CN104004675A - 一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，包括酒精工业黄水的收集处理、乳酸菌在酒精工业黄水中的培养以及乳酸菌的收取和制备。本发明所提供的利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，既能充分利用酒精工业黄水，降低黄水的处理成本，优化黄水的综合利用，改善生态环境，又能扩大现有乳酸菌生产中营养基质的来源，降低生产成本，扩大乳酸菌的应用范围。

Description

一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法

技术领域

本发明涉及酒精工业黄水的综合利用领域以及微生物培养领域，尤其是利用酒精工业中的黄水进行微生物培养。

背景技术

酒精工业是我国一项重要的能源产业，但在酒精生产过程中会产生巨大的副产物，其中酒糟等固体成分和部分黄水一起可继续生产DDGS等饲料原料而被再次利用，而绝大部分的黄水却没有得到很好的利用。黄水是在生产酒精过程中排出的富含多种营养成分的液体物质，黄水中含丰富的有机酸(尤其是乳酸、丁酸、己酸、乙酸等羧酸含量最多)、醇、醛、酯等呈香味物质，同时还含有氨基酸、糖类、酒精、腐殖质、酵母菌体自溶物、微生物菌体以及活细胞等，由于其营养丰富，直接排入环境中往往会造成严重的水体富营养化的污染，为此，国家规定酒精企业排放的废水必须经过前期处理，并达到4级水标准后方可排放，这样一来，除了黄水中的营养成分被浪费外，酒精企业往往增加较多的费用用于黄水的处理，而且，目前我国大部分酒厂对黄水的处理都是将其用于拌糟回窖发酵或养窖、培养人工窖泥等方面，不仅不能有效利用资源，而且无法从根本上解决发酵黄水的最终去路问题。因此如何综合利用黄水资源，如何能够变废为宝，彻底解决黄水的去路问题显得尤为重要，如若能将黄水变废为宝，充分利用起来，将降低企业的成本投入，同时也符合生态环境建设的需要。

乳酸菌是一类能够在培养条件下产生乳酸，并同时产生一系列酶类的有益菌的总称，目前乳酸菌已形成工业生产，其成品已在医药保健、食品、饲料等行业中得到广泛应用。然而，现行乳酸菌生产方法多采用人为加入大量优质营养物质作为原料进行生产，其生产成本较高，进而影响乳酸菌的应用，以及增加以乳酸菌为原料的相关产品的成本。

酒精工业黄水中富含多种可溶态的营养物质，因此，如果能够利用酒精工业黄水进行乳酸菌的生产，既能解决酒精工业黄水的综合利用问题，变废为宝，又能降低目前乳酸菌生产成本，进一步扩大乳酸菌的应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用酒精工业黄水进行乳酸菌培养的技术方法，一方面减少酒精工业中黄水处理的环节和费用，提高酒精工业黄水的综合利用率，另一方面降低乳酸菌工业生产的成本。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，具体步骤如下：

（1）将收集到的酒精工业黄水用一般的药用纱布（双层）进行过滤，收集滤液作为乳酸菌培养基质，备用；

（2）对步骤（1）所得的酒精工业黄水滤液进行营养成分的测定，并根据测定结果以及乳酸菌生长繁殖的营养需要进行营养补充，备用，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水滤液中添加尿素2.5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL；

（3）对步骤（2）中经营养补充后的酒精工业黄水滤液进行灭菌，并将灭菌后的酒精工业黄水滤液的pH调节至6.3~6.5，备用，其中，具体的灭菌方法优选为：将补充营养后的酒精工业黄水的pH调节至3.2~3.5，并向盛装酒精工业黄水的容器内注入二氧化碳气体，密封并室温放置24h；

（4）将乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基上，并培养至对数生长中后期，检测活菌数不低于1×108 cfu/mL时作为种子菌液备用，其中MRS液体培养基的制作方法是：取牛肉蛋白粉10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g 、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0. 28g、蒸溜水1000mL混合，用高压灭菌锅在121℃灭菌20min-30min，调节pH6.3~6.5；

（5）按照5%（v/v）的比例将步骤（4）所得的的种子菌液接种于步骤（3）所得的酒精工业黄水滤液中，并于37~37.5℃的条件下培养24~30h；

（6）按照重量体积比向步骤（5）中经培养的乳酸菌中添加2%的熟米粉，并于室温下静置5min-10min，然后采用大容量离心机，于3000r/min离心，获得乳酸菌固体混合物，备用；

（7）取步骤（6）所得的乳酸菌固体混合物，采用真空冷冻干燥法进行干燥，其具体干燥方法为：将混合均匀的乳酸菌固体混合物摊成0.3~0.5cm的厚度，置于真空冷冻干燥机内，温度-45℃~-50℃，真空度10~20Pa，干燥时间22~24h，干燥完成后，用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa，即可得到乳酸菌成品。

进一步的，在步骤（7）进行之前，按照重量比，向步骤（6）所得到的乳酸菌固体混合物中加入2.5%~3%海藻酸钠、4.5%~5%的脱脂奶粉、5%甘油和8%~10%的β-环状糊精作为保护剂，并混合均匀。

本发明中所用的乳酸菌购自上海北诺生物科技有限公司，保藏于美国标准生物品收藏中心，其保藏编号为ATCC 11007，购买日期为2013年10月25日。

本发明具有以下有益效果：

第一，与目前乳酸菌生产的原料和营养基质相比，本发明采用酒精工业黄水作为培养原料和基质，充分利用了酒精工业废水，提高了酒精工业黄水的综合利用价值，改善了生态环境，扩大了乳酸菌生产所需营养基质的来源，降低了乳酸菌的生产成本；

第二，经乳酸菌的培养，酒精工业黄水中的营养物质被乳酸菌充分利用，其含量有效降低，基本达到酒精废水的排放标准，并且省去了企业处理酒精工业黄水的环节以及相关投入，降低了相关企业的生产成本；

第三，本发明是从板框压滤机的板框直接采集酒精工业黄水的，这是因为酒精工业黄水的收集点较为重要，从板框压滤机的板框直接收集的黄水营养成分较排水口收集的黄水营养成分丰富，更加适合作为培养基质；

第四，本发明在测定酒精工业黄水营养含量的前提下，根据测定结果有针对性的对黄水进行营养补充，以更加适合乳酸菌的生长和繁殖，进一步提高了乳酸菌在酒精工业黄水中的产量；

第五，针对酒精工业黄水的特有的化学组成，进行适当的前处理和部分化学性质的改变，使其更适合乳酸菌的生长和繁殖，提高乳酸菌的产量；

第六，针对酒精工业黄水的特有的化学性质，采用pH调节以及二氧化碳密封的方法进行灭菌，操作简单，灭菌效果较好，适宜工厂化生产的进行；

第七，在乳酸菌固体混合物冷冻干燥过程中加入相应的保护剂，可有效保存乳酸菌，使其存活率达85.3%。

因此，本发明所提供的利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，既能充分利用酒精工业黄水，降低黄水的处理成本，优化黄水的综合利用，改善生态环境，又能扩大现有乳酸菌生产中营养基质的来源，降低生产成本，扩大乳酸菌的应用范围。

附图说明

图1是酒精工业黄水中各种营养成分的含量。

图2是不同培养温度对乳酸菌成品中活菌数的影响。

图3是不同培养时间对乳酸菌成品中活菌数的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：

（1）将收集到的酒精工业黄水用一般的药用纱布（双层）进行过滤，收集滤液作为乳酸菌培养基质，备用；

（2）对步骤（1）所得的滤液进行营养成分的测定，其测定结果见附图1，并根据测定结果以及乳酸菌生长繁殖的营养需要进行营养补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水中添加尿素2.5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL；

（3）对步骤（2）中经营养补充后的酒精工业黄水滤液进行灭菌，并将灭菌后的酒精工业黄水滤液的pH调节至6.3~6.5，备用，其中，具体的灭菌方法为：将补充营养后的酒精工业黄水滤液的pH调节至3.2~3.5，并向盛装酒精工业黄水滤液的容器内注入二氧化碳气体，密封并室温放置24h；

（4）将乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基上，并培养至对数生长中后期，检测活菌数不低于1×108 cfu/mL时作为种子菌液备用，其中MRS液体培养基的制作方法是：取牛肉蛋白粉10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g 、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0. 28g、蒸溜水1000mL混合，用高压灭菌锅在121℃灭菌20min-30min，调节pH6.3~6.5；

（5）按照5%（v/v）的比例将步骤（4）所得的的种子菌液接种于步骤（3）所得的酒精工业黄水滤液中，并于37℃的条件下培养24h；

（6）按照重量体积比向步骤（5）中经培养的乳酸菌中添加2%的熟米粉，并于室温下静置5min，然后采用大容量离心机，于3000r/min离心，获得乳酸菌固体混合物，备用；

（7）根据步骤（6）所得的乳酸菌固体混合物的重量，按照重量比向乳酸菌固体混合物中加入2.5%~3%海藻酸钠、4.5%~5%的脱脂奶粉、5%甘油和8%~10%的β-环状糊精作为保护剂，并混合均匀，然后摊成0.3~0.5cm的厚度，置于真空冷冻干燥机内，在温度-45℃~-50℃，真空度10~20Pa的条件下进行冷冻干燥，干燥时间22~24h，干燥完成后，用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa，即可得到乳酸菌成品。

经测定，采用本实施例中的方法所得乳酸菌成品中活菌数量为（95.7±6）×10⁷。

实施例2：一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：

（1）将收集到的酒精工业黄水用一般的药用纱布（双层）进行过滤，收集滤液作为乳酸菌培养基质，备用；

（2）对步骤（1）所得的滤液进行营养成分的测定，其测定结果见附图1，并根据测定结果以及乳酸菌生长繁殖的营养需要进行营养补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水滤液中添加尿素2.5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL；

（3）对步骤（2）中经营养补充后的酒精工业黄水滤液进行灭菌，并将灭菌后的酒精工业黄水滤液的pH调节至6.3~6.5，备用，其中，具体的灭菌方法为：将补充营养后的酒精工业黄水滤液的pH调节至3.2~3.5，并向盛装酒精工业黄水滤液的容器内注入二氧化碳气体，密封并室温放置24h；

（4）将乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基上，并培养至对数生长中后期，检测活菌数不低于1×108 cfu/mL时作为种子菌液备用，其中MRS液体培养基的制作方法是：取牛肉蛋白粉10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g 、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0. 28g、蒸溜水1000mL混合，用高压灭菌锅在121℃灭菌20min-30min，调节pH6.3~6.5；

（5）按照5%（v/v）的比例将步骤（4）所得的的种子菌液接种于步骤（3）所得的酒精工业黄水滤液中，并于37.5℃的条件下培养30h；

（6）按照重量体积比向步骤（5）中经培养的乳酸菌中添加2%的熟米粉，并于室温下静置10min，然后采用大容量离心机，于3000r/min离心，获得乳酸菌固体混合物，备用；

（7）根据步骤（6）所得的乳酸菌固体混合物的重量，按照重量比向乳酸菌固体混合物中加入2.5%~3%海藻酸钠、4.5%~5%的脱脂奶粉、5%甘油和8%~10%的β-环状糊精作为保护剂，并混合均匀，然后摊成0.3~0.5cm的厚度，置于真空冷冻干燥机内，在温度-45℃~-50℃，真空度10~20Pa的条件下进行冷冻干燥，干燥时间22~24h，干燥完成后，用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa，即可得到乳酸菌成品。

经测定，采用本实施例中的方法所得乳酸菌成品中活菌数量为（98.5±9）×10⁷。

实施例3：一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，本方法采用的是玉米为原料生产酒精的黄水，具体步骤如下：

（1）将收集到的酒精工业黄水用一般的药用纱布（双层）进行过滤，收集滤液作为乳酸菌培养基质，备用；

（2）对步骤（1）所得的滤液进行营养成分的测定，其测定结果见附图1，并根据测定结果以及乳酸菌生长繁殖的营养需要进行营养补充，具体营养成分补充种类和数量为：每升上述的酒精工业黄水滤液中添加尿素2.5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL；

（3）对步骤（2）中经营养补充后的酒精工业黄水滤液进行灭菌，并将灭菌后的酒精工业黄水滤液的pH调节至6.3~6.5，备用，其中，具体的灭菌方法为：将补充营养后的酒精工业黄水滤液的pH调节至3.2~3.5，并向盛装酒精工业黄水滤液的容器内注入二氧化碳气体，密封并室温放置24h；

（4）将乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基上，并培养至对数生长中后期，检测活菌数不低于1×108 cfu/mL时作为种子菌液备用，其中MRS液体培养基的制作方法是：取牛肉蛋白粉10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g 、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0. 28g、蒸溜水1000mL混合，用高压灭菌锅在121℃灭菌20min-30min，调节pH6.3~6.5；

（5）按照5%（v/v）的比例将步骤（4）所得的的种子菌液接种于步骤（3）所得的酒精工业黄水滤液中，并于37.2℃的条件下培养27h；

（6）按照重量体积比向步骤（5）中经培养的乳酸菌中添加2%的熟米粉，并于室温下静置7min，然后采用大容量离心机，于3000r/min离心，获得乳酸菌固体混合物，备用；

（7）根据步骤（6）所得的乳酸菌固体混合物的重量，按照重量比向乳酸菌固体混合物中加入2.5%~3%海藻酸钠、4.5%~5%的脱脂奶粉、5%甘油和8%~10%的β-环状糊精作为保护剂，并混合均匀，然后摊成0.3~0.5cm的厚度，置于真空冷冻干燥机内，在温度-45℃~-50℃，真空度10~20Pa的条件下进行冷冻干燥，干燥时间22~24h，干燥完成后，用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa，即可得到乳酸菌成品。

经测定，采用本实施例中的方法所得乳酸菌成品中活菌数量为（104.3±7）×10⁷。

下面结合试验例对本发明作进一步的说明。

试验例1：探讨采用本发明所提供的方法进行乳酸菌培养，不同培养温度对最终乳酸菌成品中活菌的数量的影响，并找出最适宜的培养温度。

在微生物的培养中，温度的影响至关重要，直接影响到微生物培养的成功与否，以及最终的菌落数量是否合乎要求。依照本发明提供的方法，采用单因素实验设计，将培养温度分别设置为36℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃、38℃和40℃的不同温度梯度，进行乳酸菌的培养，试验结果见附图2。

由附图2中可以看出，按照本发明的方法进行乳酸菌的培养时，当培养温度在37℃至37.5℃时，乳酸菌中活菌数较高，尤其是37.2℃时候，活菌数最高，因此，37.2℃是采用本发明的方法培养乳酸菌的最适宜的培养温度。

试验例2：探讨采用本发明所提供的方法进行乳酸菌培养，不同培养时间对最终乳酸菌成品中活菌的数量的影响，并找出最适宜的培养时间。

乳酸菌的培养时间不宜过长，因为时间过长，乳酸菌会出现自溶现象，导致细菌数量急剧下降，因此，适宜的培养时间至关重要。依照本发明的方法，采用单因素实验设计，将培养时间分别设置为12h、18h、24h、30h、36h和48h，进行培养，并测定不同培养时间所得乳酸菌中活菌的数量，其结果见附图3。

从附图3中可以看出，培养时间为24h~30h时，乳酸菌中活菌数量较多，而且，当培养时间为30h时，其活菌数达到最大，因此依照本发明的方法，最适宜的培养时间是30h。

Claims (6)

1.一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将收集到的酒精工业黄水进行过滤，并取其滤液备用；

（2）对步骤（1）所得的酒精工业黄水滤液进行营养成分的测定，并根据测定结果对酒精工业黄水滤液进行营养补充，备用；

（3）对步骤（2）中经营养补充后的酒精工业黄水滤液进行灭菌，并将灭菌后的酒精工业黄水滤液的pH调节至6.3~6.5，备用；

（4）将乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基上，并培养至对数生长中后期，检测活菌数不低于1×10⁸ cfu/mL时作为种子菌液备用；

（5）按照5%（v/v）的比例将步骤（4）所得的的种子菌液接种于步骤（3）所得的酒精工业黄水滤液中，并于37~37.5℃的条件下培养24~30h；

（6）按照重量体积比向步骤（5）中经培养的乳酸菌中添加2%的熟米粉，并于室温下静置5min-10min，然后通过离心得到乳酸菌固体混合物，备用；

（7）将步骤（6）中所得的乳酸菌固体混合物摊成0.3~0.5cm的厚度，置于真空冷冻干燥机内进行干燥，干燥完成后进行真空包装，得到乳酸菌成品。

2.根据权利要求1所述的一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：步骤（1）中的酒精工业黄水是从板框压滤机的板框中收集得到。

3.根据权利要求2所述的一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：步骤（3）中的灭菌方法是先将补充营养后的酒精工业黄水滤液的pH调节至3.2~3.5，然后向盛装酒精工业黄水滤液的容器内注入二氧化碳气体，密封并室温放置24h。

4.根据权利要求3所述的一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：步骤（4）中的MRS液体培养基的制备方法是：取牛肉蛋白粉10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g 、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0. 28g和蒸溜水1000mL混合，并用高压灭菌锅在121℃灭菌20min-30min，然后调节pH至6.3~6.5。

5.根据权利要求4所述的一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：在进行步骤（7）之前，根据步骤（6）中所得的乳酸菌固体混合物的重量，按照重量比向乳酸菌固体混合物中加入2.5%~3%海藻酸钠、4.5%~5%的脱脂奶粉、5%甘油和8%~10%的β-环状糊精作为保护剂，并混合均匀。

6.根据权利要求5所述的一种利用酒精工业黄水生产乳酸菌的方法，其特征在于：步骤（7）中所述的真空冷冻干燥机的温度是-45℃~-50℃，真空度10~20Pa，干燥时间22~24h。