CN104017086A - 一种融合抗菌肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种融合抗菌肽及其制备方法。本发明将猪抗菌肽(PAMP37)和牛的抗菌肽(Indolicidin)串联构建了一种融合抗菌肽。并且利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了所述融合抗菌肽的DNA序列，并将其构建到表达载体中，随后进行了融合抗菌肽的表达及纯化，抗菌活性结果显示，所得到的融合抗菌肽抗菌活性大大提高。本发明为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，对有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的技术领域，具体为一种融合抗菌肽及其制备方法。
背景技术
饲粮中长期或高剂量添加抗生素导致抗生素在畜产品中残留，引起食品安全隐患，还会诱导耐药性细菌的产生，使动物体内肠道菌群紊乱，动物自身免疫功能下降，抵抗力降低等。
抗菌肽(Antibacterial Peptides)，又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(Host Defense Peptides)，是机体先天免疫的重要组成成分，是许多生物体抵抗外来致病菌侵袭的第一道屏障。由于其独特且多样的生物学功能和作用机制引起了科学界的广泛关注和研究，一方面研究抗菌肽在先天免疫中发挥作用的生物学基础，一方面将其作为设计新型抗菌、抗感染制剂的分子模板。抗菌肽是自然进化的产物，和微生物一起已经存在了亿万年，尽管经过长期的共同进化，但抗菌肽并没有丢失其杀灭或抑制微生物的能力，或产生使微生物逃逸抗菌肽的能力，所以说抗菌肽是研发新型高效抗生素替代品的重要突破。
螺旋抗菌肽是分布最广泛的抗菌肽，大概占所有已知二级结构抗菌肽的27％。当形成α螺旋结构时通常亲水性残基和疏水性残基分别位于螺旋的两侧，因此呈现结构依赖性的两亲结构。螺旋抗菌肽在水相中一般不具有明显的结构特征，但在富含脂类的细胞膜环境下形成典型的α螺旋结构。在C端和N端的“帽子”结构使得α螺旋抗菌肽更加稳定，且不易受电解质浓度的影响。此类抗菌肽主要通过破坏细菌细胞膜发挥杀菌作用，导致膜上电解质或其他信号物质的逐级降解等。
抗菌肽市场应用广泛：在农业上，可用于饲料添加剂，并且适合各种动物的饲养；医药上，可以作为优秀的抗菌素替代品，也被认为是将来能克服癌症、艾滋病很有希望的药物；工业上，可以作为绿色防腐剂；人类生活上，可作为保健品与抗菌物的替代品。并且，随着生物工程方法的不断完善，抗菌肽的提取工艺的改进，转基因技术的进一步发展，使用工程细菌或酵母菌进行抗菌肽的大量生产，抗菌肽的实际应用范围将进一步扩大，在人们的日常生活中发挥着十分重要的作用。
然而，现有的研究表明，许多天然的抗菌肽活性并不高，或者对真核细胞存在较高的细胞毒性，因此在作为新型抗生素替代品研制之前需要通过分子改良进一步提高其活性，或降低其毒性。此外，细菌感染已经成为影响畜牧业生产的一个重要原因，尤其是耐药菌株的出现，更是增加了疾病的治疗难度。因此，在目前抗菌肽的研究中迫切需要改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子用以创造高活力抗菌肽。
本发明创造性的将猪的抗菌肽和牛中性粒细胞的抗菌肽进行了融合。猪的PAMP37是含有37个氨基酸残基的抗菌多肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成α螺旋结构，利用该结构可以在细菌细胞膜上形成穿孔，因此对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有显著杀伤作用。indolicidin是来源于牛中性粒细胞的抗菌多肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很强的杀菌活性。其氨基酸序列为包含含有5个色氨酸的13个氨基酸的多肽，其C端是酰胺化的。抑菌活性实验结果显示，融合的抗菌肽较单独的抗菌肽抗菌活性显著提高。
本研究通过分子改良进一步获得高抗菌活性的融合抗菌肽，为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，这对研发新型抗菌免疫制剂，有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽。所述融合抗菌肽包含猪抗菌肽和牛抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽包含猪抗菌肽PAMP37和牛抗菌肽(Indolicidin)。
更进一步的，所述融合抗菌肽是将猪抗菌肽(PAMP37)和牛抗菌肽(Indolicidin)串联一起得到的。
更近一步的，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQ ID1。
本发明的目的是提供一种融合抗菌肽的重组DNA，所述的重组DNA是经过密码子优化、适合在大肠杆菌表达融合抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽的重组DNA序列为序列表中SEQ ID2。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的载体。优选使用pET30a载体表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的细胞系。优选使用大肠杆菌BL21表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种新型抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有上述的融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法。
进一步的，所述融合抗菌肽的制备方法包括：
5)将包含猪抗菌肽和牛抗菌肽的多肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
6)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；
7)将重组DNA序列构建到表达载体上；
8)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。
更进一步的，所述猪抗菌肽为PAMP37，所述牛抗菌肽为Indolicidin。
更进一步的，设计的融合抗菌肽可通过合成或多重PCR等方法获得。优选进行多重PCR引物所采用的序列选自序列表中SEQ ID4、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7中的一条或几条。
更进一步的，将重组DNA通过酶切链接或同源重组等方式连接到表达载体上。
更进一步的，对表达的融合抗菌肽进行纯化。
本发明的目的是提供融合抗菌肽、能够表达融合抗菌肽的载体以及含有融合抗菌肽的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
本发明的优点：
1)本发明创造性的将猪抗菌肽PAMP37和牛的抗菌肽(Indolicidin)进行多肽串联，获得了具有高抗菌活性的融合抗菌肽，所述融合抗菌肽为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，这对研发新型抗菌免疫制剂，有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义；
2)本发明提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法，采用该制备方法可以高效获得融合抗菌肽。
附图说明
图1为重组表达载体的构建过程
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1抗菌肽的结构设计和预测
为了增强抗菌肽的杀菌活性，将猪抗菌肽(PAMP37)和牛的抗菌肽(Indolicidin)串联一起进行构建，得到的融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID1：GLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQSILPWKWPWWPWWRR。
利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了该序列的重组DNA序列(SEQ ID2)，经二级结构预测得到该多肽N端为一个α螺旋，C端为线性结构。
实施例2抗菌肽表达载体的构建
1)优化DNA序列使其适应于大肠杆菌的密码子偏爱性，增加载体构建所用的酶切位点，设计融合多肽DNA序列(SEQ ID3)如下：
GACGACGACGACAAGGCCGGTCTGCTGTCTCGTCTGCGTGACTTCCTGTCTGACCGTGGTCGTCGTCTGGGTGAAAAAATCGAACGTATCGGTCAGAAAATCAAAGACCTGTCTGAATTCTTCCAGTCTATCCTGCCGTGGAAATGGCCGTGGTGGCCGTGGTGGCGTCGTTAA
黑色下划线的序列为酶切位点(KpnI和XhoI)。
将DNA序列分别合成多条引物，利用重叠PCR的方法，将多条引物扩增拼接成完整的DNA序列。合成的引物序列见表1：
表1.合成引物的具体序列
| 引物编号 | 序列 |
| P1-SEQ ID4 | 5’-agggtaccgacgacgacgacaaggccggtctgctgtctcgtctgcgtgacttcctgtctg-3’ |
| P2-SEQ ID5 | 5’-gaccgatacgttcgattttttcacccagacgacgaccacggtcagacaggaagtcac-3’ |
| P3-SEQ ID6 | 5’-atcgaacgtatcggtcagaaaatcaaagacctgtctgaattcttccagtctatcctg-3’ |
| P4-SEQ ID7 | 5’-gtctcgagttaacgacgccaccacggccaccacggccatttccacggcaggatagactgg-3’ |
2)重叠PCR扩增目的DNA序列
分别利用P1和P2及P3和P4进行融合蛋白部分序列(FP1和FP2)的扩增合成。
反应体系(总体积每管50微升)为2×Pfu聚合酶反应液：25微升，引物1：1微升；引物2：1微升；去离子水：23微升。扩增条件均为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。
纯化回收各自扩增产物，进行第二步的扩增。
反应体系(总体积每管50微升)为2×Pfu聚合酶反应液：25微升，FP1回收产物：1微升；FP2回收产物：1微升；引物P1：1微升；引物P4：1微升；去离子水：21微升。扩增条件均为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。琼脂凝胶电泳鉴定PCR产物，并切胶回收DNA片段。
3)抗菌肽表达载体的构建
将pET30a载体和PCR终产物(步骤2中切胶回收的DNA片段)分别用KpnI和XhoI酶切，回收酶切产物后，将其连接构建得到pET30a-P37-CIN表达载体，过程如图1所示。将含有表达载体的阳性克隆扩大培养后，进行测序分析，测序结果和设计的序列完全一致，表明载体构建成功。
实施例3抗菌肽的诱导表达
1)按常规方法转化上述表达载体入大肠杆菌BL21，将转化后的细菌涂布于LB平板，置于37℃孵箱中培养过夜。可观察到明显的阳性克隆生长于平板上。
2)挑取阳性的单菌落在LB液体培养至OD600为0.4-0.6，然后加入0.5mM的IPTG，于37℃250rpm过夜诱导目的蛋白的表达，同时做一个不加IPTG的对照。
3)收集菌体，利用10000g离心15分钟弃掉上清液。在1MTris-HCl溶液中超声破碎菌体，20000g，离心30分钟，对上清液进行SDS-PAGE分析，对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色后可见明显的目的蛋白可溶表达条带。
实施例4抗菌肽的纯化
1)融合蛋白的表达与纯化
培养工程菌5升，10000g离心收集菌体。采用超声法法破碎菌体，离心破碎后菌体，收集上清液。直接加载His-Tag亲和柱中，用50mM/L咪唑洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用100mM/L咪唑洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合蛋白。
2)融合蛋白的酶解与抗菌肽的纯化
将上述获得的融合蛋白进行肠激酶的酶切反应，具体条件为23℃孵育12小时，每毫克融合蛋白加入2-3单位的肠激酶进行酶切反应。利用截留分子量为10Kd以上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析液中的抗菌肽再进行浓缩，得到纯化后的设计的抗菌肽蛋白。
实施例5抗菌肽的活性检测
采用平板稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)，测定细菌浓度的OD值表明，所设计的融合抗菌肽浓缩液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有体外抑菌活性。具体见下表。
表2.抗菌肽的抑菌活性
| 抗菌肽 | 大肠杆菌MIC(μg/L) | 金黄色葡萄球菌MIC(μg/L) |
| 融合抗菌肽 | 2-8 | 0.5-2 |
| PAMP37 | 8-32 | 0.5-2 |
| indolicidin | 4-16 | 1-4 |
结果显示，本发明设计的融合抗菌肽的抗菌活性较单独的猪抗菌肽(PAMP37)和牛的抗菌肽(Indolicidin)都有显著的提高。为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，这对研发新型抗菌免疫制剂，有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义。
Claims (10)
1.一种融合抗菌肽，包含猪抗菌肽和牛抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述猪抗菌肽为PAMP37，所述牛抗菌肽为Indolicidin。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽由猪抗菌肽和牛抗菌肽串联一起得到的。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQ ID1。
5.一种融合抗菌肽的重组DNA，其特征在于，所述的重组DNA表达后得到权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
6.根据权利要求5所述的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA序列为序列表中SEQ ID2。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求5-6任意一项所述的重组DNA或者表达权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
8.一种抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
9.一种融合抗菌肽的制备方法，所述的制备方法包括：
1)将包含猪抗菌肽和牛抗菌肽的多肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
2)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；
3)将重组DNA序列构建到表达载体上；
4)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。
10.权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽、权利要求7所述的载体以及权利要求8所述的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
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