CN102688525A - 一种生物大分子水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶及其制备方法，该生物大分子水凝胶包括：蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化交联而成的蛋白或多肽生物大分子网络，多糖大分子通过二价离子交联而成的多糖生物大分子网络；上述两个网络之间相互贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽生物大分子含量为水凝胶干重总质量的1%-99%，多糖大分子构成的大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%。该水凝胶具有优异的力学性能，不使用化学交联剂，制备方法简单高效，水凝胶具有良好的生物相容性和力学强度，可以蒸汽消毒，可以是湿态或干态的膜状、多孔海绵状、管状、颗粒状，用于细胞、组织培养，作为组织修复材料、组织工程支架或药物释放载体。

Description

一种生物大分子水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明是一种由酶催化和离子交联的高强度生物大分子水凝胶及其制备方法，涉及一种互穿网络生物大分子水凝胶及其制备方法，属于生物医用材料领域。 

背景技术

生物大分子水凝胶是一类主要由蛋白质和多糖分子等天然物质构成的能在水中溶胀并保持大量水分的三维交联网络。由于生物大分子水凝胶拥有丰富的水环境、良好的生物相容性、与生物组织结构相类似的粘弹性，并能为营养物质和生物活性物质的扩散提供良好的传输通道，其优异的吸水、保水及仿生特性使得生物大分子水凝胶被广泛应用于生物医用材料和组织工程，可作为组织填充材料、药物控释载体、人造皮肤、人工软骨、组织工程支架材料等。然而,水凝胶特别是生物大分子水凝胶的机械强度通常较低，使其在人造皮肤、人造软骨和组织工程支架材料等方面的实际应用受到严重制约。 

互穿网络水凝胶是由两种或两种以上聚合物通过物理或化学方式交联缠结而形成的一类独特的网络互穿聚合物。通过网络互穿的形式能使两种具有不同功能的聚合物形成稳定的结合，从而实现组分之间性能的互补；其界面互穿、双向连续等结构特征，又使得他们在性能或功能上产生特殊的协同作用。同嵌段共聚物相比，这些体系的相形态相对环境的变化比较稳定，因为它是通过交联作用而固定的。因此制备互穿网络是提高水凝胶强度的最有效方法之一。 

广泛用于合成生物大分子水凝胶的蛋白质和多糖物质包括胶原、明胶、纤维蛋白，和壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、肝素、硫酸软骨素等。常用的交联方式有物理交联，如疏水相互作用、氢键作用等；化学交联常使用交联剂聚合，如戊二醛、环氧氯丙烷、二异氰酸酯、碳化二亚胺等；或结合热引发、辐射引发手段使用化学引发剂，如偶氮二异丁腈等。然而，化学交联剂或引发剂在体系中的残留往往造成材料存在细胞毒性、生物相容性低的缺点，限制了其应用。 

明胶是用酸或碱处理胶原蛋白得到的变性产物，是多种氨基酸的缩聚物。明胶作为组织工程材料有很多优点，如明胶是一种非抗原天然大分子，生物相容性好，在体内可以完全吸收等。 

转谷氨酰胺酶是一类酰基转移酶，它催化蛋白质分子间或分子内形成共价键，使蛋白质、多肽分子内或分子之间发生交联反应。催化反应的酰基供体一般为蛋白质或多肽链上谷氨酰胺残基的γ-酰胺基，受体可以为蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基，α-氨基，游离氨基酸的α-氨基、ε–氨基、伯氨或 H₂O。国内外许多研究人员都利用转谷氨酰胺酶交联改性明胶,提高明胶蛋白的强度和热稳定性,用于食品加工业（ JP04249954， JP08177514）、止血创伤敷料（  EP20070867783，CN200780051215.4,  JP01316647）、生物医用材料等。 

酶催化交联制备水凝胶材料是一种最新方法，因为采用酶催化交联，不使用化学交联剂，得到的水凝胶生物材料具有优异的生物相容性，但是通常得到的生物分子水凝胶强度非常差，通常只能作为注射材料。 

海藻酸盐是由褐藻中提取的一种天然线性多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古洛糖醛酸(G单元)通过1，4-糖苷键连接，并由不同GG、GM或MM片段以一定比例构成的无规嵌段共聚物。二价阳离子如Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺极易与海藻酸古洛糖醛酸上的多个氧原子发生螯合作用，使得海藻酸链间紧密结合，协同作用增强，链链间的相互作用最终导致三维网络结构，即水凝胶的形成。该水凝胶生物相容性好，凝胶时间快。同济大学任天斌等人用钙离子交联含有羟基磷灰石的海藻酸钠，形成生物大分子水凝胶，用于药物控释可注射型支架材料（CN201010563043.2）。 

由化学交联剂制备的生物分子水凝胶对细胞或组织有潜在的毒性，而生物大分子水凝胶力学强度低，至今几乎没有生物大分子水凝胶能够承受高温蒸汽消毒。因此，有必要发明一种结构特殊的高强度的生物大分子水凝胶及其制备方法，不使用化学交联剂，无任何毒性，用作组织修复或组织工程支架，乃至可以采用高温蒸汽消毒。 

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种高强度生物大分子水凝胶及其制备方法，该水凝胶具有优异的力学性能、生物相容性。 

技术方案：为了克服生物大分子水凝胶力学强度差以及常用化学交联剂或引发剂残留于体系中引起的细胞毒性、生物相容性降低的不足, 本发明一种酶催化和离子交联的互穿网络生物大分子水凝胶，该水凝胶具有良好的生物相容性和较高的力学强度，可用于细胞、组织培养，作为组织修复或组织工程支架材料，可以制成膜状或多孔状或管状等。 

本发明生物大分子水凝胶，其特征在于这种生物大分子水凝胶由（1）蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化交联而成的蛋白或多肽生物大分子网络，和（2）多糖大分子通过二价离子交联而成的多糖生物大分子网络组成，两个网络之间相互贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽生物大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%，多糖大分子构成的大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%。 

生物大分子水凝胶中蛋白是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、糖蛋白、层粘蛋白纤连蛋白中的一种或多种。多肽或含有氨基酸残基的分子是含有赖氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的一种或多种。催化酶是转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶同工酶，赖氨酰基氧化酶, 酪氨酸酶, 过氧化物酶，辣根过氧化物酶，嗜热菌蛋白酶，磷酸酯酶，β-内酰胺酶，血浆胺氧化酶。 

蛋白或多肽生物大分子网络是蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化通过肽键交联或通过席夫碱（Schiff base）交联或酚羟基氧化交联或辅酶A的磷酸基团与蛋白的丝氨酸残基结合交联而成，或是蛋白或多肽通过酶催化反应引起的生物大分子亲水性改变导致的生物大分子自组装物理交联而成。 

多糖生物大分子网络是由多糖大分子是海藻酸盐、结冷胶、瓜尔胶中的一种或多种通过二价钙离子或镁离子交联而成。 

这种生物大分子水凝胶中可以含有添加剂是酶、细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物、无机盐的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.001%-10%。 

本发明的生物大分子水凝胶的制备方法：将多糖大分子溶解在去离子水中得到多糖大分子水溶液，将蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剂，得到大分子混合溶液。加入酶催化剂，均匀混合，于0 ℃-50 ℃下催化交联反应0.5 - 24小时，使蛋白或多肽交联得到半互穿网络水凝胶。 将半互穿网络水凝胶进一步通过二价离子使多糖大分子交联，得到具有互穿网络结构的高强度生物大分子水凝胶。其中蛋白是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白中的一种或多种；多肽或含有氨基酸残基的分子是含有赖氨酸和谷氨酰胺的小分子肽或低聚物的一种或多种；多糖大分子是海藻酸盐、结冷胶、瓜尔胶中的一种或多种；酶是转谷氨酰胺酶，赖氨酰基氧化酶, 酪氨酸酶, 过氧化物酶，辣根过氧化物酶，包括植物、动物或微生物来源的酶；二价离子是钙离子，镁离子。添加剂是细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物的一种或多种的混合物。 

本发明的生物大分子水凝胶可以加工成湿态或干态的膜状、多孔海绵状管状、颗粒状，可以用作组织修复材料或组织工程支架，可以用于药物释放载体。 

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点： 

(1) 本发明通过蛋白或多肽的酶催化交联和多糖大分子的离子交联构成互穿网络水凝胶，两个网络协同提高生物大分子水凝胶的力学强度，良好的力学强度在人造皮肤、人工软骨、组织工程支架材料等方面的应用中至关重要。

(2) 本发明以生物相容性优异的蛋白或多肽分子或含氨基酸残基的分子和多糖大分子通过酶催化交联和二价钙离子或镁离子交联剂，不含任何有毒化学交联剂，生物相容性好，制备方法简单。 

(3) 本发明生物大分子水凝胶可以通过控制酶催化交联或离子交联程度控制生物降解性能。 

(4) 本发明的生物大分子水凝胶可以耐受121°C高温消毒，保持良好的力学性能，显著优于单个交联网络的生物大分子水凝胶。 

(5) 本发明的生物大分子水凝胶可以含有酶、细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物、无机盐的一种或多种的混合物作为添加剂，赋予水凝胶各种生物学功能。 

(6) 本发明的生物大分子水凝胶可以加工成湿态或干态的多孔海绵状、膜状、管状、颗粒状，可以用作组织修复材料或组织工程支架，可以用于药物释放载体。 

具体实施方式

本发明生物大分子水凝胶由（1）蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化交联而成的蛋白或多肽生物大分子网络，和（2）多糖大分子通过二价离子交联而成的多糖生物大分子网络组成，两个网络之间相互贯穿，没有化学键结合，其中蛋白生物大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%，多糖大分子构成的大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%。 

生物大分子水凝胶中蛋白是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、糖蛋白、层粘蛋白纤连蛋白中的一种或多种。多肽或含有氨基酸残基的分子是含有赖氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或酚羟基的小分子肽或低聚物的一种或多种。催化酶是转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶同工酶，赖氨酰基氧化酶, 酪氨酸酶, 过氧化物酶，辣根过氧化物酶，嗜热菌蛋白酶，磷酸酯酶，β-内酰胺酶，血浆胺氧化酶。 

蛋白或多肽生物大分子网络是蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化通过肽键交联或通过席夫碱（Schiff base）交联或酚羟基氧化交联或辅酶A的磷酸基团与蛋白的丝氨酸残基结合交联而成，或是蛋白或多肽通过酶催化反应引起的生物大分子亲水性改变导致的生物大分子自组装物理交联而成。 

多糖生物大分子网络是由多糖大分子是海藻酸盐、结冷胶、瓜尔胶中的一种或多种通过二价钙离子或镁离子交联而成。 

这种生物大分子水凝胶中可以含有添加剂是酶、细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物、无机盐的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.001%-10%。 

本发明的生物大分子水凝胶的制备方法：将多糖大分子溶解在去离子水中得到多糖大分子水溶液，将蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剂，得到大分子混合溶液。加入酶催化剂，均匀混合，于0 ℃-50 ℃下催化交联反应0.5 - 24小时，使蛋白或多肽交联得到半互穿网络水凝胶。 将半互穿网络水凝胶进一步通过二价离子使多糖大分子交联，得到具有互穿网络结构的高强度生物大分子水凝胶。其中蛋白是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白中的一种或多种；多肽或含有氨基酸残基的分子是含有赖氨酸和谷氨酰胺的小分子肽或低聚物的一种或多种；多糖大分子是海藻酸盐、结冷胶、瓜尔胶中的一种或多种；酶是转谷氨酰胺酶，赖氨酰基氧化酶, 酪氨酸酶, 过氧化物酶，辣根过氧化物酶，包括植物、动物或微生物来源的酶；二价离子是钙离子，镁离子。添加剂是细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物的一种或多种的混合物。 

本发明的生物大分子水凝胶可以加工成湿态或干态的膜状、多孔海绵状、管状、颗粒状，可以用作组织修复材料或组织工程支架，可以用于药物释放载体。 

实施例1 

称取0.6g海藻酸钠搅拌溶解在20ml去离子水中得到质量浓度为3%的海藻酸钠水溶液，称取3g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解，静置脱泡，得到均匀混合的明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.5ml浓度为100 U/ml的转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时，得到明胶通过肽键交联的蛋白半互穿网络水凝胶，其中含有海藻酸钠大分子。 

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络生物大分子水凝胶。水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶。 

将互穿网络水凝胶置于121 ℃高压釜中消毒半小时，得到明胶/海藻酸互穿网络水凝胶膜，一个网络是明胶通过肽键交联，另一个网络是海藻酸通过钙离子交联。 

实施例2 

称取0.1g瓜尔胶搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为1%的瓜尔胶水溶液，称取1g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解，静置脱泡，得到均匀混合的瓜尔胶和明胶大分子水溶液。

加入0.5ml浓度为50U/ml的微生物转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于管状或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时。 

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为10mol/L的CaHPO4溶液中1小时，得到管状或块状互穿网络生物大分子水凝胶。所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中。进一步经-80℃冷冻干燥，得到多孔海绵状酶催化和离子交联的互穿网络生物大分子交联多孔材料。将村里置于121 ℃高压釜中消毒半小时，得到明胶/瓜尔胶互穿网络多孔材料，一个网络是明胶通过肽键交联，另一个网络是瓜尔胶通过钙离子交联。 

实施例3 

称取0.2g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为2%的海藻酸钠水溶液，称取2g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，另加入1.5mL 0.05mg/mL骨形态发生蛋白（BMP-2) 溶液，搅拌均匀，静置脱泡，得到含有骨生长因子的明胶和海藻酸钠大分子水溶液。加入0.5ml浓度为200U/ml的微生物转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时。 

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶。进一步经气体发泡，冷冻干燥，得到得到明胶/海藻酸互穿网络多孔材料，一个网络是明胶通过肽键交联，另一个网络是瓜尔胶通过钙离子交联。 

实施例4 

称取0.2g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为2%的海藻酸钠水溶液，称取2g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，另加入1.5mL 10U/mL 胰岛素溶液，搅拌均匀，静置脱泡，得到含有胰岛素的明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.5ml浓度为200U/ml的转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。 

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶。将上述酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶冷冻干燥，得到多孔状组织修复材料。 

实施例5 

称取0.2g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为2%的海藻酸钠水溶液，称取2g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，另加入碱性成纤维细胞生长因子，搅拌均匀，静置脱泡，得到含有生长因子的明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.5ml浓度为200U/ml的转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。 

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶。将上述酶催化和离子交联的生物大分子水凝胶冷冻干燥，得到多孔状组织修复材料。 

实施例6 

称取0.1g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为1%的海藻酸钠水溶液，称取0.5g 含有赖氨酸和谷氨酰胺小分子肽加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，搅拌均匀，静置脱泡。加入0.2ml浓度为50 U/ml的转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于40℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化和离子交联的多肽/海藻酸生物大分子水凝胶，小分子肽通过肽键交联得到多肽大分子网络，海藻酸通过钙离子交联得到多糖大分子网络。 

实施例7 

称取0.1g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为1%的海藻酸钠水溶液，称取0.5g 含有四个酪氨酸残基的聚氧乙烯低聚物（分子量4000）加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，搅拌均匀，静置脱泡，得到水溶液。

加入0.2ml辣根过氧化物酶，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于25℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。 

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化交联和离子交联的聚氧乙烯/海藻酸生物大分子水凝胶，聚氧乙烯通过酚羟基交联得到聚氧乙烯网络，海藻酸通过钙离子交联得到多糖大分子网络。 

实施例8 

称取0.1g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为1%的海藻酸钠水溶液，称取2g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，搅拌均匀，静置脱泡，得到明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.2ml赖氨酰基氧化酶,，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于35℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。 

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化交联和离子交联的明胶/海藻酸生物大分子水凝胶，明胶通过席夫碱（Schiff base）交联得到蛋白大分子网络，海藻酸通过钙离子交联得到多糖大分子网络。 

实施例9 

称取0.2g海藻酸钠搅拌溶解在10ml去离子水中得到质量浓度为2%的海藻酸钠水溶液，称取2g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解后，搅拌均匀，静置脱泡，得到明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.2ml血浆胺氧化酶,，快速均匀混合，置于平板或柱状模具中，于35℃下反应交联1小时。 所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到膜状或块状互穿网络水凝胶。 

所得的水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得酶催化交联和离子交联的明胶/海藻酸生物大分子水凝胶，明胶通过席夫碱（Schiff base）交联得到蛋白大分子网络，海藻酸通过钙离子交联得到多糖大分子网络。 

实施例10 

制备明胶浓度为15%，海藻酸钠含量分别为1%, 2%,3%的明胶/海藻酸混合溶液，加入TG酶使浓度达到10U/ml。按表1中的组成混合加入模具中，在40°C下交联 30 min，取出明胶交联、海藻酸未交联的膜得到半互穿网络（IPN）水凝胶。再将半互穿网络水凝胶浸泡在0.6% CaCl2 水溶液中交联1h，水漂洗除去过量钙离子，得到明胶/海藻酸互穿网络水凝胶。交联过程中，明胶/海藻酸互穿网络水凝胶尺寸无明显变化，形貌均匀，而海藻酸钙水凝胶明显收缩。

  

表１．明胶/海藻酸互穿网络水凝胶的组成

样品	明胶(mg/ml)	海藻酸钠(mg/ml)	总量(mg/ml)
				明胶	150	0	150
G-A1	150	10	160
				G-A2	150	20	170
G-A3	150	30	180

明胶-海藻酸钠互穿网络水凝胶的压缩和拉伸力学测试结果显示，互穿网络的形成显著增强水凝胶的力学强度，且随海藻酸钠含量增加，压缩和拉伸强度增加，其中G-A3互穿网络水凝胶的压缩和拉伸强度分别为1.88MPa和0.78MPa，分别是明胶水凝胶的19倍和4倍，断裂伸长率最高达到195%，杨氏模量最高仅0.40MPa。

将TG酶交联明胶、钙离子交联海藻酸、TG酶/钙离子交联的明胶/海藻酸IPN水凝胶放到高压灭菌锅中121℃下高温灭菌20min。消毒后明胶水凝胶拉伸强度显著下降，几乎无法测量，海藻酸钙水凝胶显著收缩变形，唯独明胶／海藻酸IPN水凝胶的力学性能、尺寸均无明显变化，拉伸强度依然高达0.77MPa，甚至伸长率还有所增加，见表2。 

将TG酶交联明胶、钙离子交联海藻酸、TG酶/钙离子交联的明胶／海藻酸IPN水凝胶放到PBS溶液中浸泡，钙离子交联海藻酸水凝胶呈胀烂状，明胶/海藻酸IPN水凝胶拉伸强度无明显下降。 

互穿网络水凝胶经过高温蒸汽消毒（121℃/30分钟）力学强度、尺寸无明显变化（见表2），在PBS中浸泡后仍维持良好的力学强度，这是单网络生物大分子水凝胶无法实现的。 

表2. 明胶/海藻酸互穿网络水凝胶拉伸力学性能比较 

*: 钙离子交联海藻酸水凝胶因高压灭菌发生变形，PBS浸泡胀烂状，力学数据仅供参考。

明胶-海藻酸钠水凝胶经冷冻干燥制得多孔支架材料，-20℃和-80℃下冷冻干燥的凝胶材料孔径分别为200-500μm和100-200μm，低温更有利于形成均匀细微的孔径。同时，海藻酸钠的增加提高了水凝胶强度，水凝胶孔壁呈现更为规整均匀的形貌。 

实施例11 

明胶/海藻酸水凝胶交联过程中进行流变测量（组成见表1）。明胶在TG酶作用下40℃交联，20min内15%的明胶溶液弹性模量G’从0.7Pa增加到1186Pa；明胶含量增加1%，G’值即从1186Pa增加到2346Pa。因为在TG酶催化下明胶分子链上的谷氨酰胺基团与赖氨酸共价交联，形成均一的交联网络，且弹性模量随明胶含量增加而增加。

含有0%,1%,2%,3%海藻酸钠的15%明胶溶液在TG酶作用下于40℃交联。含3%海藻酸钠的明胶是纯明胶的10倍（56 Pa vs 5.73 Pa），表明海藻酸钠含量的增加导致凝胶的粘性模量大幅度增大，明显改变了其溶液相性质。但改变海藻酸钠浓度，20min后凝胶的弹性模量G’均相似(1186 Pa, 904 Pa, 1379 Pa, 1056 Pa)，表明海藻酸钠不影响明胶交联网络的形成，不属于明胶网络组成成分，在体系中保持溶液状态。这种水凝胶网络称为半互穿网络（semi-IPN）。 

含15%明胶、TG酶、钙离子和1%,2%,3%的海藻酸钠的混合物在40℃下孵育。体系的弹性模量G’值随着海藻酸钠浓度的增加明显增大(1309Pa, 1715Pa and 4569Pa)，表明在钙离子参与体系交联，形成海藻酸钙，明显提高了水凝胶的固体弹性性质，与海藻酸钙的”蛋格”理论相一致，最终得到明胶/海藻酸互穿网络水凝胶 

实施例12

明胶/海藻酸互穿网络水凝胶体外降解研究

水凝胶（组成见表1）放入PBS溶液中，在37℃下以80rpm的转速振荡降解，每隔一段时间，取出放入低温冰箱中冷冻，冻干后称重，与初始干重比较，计算失重率。结果显示，明胶水凝胶的模拟生理条件下降解迅速，降解19天失重率达到35%，而明胶/海藻酸水凝胶在前两周的降解速率较快，失重率达到15%左右。之后降解速率减慢，降解36天仍维持80%的质量。结果显示IPN水凝胶的抗降解性能远优于酶交联明胶水凝胶。酶交联明胶网络限制了海藻酸钙网络在PBS中离子交换过程，显著减缓海藻酸钙溶蚀过程，后者发过来增强明胶网络力学性能，减缓明胶降解速度。以上数据显示，双网络相互协同有效降低了生物大分子水凝胶的降解速度。

实施例13 

明胶/海藻酸互穿网络水凝胶生物学性能

细胞毒性评价：水凝胶（组成见表1）121℃高压灭菌30min后的DMEM浸提液培养L929细胞，测定细胞的相对增值率。结果显示，1d、3d、5d的细胞相对增值率都在９0%以上，说明明胶/海藻酸互穿网络水凝胶具有优异的生物相容性。

细胞粘附性能：水凝胶经121℃高压灭菌30min后用培养基润湿2h。浓度约105/ mL的L929细胞种植到水凝胶膜上,于37℃, 5%CO2的培养箱中培养8天。结果显示，各组水凝胶膜在细胞接种后都表现出一定的细胞黏附性。细胞在膜表面贴附牢固，细胞呈梭形，外形饱满，胞体伸展。随着培养时间增加，细胞不断扩增，至第8天时有大量细胞外基质分泌，细胞相互联接形成网状。 

将培养8天之后的水凝胶膜取出，戊二醛溶液固定。通过扫描电镜（SEM）观察L929细胞在明胶-海藻酸钠水凝胶膜上的生长情况。结果显示，细胞呈单个或团状粘附在凝胶表面，生长良好。丝状和纤维状突起伸展相互联接，并有大量细胞外基质分泌。生物学评价结果表明，海藻酸钠不影响细胞在水凝胶膜上黏附、生长、迁移与分泌胞外基质，明胶/海藻酸IPN水凝胶具有优异的细胞亲和性。 

实施例14 

称取0.6g海藻酸钠搅拌溶解在20ml去离子水中得到质量浓度为3%的海藻酸钠水溶液，称取3g明胶加入到上述海藻酸钠水溶液中，50℃水浴加热溶解，静置脱泡，得到均匀混合的明胶和海藻酸钠大分子水溶液。

加入0.5ml浓度为100 U/ml的转谷氨酰胺酶溶液，快速均匀混合，并通氮气鼓泡，于40℃下反应交联1小时，得到明胶通过肽键交联的蛋白半互穿网络水凝胶，其中含有海藻酸钠大分子。 然后，浸泡在摩尔浓度为5mol/L的氯化钙溶液中1小时，得到互穿网络生物大分子水凝胶。水凝胶反复水洗、去除残留钙离子后，热风干燥，即可得酶催化和离子交联的明胶/海藻酸互穿网络生物大分子多孔材料，一个网络是明胶通过肽键交联，另一个网络是海藻酸通过钙离子交联。 

Claims (10)

1.一种生物大分子水凝胶，其特征在于该生物大分子水凝胶包括：

1）蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化交联而成的蛋白或多肽生物大分子网络，

2）多糖大分子通过二价离子交联而成的多糖生物大分子网络；

上述两个网络之间相互贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽生物大分子网络的含量为水凝胶干重总质量的1%-99%，多糖大分子构成的大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1%-99%。

2.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述蛋白是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、糖蛋白、层粘蛋白或纤连蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于多肽或含有氨基酸残基的分子是含有赖氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或酚羟基的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述的酶是转谷氨酰胺酶、转谷氨酰胺酶同工酶、赖氨酰基氧化酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶、嗜热菌蛋白酶、磷酸酯酶、β-内酰胺酶或血浆胺氧化酶。

5.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于蛋白或多肽生物大分子网络是蛋白、多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化的肽键交联，或通过席夫碱Schiff base交联、酚羟基氧化交联或辅酶A的磷酸基团与蛋白的丝氨酸残基结合交联而成，或是蛋白或多肽通过酶催化反应引起的生物大分子亲水性改变导致的生物大分子自组装物理交联而成。

6.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述的多糖生物大分子网络是由大分子海藻酸盐、结冷胶、瓜尔胶中的一种或多种通过二价钙离子或镁离子交联而成。

7.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述的生物大分子水凝胶中还含有添加剂，该添加剂是酶、细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、***、药物或无机盐的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.001%-10%。

8.根据权利要求1所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述的二价离子是钙离子或镁离子。

9. 根据权利要求1、8所述的生物大分子水凝胶，其特征在于所述生物大分子水凝胶是湿态或干态的膜状、多孔海绵状、管状或颗粒状，用作组织修复材料、组织工程支架或药物释放载体。

10.一种如权利要求1所述的生物大分子水凝胶的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：

1.）将多糖大分子溶解在去离子水中得到多糖大分子水溶液，将蛋白或多肽溶解在上述多糖大分子水溶液中，或加入添加剂，得到大分子混合溶液；

2.）将步骤1得到的大分子混合溶液加入酶催化剂，均匀混合，于0 ℃-50 ℃下催化交联反应0.5 - 24小时，使蛋白或多肽交联得到含有未交联的多糖大分子的半互穿网络水凝胶；

3.）将含有未交联的多糖大分子的半互穿网络水凝胶进一步通过二价离子使多糖大分子交联，得到具有互穿网络结构的高强度生物大分子水凝胶。