CN104004677A - 一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，包括酒精工业黄水的收集处理、地衣芽孢杆菌在酒精工业黄水中的培养以及地衣芽孢杆菌的收取和制备。本发明所提供的利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌的方法，既能充分利用酒精工业黄水，降低黄水的处理成本，优化黄水的综合利用，改善生态环境，又能扩大现有地衣芽孢杆菌制剂生产中营养基质的来源，降低生产成本，扩大地衣芽孢杆菌的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及酒精工业黄水的综合利用领域以及微生物发酵领域，尤其是利用酒精工业中的黄水进行微生物发酵。
背景技术
酒精工业是我国一项重要的能源产业，但在酒精生产过程中会产生巨大的副产物，其中酒糟等固体成分和部分黄水一起可继续生产DDGS等饲料原料而被再次利用，而绝大部分的黄水却没有得到很好的利用。黄水是在生产酒精过程中排出的富含多种营养成分的液体物质，黄水中含丰富的有机酸(尤其是乳酸、丁酸、己酸、乙酸等羧酸含量最多)、醇、醛、酯等呈香味物质，同时还含有氨基酸、糖类、酒精、腐殖质、酵母菌体自溶物、微生物菌体以及活细胞等，由于其营养丰富，直接排入环境中往往会造成严重的水体富营养化的污染，为此，国家规定酒精企业排放的废水必须经过前期处理，并达到4级水标准后方可排放，这样一来，除了黄水中的营养成分被浪费外，酒精企业往往增加较多的费用用于黄水的处理，而且，目前我国大部分酒厂对黄水的处理都是将其用于拌糟回窖发酵或养窖、培养人工窖泥等方面，不仅不能有效利用资源，而且无法从根本上解决发酵黄水的最终去路问题。因此如何综合利用黄水资源，如何能够变废为宝，彻底解决黄水的去路问题显得尤为重要，如若能将黄水变废为宝，充分利用起来，将降低企业的成本投入，同时也符合生态环境建设的需要。
地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，细胞大小0.8×（1.5~3.5）??m。地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，其芽孢形态为产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。地衣芽孢杆菌作为活菌制剂进入肠道后，对葡萄球菌、酵母样菌等致病菌有拮抗作用，而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化性链球菌等有益菌有促进作用，从而达到调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生物环境的作用；能够刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高机体免疫力；另外，在适宜条件下，能够合成蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等酶类，与内源酶共同发挥作用，促进养分的消化吸收。基于以上特点，目前地衣芽孢杆菌在医药、保健、食品、生物饲料生产等行业得到了广泛应用。然而，目前地衣芽孢杆菌制剂的生产方法多采用人为加入大量优质营养物质作为原料进行生产，其生产成本较高，进而限制了地衣芽孢杆菌的应用，以及增加以地衣芽孢杆菌为原料的相关产品的成本。
由于酒精工业黄水中富含多种可溶态的营养物质，因此，如果能够利用酒精工业黄水进行地衣芽孢杆菌的生产，既能解决酒精工业黄水的综合利用问题，变废为宝，又能降低目前地衣芽孢杆菌制剂的生产成本，进一步扩大地衣芽孢杆菌的应用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用酒精工业黄水进行地衣芽孢杆菌制剂的生产方法，一方面减少酒精工业中黄水处理的环节和费用，提高酒精工业黄水的综合利用率，另一方面降低地衣芽孢杆菌制剂工业生产的成本。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其具体步骤如下：
（1）从板框压滤机的板框直接收集酒精工业黄水，迅速放入密封的容器中，然后取样进行蛋白质、纤维素、氨基酸、有机酸、矿物元素等营养成分含量的测定，并根据实际测定值和地衣芽孢杆菌生长繁殖的营养需要，进行营养成分补充；
（2）将步骤（1）中补充营养后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，并进行冷却，经过灭菌后的酒精工业黄水pH为3.2~3.5，不适合地衣芽孢杆菌生长繁殖，然后利用氢氧化钠、碳酸氢钠将其pH调节至7.2~7.5；
（3）将地衣芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至稳定生产期，检测活菌数不低于1×109 cfu/mL即可作为种子菌液，备用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配比为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，并将其pH调节至7.2~7.5；
（4）将步骤（3）中所得到种子菌液按照6%~8%（v/v）的比例接种于经步骤（2）处理后的酒精工业黄水中，并在36℃~36.5℃的温度下，置于200~220r/min的恒温振荡器上培养16~18h，得到地衣芽孢杆菌菌液，备用；
（5）在步骤（4）中得到的地衣芽孢杆菌菌液中添加氯化钙，其添加的量按照重量体积比（w/v）为0.05%~0.08%，然后在60℃水浴中加热10min~20min，再转入80℃水浴中加热5min~10min，得到含有芽胞的菌液，该方法处理的地衣芽孢杆菌芽孢形成率89.1%~92.6%；
（6）将步骤（5）中含有芽孢的菌液用大容量离心机于3500~4000r/min离心10~15min，弃去上清液，获得地衣芽孢杆菌固体物；
（7）按照步骤（6）所得的地衣芽孢杆菌固体物与载体1:4~6的重量比，加入碳酸钙粉载体，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌固体混合物；
（8）将步骤（7）所得的地衣芽孢杆菌固体混合物在无菌、60℃~65℃条件下烘干，研磨成干粉，干粉中有效地衣芽孢杆菌数为20×109~30×109个/g，有效地衣芽孢杆菌数指的是地衣芽孢杆菌活菌数和形成芽孢的地衣芽孢杆菌数之和；
（9）在步骤（8）所得到的地衣芽孢杆菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作为赋形剂，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌制剂，其中有效地衣芽孢杆菌数≥50亿个/克，然后用复合薄膜对地衣芽孢杆菌制剂，进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
本发明所用的地衣芽孢杆菌购自上海桑戈生物科技有限公司，保藏于美国标准生物品收藏中心，其保藏编号为ATCC 11946，购买日期为2013年11月20日。
本发明具有以下有益效果：
第一，与目前地衣芽孢杆菌制剂生产的原料和营养基质相比，本发明采用酒精工业黄水作为培养原料和基质，充分利用了酒精工业废水，提高了酒精工业黄水的综合利用价值，改善了生态环境，扩大了地衣芽孢杆菌制剂生产所需营养基质的来源，降低了地衣芽孢杆菌的生产成本；
第二，经地衣芽孢杆菌的培养，酒精工业黄水中的营养物质被地衣芽孢杆菌充分利用，含量有效降低，基本达到酒精废水的排放标准，不会造成水体的富营养化，并且省去了企业处理酒精工业黄水的环节以及相关投入，降低了相关企业的生产成本；
第三，本发明是从板框压滤机的板框直接采集酒精工业黄水的，这是因为酒精工业黄水的收集点较为重要，从板框压滤机的板框直接收集的黄水营养成分较排水口收集的黄水营养成分丰富，更加适合作为培养基质；
第四，本发明在测定酒精工业黄水营养含量的前提下，根据测定结果有针对性的对黄水进行营养补充，以更加适合地衣芽孢杆菌的生长和繁殖，进一步提高了地衣芽孢杆菌在酒精工业黄水中的产量；
第五，针对酒精工业黄水的特有的化学组成，进行适当的前处理和部分化学性质的改变，使其更适合地衣芽孢杆菌的生长和繁殖，提高地衣芽孢杆菌的产量；
第六，针对酒精工业黄水的特有化学组成和性质，提供了适当的用于培养地衣芽孢杆菌的操作参数，包括地衣芽孢杆菌接种量、培养温度、摇床转速以及培养时间等；
第七，在地衣芽孢杆菌培养结束后，利用本发明提供的收取及制备方法可使得地衣芽孢杆菌制剂的有效菌数≥50亿个/克，芽孢形成率达到89.1%~92.6%。
因此，本发明所提供的利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌的方法，既能充分利用酒精工业黄水，降低黄水的处理成本，优化黄水的综合利用，改善生态环境，又能扩大现有地衣芽孢杆菌制剂生产中营养基质的来源，降低生产成本，扩大地衣芽孢杆菌的应用范围。
附图说明
图1是酒精工业黄水中各种营养成分的含量。
图2是不同培养温度对有效地衣芽孢杆菌数的影响。
图3是不同培养时间对有效地衣芽孢杆菌数的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：
（1）从板框压滤机的板框直接收集酒精工业黄水，迅速放入密封的容器中，然后取样进行蛋白质、纤维素、氨基酸、有机酸、矿物元素等营养成分含量的测定，得到酒精工业黄水中各种营养成分的含量，测定结果见附图1，并根据实际测定值和地衣芽孢杆菌生长繁殖的营养需要，进行营养成分补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水中添加尿素5g、葡萄糖2g和氯化钠2g；
（2）将步骤（1）中补充营养后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，并进行冷却，然后利用氢氧化钠、碳酸氢钠将其pH调节至7.2~7.5；
（3）将地衣芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至稳定生产期，检测活菌数不低于1×109 cfu/mL即可作为种子菌液，备用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配比为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，并将其pH调节至7.2~7.5；
（4）将步骤（3）中所得到种子菌液按照6%（v/v）的比例接种于经步骤（2）处理后的酒精工业黄水中，并在36℃的温度下，置于200~220r/min的恒温振荡器上培养16h，得到地衣芽孢杆菌菌液，备用；
（5）在步骤（4）中得到的地衣芽孢杆菌菌液中添加氯化钙，其添加的量按照重量体积比（w/v）为0.05%，然后在60℃水浴中加热10min，再转入80℃水浴中加热5min，得到含有芽胞的菌液；
（6）将步骤（5）中含有芽孢的菌液用大容量离心机于3500~4000r/min离心10~15min，弃去上清液，获得地衣芽孢杆菌固体物；
（7）按照步骤（6）所得的地衣芽孢杆菌固体物与载体1:4的重量比，加入碳酸钙粉载体，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌固体混合物；
（8）将步骤（7）所得的地衣芽孢杆菌固体混合物在无菌、60℃~65℃条件下烘干，研磨成干粉；
（9）在步骤（8）得到的地衣芽孢杆菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作为赋形剂，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌制剂，然后用复合薄膜对地衣芽孢杆菌制剂进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
经测定，采用本实施例中的方法所得地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌有效菌数为（41.5±5.3）×109。
实施例2：一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：
（1）从板框压滤机的板框直接收集酒精工业黄水，迅速放入密封的容器中，然后取样进行蛋白质、纤维素、氨基酸、有机酸、矿物元素等营养成分含量的测定，得到酒精工业黄水中各种营养成分的含量，测定结果见附图1，并根据实际测定值和地衣芽孢杆菌生长繁殖的营养需要，进行营养成分补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水中添加尿素5g、葡萄糖2g、氯化钠2g；
（2）将步骤（1）中补充营养后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，冷却，然后利用氢氧化钠、碳酸氢钠将其pH调节至7.2~7.5；
（3）将地衣芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至稳定生产期，检测活菌数不低于1×109 cfu/mL即可作为种子菌液，备用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配比为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，并将其pH调节至7.2~7.5；
（4）将步骤（3）中所得到种子菌液按照8%（v/v）的比例接种于经步骤（2）处理后的酒精工业黄水中，并在36.5℃的温度下，置于200~220r/min的恒温振荡器上培养18h，得到地衣芽孢杆菌菌液，备用；
（5）在步骤（4）中得到的地衣芽孢杆菌菌液中添加氯化钙，其添加的量按照重量体积比（w/v）为0.08%，然后在60℃水浴中加热20min，再转入80℃水浴中加热10min，得到含有芽胞的菌液；
（6）将步骤（5）中含有芽孢的菌液用大容量离心机于3500~4000r/min离心10~15min，弃去上清液，获得地衣芽孢杆菌固体物；
（7）按照步骤（6）所得的地衣芽孢杆菌固体物与载体1:6的重量比，加入碳酸钙粉，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌固体混合物；
（8）将步骤（7）所得的地衣芽孢杆菌固体混合物在无菌、60℃~65℃条件下烘干，研磨成干粉；
（9）将上述地衣芽孢杆菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作为赋形剂，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌制剂，然后用复合薄膜对地衣芽孢杆菌制剂进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
经测定，采用本实施例中的方法所得地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌有效菌数为（48.2±4.3）×109。
实施例3：一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：
（1）从板框压滤机的板框直接收集酒精工业黄水，迅速放入密封的容器中，然后取样进行蛋白质、纤维素、氨基酸、有机酸、矿物元素等营养成分含量的测定，得到酒精工业黄水中各种营养成分的含量，测定结果见附图1，并根据实际测定值和地衣芽孢杆菌生长繁殖的营养需要，进行营养成分补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水中添加尿素5g、葡萄糖2g、氯化钠2g；
（2）将步骤（1）中补充营养后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中在121℃条件下灭菌15~20min，冷却，然后利用氢氧化钠、碳酸氢钠将其pH调节至7.2~7.5；
（3）将地衣芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至稳定生产期，检测活菌数不低于1×109 cfu/mL即可作为种子菌液，备用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配比为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，并将其pH调节至7.2~7.5；
（4）将步骤（3）中所得到种子菌液按照7%（v/v）的比例于经步骤（2）处理后的酒精工业黄水中，并在36.2℃的温度下，置于200~220r/min的恒温振荡器上培养17h，得到地衣芽孢杆菌菌液，备用；
（5）在步骤（4）中得到的地衣芽孢杆菌菌液中添加氯化钙，其添加的量按照重量体积比（w/v）为0.07%，然后在60℃水浴中加热15min，再转入80℃水浴中加热8min，得到含有芽胞的菌液；
（6）将步骤（5）中含有芽孢的菌液用大容量离心机于3500~4000r/min离心10~15min，弃去上清液，获得地衣芽孢杆菌固体物；
（7）按照步骤（6）所得的地衣芽孢杆菌固体物与载体1:5的重量比，加入碳酸钙粉，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌固体混合物；
（8）将步骤（7）所得的地衣芽孢杆菌固体混合物在无菌、60℃~65℃条件下烘干，研磨成干粉；
（9）将上述地衣芽孢杆菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作为赋形剂，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌制剂，然后用复合薄膜对地衣芽孢杆菌制剂进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
经测定，采用本实施例中的方法所得地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌有效菌数为（45.6±6.4）×109。
下面结合试验例对本发明作进一步的说明。
试验例1：探讨采用本发明所提供的方法进行地衣芽孢杆菌培养，不同培养温度对最终地衣芽孢杆菌成品中有效菌数的影响，并找出最适宜的培养温度。
在微生物的培养中，温度的影响至关重要，直接影响到微生物培养的成功与否，以及最终的菌落数量是否合乎要求。依照本发明提供的方法，采用单因素实验设计，将培养温度分别设置为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、39℃和40℃的不同温度梯度，进行地衣芽孢杆菌的培养，试验结果见附图2。
由附图2中可以看出，按照本发明的方法进行地衣芽孢杆菌的培养时，当培养温度在36℃至36.5℃时，地衣芽孢杆菌制剂中有效菌数较高，尤其是36.5℃时候，有效菌数最高，因此，36.5℃是采用本发明的方法培养地衣芽孢杆菌的最适宜的培养温度。
试验例2：探讨采用本发明所提供的方法进行地衣芽孢杆菌培养，不同培养时间对最终地衣芽孢杆菌制剂中有效菌数的影响，并找出最适宜的培养时间。
微生物培养中，时间过短可能会得不到有效数量的菌落，时间过长可能会被杂菌污染，因此，培养时间至关重要。依照本发明的方法，采用单因素实验设计，将培养时间分别设置为12h、16h、18h、24h、36h和48h，进行地衣芽孢杆菌的培养，试验结果见附图3。
从附图3中可以看出，培养时间为16~18h时，地衣芽孢杆菌制剂中有效菌数量较多，尤其当培养时间为18h时，地衣芽孢杆菌有效菌数达到最高，因此依照本发明的方法，最适宜的培养时间是18h。
Claims (6)
1.一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将收集到的酒精工业黄水放入密封的容器中，取样进行营养成分的测定，并根据测定值对所收集的酒精工业黄水进行营养成分补充，备用；
（2）将步骤（1）中经过营养成分补充的酒精工业黄水进行灭菌，pH调节至7.2~7.5，备用；
（3）将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养至稳定生产期，检测活菌数不低于1×109 cfu/mL作为种子菌液，备用；
（4）将步骤（3）中所得到种子菌液按照6%~8%（v/v）的比例接种于经步骤（2）处理所得的酒精工业黄水中，并于36℃~36.5℃的培养温度下，在恒温振荡器上培养16h~18h，得到地衣芽孢杆菌菌液，备用；
（5）在步骤（4）中得到的地衣芽孢杆菌菌液中添加氯化钙，其添加的量按照重量体积比（w/v）为0.05%~0.08%，然后在60℃水浴中加热15min~20min，再转入80℃水浴中加热5min~10min，得到含有芽胞的菌液；
（6）将步骤（5）中含有芽孢的菌液用离心机进行离心处理，弃去上清液，获得地衣芽孢杆菌固体物；
（7）按照步骤（6）所得的地衣芽孢杆菌固体物与载体1:4~6的重量比例，添加碳酸钙粉载体，并混合均匀，制成地衣芽孢杆菌固体混合物；
（8）将步骤（7）中得到的地衣芽孢杆菌固体混合物在无菌条件下，于60℃~65℃烘干，研磨成干粉；
（9）在步骤（8）得到的干粉中加入赋形剂，混合均匀，制成地衣芽孢杆菌制剂，并真空包装。
2.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的灭菌在高压灭菌锅中进行，灭菌条件为121℃温度下灭菌15~20min。
3.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方是：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，其pH为7.2~7.5。
4.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的恒温振荡器的振动频率为200~220r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：所述步骤（6）中离心处理所用的离心机的转速为3500~4000r/min，离心时间为10~15min。
6.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产地衣芽孢杆菌制剂的方法，其特征在于：所述步骤（9）中所述的赋形剂为乳糖和可溶性淀粉，并根据与所述干粉的重量比，其添加量为4%的乳糖和20%的可溶性淀粉。
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