된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 VH/VL 조합물을 제공하고/거나, 상기 VL 도메인을 코딩하는 생성물 핵산의 핵산을 발현하고 이에 따라 생성된 VL 도메인을 하나 이상의 VH 도메인과 조합하여 VH/VL 조합물을 제공하는 단계;
    인간 Fas에 결합하는 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물을 포함하는 결합 요소를 선택하는 단계; 및
    인간 Fas에 결합하는 상기 결합 요소, 및/또는 인간 Fas에 결합하는 결합 요소를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 인간 Fas에 결합한 결합 요소를 얻는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소를 인간 Fas-매개 아팝토시스를 억제하는 능력에 대하여 시험하는 단계를 더 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 인간 Fas에 결합하며 인간 Fas-매개 아팝토시스를 억제하는 결합 요소를 얻는 것인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소가 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 항체 단편이 scFv 항체 분자인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 항체 단편이 Fab 항체 분자인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 전체 항체에서의 항체 단편의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제공하는 단계를 더 포함하는 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소 또는 인간 Fas에 결합하는 결합 요소의 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fas에 결합하는 결합 요소를 Fas 또는 Fas의 단편에 결합시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  33. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 인간 Fas에 결합하는 결합 요소를 Fas 또는 Fas의 단편에 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 결합이 시험관내에서 발생하는 것인 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 요소의 Fas 또는 Fas의 단편에의 결합의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, (1) GVHD; (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 또는 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체; (3) 스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 또는 독성 표피 괴사용해 (TEN); (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)에 대한 치료로서의 섬 이식; (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 장 또는 뇌에서의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예컨대 졸중; 수술 또는 이식과 관련된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환; 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 관련된 허혈성 재관류 손상; (6) 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 심부전, 허혈성 재관류 손상; (7) 신장 질환, 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상, 급성 신부전; (8) 신경계 장애 및 손상, 뇌 또는 척수 손상, 졸중; 및 (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 환자의 치료용 의약의 제조에서 결합 요소의 사용을 더 포함하는 방법.
  37. (1) GVHD; (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 또는 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체; (3) 스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 또는 독성 표피 괴사용해 (TEN); (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)에 대한 치료로서의 섬 이식; (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 장 또는 뇌에서의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예컨대 졸중; 수술 또는 이식과 관련된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환; 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 관련된 허혈성 재관류 손상; (6) 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 심부전, 허혈성 재관류 손상; (7) 신장 질환, 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상, 급성 신부전; (8) 신경계 장애 및 손상, 뇌 또는 척수 손상, 졸중; 및 (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 환자의 치료용 의약의 제조에서의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 요소의 용도.
  38. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동물 신체의 치료적 처치 방법에서 사용하기 위한 결합 요소.
  39. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 결합 요소를 투여하는 단계를 포함하는, (1) GVHD; (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 또는 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체; (3) 스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 또는 독성 표피 괴사용해 (TEN); (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)에 대한 치료로서의 섬 이식; (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 장 또는 뇌에서의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예컨대 졸중; 수술 또는 이식과 관련된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환; 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 관련된 허혈성 재관류 손상; (6) 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 심부전, 허혈성 재관류 손상; (7) 신장 질환, 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상, 급성 신부전; (8) 신경계 장애 및 손상, 뇌 또는 척수 손상, 졸중; 및 (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 환자의 치료 방법에서 사용하기 위한 결합 요소.
  40. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 요소를 질환 또는 장애를 갖거나, 질환 또는 장애의 발병 위험성이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, (1) GVHD; (2) HIV-감염된 개체, 예를 들어 감소된 CD4 T 세포 및 낮은 바이러스 로드를 갖는 치료되지 않은 HIV-감염된 개체, 또는 바이러스 로드는 조절되었지만 CD4 T 세포 수는 회복되지 않은 항-바이러스 치료된 HIV-감염된 개체; (3) 스티븐스-존슨 증후군 (SJS) 또는 독성 표피 괴사용해 (TEN); (4) 인슐린-의존성 당뇨병 (자가면역 당뇨병)에 대한 치료로서의 섬 이식; (5) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 장 또는 뇌에서의 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환, 예컨대 졸중; 수술 또는 이식과 관련된 허혈성 재관류 손상에 근거한 질환; 혈전용해 요법 또는 혈관성형술과 관련된 허혈성 재관류 손상; (6) 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 심부전, 허혈성 재관류 손상; (7) 신장 질환, 신부전; 신장 허혈; 허혈성 재관류 손상, 급성 신부전; (8) 신경계 장애 및 손상, 뇌 또는 척수 손상, 졸중; 및 (9) 세포독성 항신생물 요법과 관련된 암 환자에서의 림프구 고갈로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 환자를 치료하는 방법.
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