具体实施方式
实施例1:菌株的筛选
将中高温大曲(取自安徽双轮就业有限责任公司)研磨成粉状,准确称取25g加入到含有200ml的无菌生理盐水的锥形瓶中。加入灭菌的玻璃珠放入摇床(180r/min)室温下震荡打散30min后取出静置30min。取1mL上清液并加入9mL无菌生理盐水,配制成体积浓度为10- 1的菌悬液。依次类推, 配制成体积浓度为10- 3、10- 4 ……10-7 的菌悬液,均匀涂布于已隔夜冷却的分离培养基(分离培养基的制备方法为:将牛肉膏3g/ L,蛋白胨10g/ L,NaCl 5g/ L,琼脂条20 g/ L,水1000mL,制霉菌素0.01g/ L混合,调pH至7.0,121℃,灭菌20min。)平板上,将接种好的平板置于37℃恒温培养箱中培养48h。将所有菌落不同的菌株挑出并纯化至纯种,4℃冰箱斜面保存。
实施例2:菌株的发酵
一、菌株的发酵
从斜面上挑取菌株到种子培养基(种子培养基的制备方法为:将牛肉膏20.0 g,葡萄糖20.0g,K2HPO41.0 g,( NH4) 2SO41.0 g, MgSO4·7H2O 1.0 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g混匀,加蒸馏水调节至1L,调pH 至7.0,121℃,灭菌20min。)中培养至对数期,将用种子培养基培养到对数期的菌株,按5%接种量加入到发酵培养基(发酵培养基的制备方法为:将牛肉膏20.0 g,葡萄糖20.0 g,K2HPO41.0 g,( NH4) 2SO41.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g混匀,加蒸馏水调节至1L,调pH 至7.0,121℃,灭菌20min。)中,然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液以备检测。
二、发酵培养基中葡萄糖含量对乙偶姻产量的影响实验如下:
从斜面上挑取菌株到种子培养基(配方同上)中培养至对数期,将用种子培养基培养到对数期的菌株,按5%接种量加入到含有不同浓度葡萄糖的发酵培养基中(除葡萄糖外其它成分配方同上),其中葡萄糖浓度分别为10 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L,然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液以备检测。由图5可知,在葡萄糖浓度为40g/L时乙偶姻含量最高为15.71g/L。
实施例3:乙偶姻的检测
气相色谱检测条件:将实施例2得到的各个不同菌株的发酵液分别稀释5倍,之后分别取2μL进样进行气相色谱分析,来检测乙偶姻的产量。经检测,乙偶姻产量最高的为15.71g/L。
气相色谱参数:白酒专用色谱柱CP-Wax 57 C 、内径:250.00μm、长度:50.0 m、液膜厚度:0.20μm、死时间:2.983 min、柱温:60℃保持5min,5℃/min程序升温至140℃保持2min、进样口温度:150℃、检测器温度:160℃、载气:N2、柱前压90kPa、尾吹:30mL/min、分流比:1:30、空气:50kPa 、氢气:50kPa。
实施例4:菌株的鉴定
选择实施例3中乙偶姻产量最高的菌株(即产量为15.71g/L的菌株),其平板菌落照片、革兰氏染色照片和芽孢染色照片分别参见图1至图3。以其基因组为模板,利用细菌的16S rDNA的通用引物(16S27f与16S1492r)进行PCR扩增。将扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA分离,该菌株的PCR扩增产物出现一条亮带,其分子量大小为1500bp左右。见图4。将扩增结果送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序,测序结果见序列表中序列1。将上述序列通过blast 程序与Genbank中核苷酸数据库进行对比,发现其与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain) 的16Sr DNA序列相似度为99%。
将其于2013年4月18日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为:CGMCC No.7485。
从文献报道中可以看出(李树波等,微生物生产3-羟基丁酮研究进展[J],生物加工过程,2011:9(6);王萌,产乙偶姻枯草芽孢杆菌代谢工程改造的初步研究[D],天津大学,2012.6;尹明浩,高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的选育[D],青岛大学,2011.5),大部分已报道的乙偶姻产生菌(有的菌株是已经过条件优化或育种改造的)的生产能力低于或相当于本发明的甲基营养型芽孢杆菌CGMCC No.7485。本发明中的甲基营养型芽孢杆菌CGMCC No.7485除了对葡萄糖浓度已进行初步优化外,其他培养条件及培养基组成都是芽孢杆菌常用选择,也尚未经过育种改造。由此可以推断,本发明的甲基营养型芽孢杆菌经过进一步的育种改造及条件优化后,乙偶姻产量将会得到进一步提高,因此,本发明的甲基营养型芽孢杆菌具有广阔的应用前景。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽工程大学
<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 甲基营养型芽孢杆菌
<400> 1
gcggagtctg ctgacatatc tgtcacgtcg tagcgagaca gatgggagct tgctccctga 60
tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180
ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360
tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420
gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540
gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600
gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720
gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260
caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aactagaagg agccagcgcg 1440
ctatatagag acaaccccg 1459
<110> 安徽工程大学
<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 甲基营养型芽孢杆菌
<400> 1
gcggagtctg ctgacatatc tgtcacgtcg tagcgagaca gatgggagct tgctccctga 60
tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180
ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
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caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
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