CN104017087B - 一种猪源抗菌肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪源抗菌肽及其制备方法。本发明将猪抗菌肽cecropin？P1和PMAP-36串联构建了一种融合抗菌肽，并且利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了所述融合抗菌肽的DNA序列，并将其构建到表达载体中，随后进行了融合抗菌肽的表达及纯化，抗菌活性结果显示，所得到的融合抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很好的体外抑菌活性。本发明提供的抗菌肽可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的技术领域，具体为一种猪源抗菌肽及其制备方法。
背景技术
抗菌肽(antibacterialpeptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽。猪源抗菌肽是从猪体内分离得到的抗菌肽。
由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时，对猪体内自然产生的抗菌肽功能的了解，以及设计一种方法来调节猪体内自然抗菌肽的功能以替代抗生素的研究便显得极为重要，这将对寻找抗生素替代品起到积极的促进作用。
cecropins是第一个被发现的动物抗菌肽，1989年，Lee等人从猪小肠中分高到了cecropinP1，说明了cecropins可能在动物中广泛存在。该多肽含有31个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端为线性结构，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。cecropins对革兰阳性菌、阴性菌部具有很强的杀伤力。大量试验研究证明，cecropins的抗菌活性主要依赖于其两亲性的a-螺旋结构，这种结构使之可以在原核细胞质膜上形成巨大的时间性和电势依赖性的离子通道，致使细胞内外渗透压改变，细胞内容物尤其是钾离子大量渗出，细菌因此而死。cecropinP1杀菌过程如下：首先抗菌肽分子两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负电荷通过静电相吸而靠近，接着借助于分子中N端与C端间的连续结构的柔性，抗菌肽分子中的疏水端***质膜中；然后其两亲性α-螺旋也插人质膜中，这样就破坏了脂质双层原有的有序结构，由于α-螺旋的两亲性使抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，细菌最终因不能保持正常渗透压而致死。
PMAPs属于猪髓源性抗菌肽，根据其结构差异分为PMAP-23、PMAP-36和PMAP-37，分别含有23、36和37个氨基酸。对其结构预测和色谱分析表明PMAP-36和PMAP-37具有两亲性α螺旋。猪的PMAP36是含有36个氨基酸残基的抗菌多肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成α螺旋结构，利用该结构可以在细菌细胞膜上形成穿孔，因此对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有显著杀伤作用。
然而，现有的研究表明，许多天然的抗菌肽活性并不高，或者对真核细胞存在较高的细胞毒性，因此在作为新型抗生素替代品研制之前需要通过分子改良进一步提高其活性，或降低其毒性。此外，细菌感染已经成为影响畜牧业生产的一个重要原因，尤其是耐药菌株的出现，更是增加了疾病的治疗难度。因此，在目前抗菌肽的研究中迫切需要改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子用以创造高活力抗菌肽。
随着分子生物学技术的发展，通过基因工程技术，对猪体内抗菌肽的研究，将猪抗菌肽基因克隆与表达。本发明创造性的将猪的抗菌肽cecropinP1和PMAP-36进行了融合，融合后的抗菌肽提高了抗菌活性，同时改良了融合抗菌肽的密码子从而得到适于工业大量生产的新型、环保、高活性的融合抗菌肽。
利用本发明提供的猪抗菌肽作为类饲料添加剂，可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。本发明提供的猪抗菌肽类饲料添加剂将在畜牧生产中具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高抗菌活性的融合抗菌肽。所述融合抗菌肽包含两种或两种以上猪抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽包含猪抗菌肽cecropinP1和PMAP-36。
更进一步的，所述融合抗菌肽是将猪抗菌肽cecropinP1和PMAP-36串联一起得到的。
更近一步的，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQID1。
本发明的目的是提供一种融合抗菌肽的重组DNA，所述的重组DNA是经过密码子优化、适合在大肠杆菌表达融合抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽的重组DNA序列为序列表中SEQID2。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的载体。优选使用pET30a载体表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的细胞系。优选使用大肠杆菌BL21表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种新型抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有上述的融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法。
进一步的，所述融合抗菌肽的制备方法包括：
5)将两种或两种以上猪抗菌肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
6)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；
7)将重组DNA序列构建到表达载体上；
8)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。
更进一步的，所述猪抗菌肽为抗菌肽cecropinP1和抗菌肽PMAP-36。
更进一步的，设计的融合抗菌肽可通过合成或多重PCR、直接合成等方法获得。优选进行多重PCR引物所采用的序列选自序列表中SEQID4、SEQID5、SEQID6、SEQID7中的一条或几条。
更进一步的，将重组DNA通过酶切链接或同源重组等方式连接到表达载体上。
更进一步的，对表达的融合抗菌肽进行纯化。
本发明的目的是提供融合抗菌肽、能够表达融合抗菌肽的载体以及含有融合抗菌肽的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
本发明的优点：
1)本发明创造性的将猪抗菌肽cecropinP1和PMAP-36进行多肽串联，获得了具有高抗菌活性的融合抗菌肽，所述融合抗菌肽可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。；
2)本发明提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法，采用该制备方法可以高效获得融合抗菌肽。
附图说明
图1为重组表达载体的构建过程
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1抗菌肽的结构设计和预测
为了增强抗菌肽的杀菌活性，将猪抗菌肽(PAMP36)和CercropinP1的C端序列串联一起进行构建，其构建得到的融合多肽的氨基酸序列为SEQID1：VGRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCGPEGIAIAIQGGPR。
利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了该序列的重组DNA序列(SEQID2)，经二级结构预测得到该多肽N端为一个α螺旋，C端为β片层的结构。
实施例2抗菌肽表达载体的构建
1)优化DNA序列使其适应于大肠杆菌的密码子偏爱性，增加载体构建所用的酶切位点，设计融合多肽DNA序列(SEQID3)如下：
GGTACCGTTGGTCGTTTCCGTCGTCTGCGTAAAAAAACCCGTAAACGTCTGAAAAAAATCGGTAAAGTTCTGAAATGGATCCCGCCGATCGTTGGTTCTATCCCGCTGGGTTGCGGTCCGGAAGGTATCGCTATCGCTATCCAGGGTGGTCCGCGTTAACTCGAG
黑色下划线的序列为酶切位点(KpnI和XhoI)。
将DNA序列分别合成多条引物，利用重叠PCR的方法，将多条引物扩增拼接成完整的DNA序列。合成的引物序列见表1：
表1.合成引物的具体序列
| 引物编号 | 序列 |
| S1-SEQ ID 4 | 5’-agggtaccgttggtcgtttccgtcgtctgcgtaaaaaaacccgtaaacgtctgaa-3’ |
| A1-SEQ ID 5 | 5’-aacgatcggcgggatccatttcagaactttaccgatttttttcagacgtttacggg-3’ |
| F1-SEQ ID 6 | 5’-ggatcccgccgatcgttggttctatcccgctgggttgcggtccggaaggtatcgct-3’ |
| R1-SEQ ID 7 | 5’-tactcgagttaacgcggaccaccctggatagcgatagcgataccttccggac-3’ |
2)重叠PCR扩增目的DNA序列
分别利用S1和A1及F1和R1进行融合蛋白部分序列(P1和P2)的扩增合成。
纯化回收各自扩增产物，进行第二步的扩增。反应体系(总体积每管50微升)为2XPfu聚合酶反应液：25微升，P1回收产物：1微升；P2回收产物：1微升；去离子水：21微升。扩增条件均为：95℃预变性，5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共5个循环。然后加入引物S1：1微升；引物R1：1微升，95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环。琼脂凝胶电泳鉴定PCR产物，并切胶回收DNA片段。
3)抗菌肽表达载体的构建
将pET30a载体和PCR终产物(步骤2中切胶回收的DNA片段)分别用KpnI和XhoI酶切，回收酶切产物后，将其连接构建得到pET30a-P36-CP1表达载体，过程如图1所示。将含有表达载体的阳性克隆扩大培养后，进行测序分析，测序结果和设计的序列完全一致，表明载体构建成功。
实施例3抗菌肽的诱导表达
1)按常规方法转化上述表达载体入大肠杆菌BL21，将转化后的细菌涂布于LB平板，置于37℃孵箱中培养过夜。可观察到明显的阳性克隆生长于平板上。
2)挑取阳性的单菌落在LB液体培养至OD600为0.4，然后加入0.5-0.8mM的IPTG，于37℃250rpm诱导目的蛋白的表达16-18小时，同时做一个不加IPTG的对照。
3)收集菌体，利用10000g离心15分钟弃掉上清液。在1MTris-HCl溶液中超声破碎菌体，20000g，离心30分钟，对上清液进行SDS-PAGE分析，对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色后可见明显的目的蛋白可溶表达条带。
实施例4抗菌肽的纯化
1)融合蛋白的表达与纯化
培养工程菌5升，10000g离心收集菌体。采用超声法法破碎菌体，离心破碎后菌体，收集上清液。直接加载His-Tag亲和柱中，用50mM/L咪唑洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用100mM/L咪唑洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合蛋白。
2)融合蛋白的酶解与抗菌肽的纯化
将上述获得的融合蛋白进行肠激酶的酶切反应，具体条件为23℃孵育12小时，每毫克融合蛋白加入2-3单位的肠激酶进行酶切反应。利用截留分子量为10Kd以上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析液中的抗菌肽再进行浓缩，得到纯化后的设计的抗菌肽蛋白。
实施例5抗菌肽的活性检测
采用琼脂糖平板扩散法检测抗菌活性，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在试管中扩增培养；稀释菌液浓度到105菌/ml，再分别涂布到MHA平板上，晾干3-4分钟；然后分别在平板上放入不锈钢牛津杯，将抗菌肽浓缩液10微升加入牛津杯中28℃培养过夜。观察抑菌圈的大小。结果表明所设计的抗菌肽浓缩液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显体外抑菌活性。
本发明设计的融合抗菌肽的抗菌活性得到提高。为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，这对研发新型抗菌免疫制剂，有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义。
Claims (8)
1.一种融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.1。
2.一种融合抗菌肽的重组DNA，其特征在于，所述的重组DNA表达后得到权利要求1所述的融合抗菌肽。
3.根据权利要求2所述的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA序列为序列表中SEQIDNO.2。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2-3任意一项所述的重组DNA。
5.一种载体，其特征在于，所述载体表达权利要求1所述的融合抗菌肽。
6.一种抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有权利要求1所述的融合抗菌肽。
7.一种融合抗菌肽的制备方法，所述的制备方法包括：
1)根据宿主菌密码子的偏爱性，设计编码权利要求1所述的融合抗菌肽的重组DNA序列；
2)将重组DNA序列构建到表达载体上；
3)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。
8.权利要求1所述的融合抗菌肽或权利要求6所述的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
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| CN101509007A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-08-19 | 东北农业大学 | LfcinB15-Mag12编码基因的合成及在大肠杆菌中表达的方法 |
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