CN103998620A - 用于确定蛋白水解酶活性的方法(变体)、用于实现该方法的装置以及诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本方法涉及生物技术领域。用于确定体外非均匀***如血或血浆中蛋白水解酶活性的空间和时间分布的方法包括将发光、应该或生色底物引入样品中，当蛋白水解酶切割底物时伴随可检测标志物的连续释放，和记录样品的光学特征，其使得可以评估酶活性的空间和时间分布。用于实现以上方法的装置包括体外***、用于光照样品的装置、记录装置和控制装置。还提出了根据蛋白水解酶活性的空间和时间分布用于诊断体内平衡失衡的方法。

Description

用于确定蛋白水解酶活性的方法(变体)、用于实现该方法的装置以及诊断方法
技术领域
本发明涉及医学和生物学，并且具体地，可以用于诊断和研究目的以确定血液及其组分的凝血特征以及用于生物技术、药理学以及基础生物研究中。
背景技术
目前，在复杂生物***的动态以及在这些具有空间非均匀性的***中所发生的过程的研究中存在重大问题。这些过程具体地包括凝血、补充、细胞凋亡、消化、纤维蛋白溶解，其中蛋白水解酶(蛋白酶类)起关键作用。
如果蛋白水解酶的浓度不随时间变化并且在所分析的样品的各个点都是相同的，则可以使用特异性荧光底物或生色底物测量该浓度。目前，存在在基础研究和相应生物***功能障碍的诊断中使用的测量浓度随时间变化的方法。为了确定凝血病症，现在使用血浆中凝血酶产生的测试，其公开在基础性论文：Hemker HC，Wielders S.，Kessels H.，Beguin S.，Continuous registration ofthromb in generation in plasma,its use for thedetermination ofthe thrombin potential，J Thromb Haemost.1993，Oct.18，70(4)：617-24中。该测试已显示出优于常规凝血测试的多个优势，但是它是空间均匀的，即研究了均匀的环境。这与如下所述的生物体中的情况不相对应。
图1示意性显示了凝血调控的空间概念。凝血由表达跨膜蛋白-组织因子(非酶辅因子)的细胞激活，跨膜蛋白-组织因子是凝血因子(左)并且增长深至血浆中。凝血酶的产生是通过激活的因子X(因子Xa，丝氨酸蛋白酶)一凝血酶原酶的限制组分调节的。仅通过外在X酶(extrinsictenase)(组织因子和因子VIIa的丝氨酸蛋白酶的复合物)的因子Xa的产生确定激活剂附近的凝血(开始期)。然而，因子Xa快速受到抑制并且不能扩散远离该激活剂。因此，在凝块增长期，它是通过内在X酶形成的。内在X酶的限制组分凝血因子IXa是通过外在X酶产生的。与因子Xa相反，IXa缓慢受到抑制并因此扩散较远。随着凝血的进一步增加，通过因子XIa产生了额外的因子IXa，反过来它是通过正反馈环中的凝血酶产生的。由于凝血调节蛋白的作用，凝块形成停止：负反馈环激活蛋白C，其通过破坏因子Va和VIIIa终止凝血酶的增加(参见，Panteleev M.A.，Ovanesov M.V.，Kireev D.A.，Shibeko A.M，Sinauridze E.I.，Ananyeva N.M.，Butylin A.A.，Saenko E.L.，and Ataullakhanov F.I.，Spatial Propagation andLocalization ofBlood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein CPathways，Respectively，Biophys J.2006Mar1；90(5)：1489-500)。尽管可以修正这种概念的一些细节，但是扩散过程的重要作用以及在凝血中的空间非均匀性是毫无疑问的(Hoffman M.，Monroe DM3rd，Acell based model ofhemostasis，Thromb Haemost.2001Jun；85(6)：958-65)。
凝血酶是凝血***的关键酶。它催化主反应-纤维蛋白原向纤维蛋白的转化。另外，正是凝血酶激活了凝血因子V、VIII、VII、XI、XIII、蛋白C、血小板、凝血酶-激活的纤维蛋白溶解抑制剂。在凝血中，所产生的凝血酶的量比其它蛋白酶类中的一种大10-100倍，这有利于它的检测。
在凝血酶催化的反应中，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，其聚合并因此使血浆胶凝。
凝血研究具有重大实际意义，因为它们不仅使得能够诊断某些疾病，而且还使得可以评估影响凝血参数的药物活性。
生色底物以及随后荧光底物的出现加快了凝血研究。这种合成底物是由蛋白水解酶所识别并且切割的分子。切割导致也称为“标志物”的信号分子从底物上剪切下来。标志物或改变溶液的光密度(生色或着色底物(coloring substrate))，或当光照时可以发荧光(荧光底物)，或可以在没有外部激发的情况下自发发光(化学发光标志物)。可以将凝血酶的底物直接加入到血浆中，并可以记录在凝血中出现的信号(光密度或光强度)。信号增加速率与凝血酶浓度成正比。在分析已知浓度的凝血酶或另一种标定物(例如，凝血酶和α2-巨球蛋白的复合物)时通过加入到缓冲液或血浆中获得了校准曲线，并且使用该校准曲线通过简单微分并从底物剪切速率计算凝血酶浓度获得了信号与时间的实验关系，从该实验关系获得了凝血酶的时间依赖性。
根据背景技术已知用于体外确定凝血参数的多种方法和装置。然而，所有已知的方法和装置通常设计用于均匀***，其中血液或血浆样品与激活剂均匀混合，这使得能够将这些***与作为复杂不均匀环境的体内***基本分开。
在熟知的体内***模型中，凝血过程的条件根本不同于在生物机体中形成凝块的条件。已知在人和动物的循环***中，凝块不是在整个血浆中形成的，而是严格地在局部形成的，即靠近破损血管壁的小区域内。凝块在体内是不均匀的。凝块的形成在空间中发生。它是在破损的血管壁上由外在X酶诱导的，并且在大部分血浆中通过凝血酶原酶的参与在激活的血小板上增长，并通过涉及凝血调节蛋白的反应在健康内皮上受到抑制。在这种情况下，凝血因子在小部分血浆中天然分布，并在其中形成凝块。这反映了止血***的基本防御机制-通过在损伤位点形成血块来维持血流的完整性。使用在均匀介质中进行的方法不能充分研究这些过程。
因此，由于期望更完整地模拟其中血块在血管中直接凝固的空间情况，目前存在体外凝血的实验模型问题。对于血栓形成和止血的基础研究以及对于应用-具体的诊断和药理学任务，均存在该问题。
仍未解决确定蛋白水解酶浓度在时间和空间上(即在测试样品体积中的不同点处)的变化的问题。
最近，已使用了使得能够考虑空间非均匀性和凝血因子扩散的装置。在该类装置中，凝血在含有复钙血浆的比色杯中发生。激活剂是具有固定化的凝血激活剂(例如，组织因子)的表面。一旦激活剂与血浆接触则开始凝血，然后增长至更深的血浆中，并且可以通过来自不断增长的凝块的光散射观察到它。
根据背景技术，我们已知用于研究血液及其组分的凝血特征的装置(2010年7月27日公开的专利RU2395812，cl.G01N33/49)，其包括容纳具有测试血浆样品的比色杯和施用到放置在比色杯中的***物上的凝血激活剂(如，促凝血酶原激酶(凝血组织因子))的恒温控制室，用于照亮比色杯内容物和在激活剂附近形成的凝块的LED，记录不断增长的凝块的数字照相机和用于处理所获得数据的计算机。
该装置使得能够实施包括仅记录作为凝血***的最终产物的纤维蛋白凝块的形成过程的方法。
我们还已知用于监控空间纤维蛋白凝块形成的方法和装置(2009年5月7日公开的国际专利申请PCT/CH2007/000543，cl.G01N33/49，公开号WO2009/055940)。
该装置包括用于光度分析的比色杯，比色杯包括室、***物和激活剂，其中放置所述比色杯的恒温器。凝血激活剂位于***物的底边缘上。凝血激活剂是生理学激活剂如组织因子，或非生理学激活剂如玻璃。比色杯由透光性(light-transmitting)聚苯乙烯制成。
该装置允许体外监控纤维蛋白凝块的形成和/或溶解，并包括下列步骤：
根据孔的数目，将一个或多个血浆样品放置在比色杯中，
向比色杯中***具有激活剂的***物，并将血浆与凝血激活剂(在凝块形成的情况下)接触，和
作为时间和距离的函数，记录纤维蛋白凝块的增长，或
向比色杯中放置含有一个或多个纤维蛋白凝块的一个或多个血浆样品，
将血浆与纤维蛋白溶解激活剂接触(在凝块溶解的情况下)，和
作为时间和距离的函数，记录纤维蛋白凝块的溶解。
用于监控空间纤维蛋白凝块形成的方法和装置的主要优势在于仅需要少量血浆。使用少至20μl(代替在其它先前报道的类似***中的300上达至1500μ1，即少75倍，并且比标准凝血测定中所需的最少血浆量少5倍)的量，可以产生可靠的高分辨结果。该装置使得能够实施包括仅记录作为凝血***的最终产物的纤维蛋白凝块的形成过程的方法。
上述装置和方法的缺点在于当加热测试样品时比色杯中记录区域内气泡的形成，这使来自纤维蛋白凝块的光散射信号失真。
仅具有一个波长的光源(如红光)阻碍研究荧光物质的时空分布。
此外，如上所述的装置和方法不可能记录调控空间纤维蛋白凝块增长过程的单独的凝血因子(如IIa、Xa、VIIa、XIa)的形成过程和空间分布。
在Kondratovich A.Y.，Pohilko A.V. and Ataullahanov F.I.，Spatiotemporal Dynamics ofContact Activation Factors ofBlood Coagulation，Biochim Biophys Acta.2002Jan15；1569(1-3)：86-104)中公开了与本发明方法和装置最相关的装置和方法。
为了实施上述方法，使用了乏血小板血浆。通过记录对这些因子特异的荧光底物的断裂产物7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)的靛蓝光发射确定了所研究的血浆样品的因子XIa和激肽释放酶的分布。
测量之前，将底物加入到每个测试血浆样品中，并且在37℃搅拌样品；在该温度下，将介质的pH保持在7.4。
图2示意性地显示了用于实施该方法的装置。该装置包括含有所研究的血浆样品2的聚苯乙烯盘1。将底物加入到血浆2中。将玻璃毛细管的尖头5用作凝血激活剂。该装置还包括光源6-汞灯、恒温器7、玻璃滤光器8、半透明镜9、数字照相机10、发荧光塑料标记物12；将该装置插至计算机11。
在二维(平面)介质中，即在未搅拌的血浆薄层中研究凝血因子的激活。将盘1转移到37℃的恒温器7中，并且激活剂快速降低从而使毛细管末端5浸入血浆中。
通过与玻璃接触激活的凝血因子切割底物，形成AMC。以下列方法记录AMC的荧光。用来自光源6并从半透明镜9反射的光照射血浆样品。滤光器8阻挡了光源光谱的可见光部分。通过安装在半透明镜后的数字照相机10记录AMC荧光。所记录的视野测量9.0×6.5mm。照相机的RGB输出信号的蓝色通道横跨AMC荧光的整个范围。将图像数据连续转移到计算机11上，在其显示器上显示并以指定间隔保存。将一块发荧光的塑料12固定在恒温器7的下方，使得它的图像始终处于照相机的视野中；这用于校准和考虑光变化。
在图像分析中，选择在激活剂中心开始的放射线。通过特定软件确定AMC浓度沿所述线的时空分布(图3)，并在此基础上恢复凝血因子浓度的时空分布。
这个方法的缺点包括仅测量接触激活剂(具体地，因子XIa、XIIa、激肽释放酶)的能力，区分这些因子对信号的贡献的能力差和不可能测量凝血过程，即纤维蛋白凝块的形成的空间动态。
该装置的缺点包括：对于高效的研究，所使用的盘不方便；使用了通过汞灯的不稳定光照，这使得不能进行精确测量；在加热测试样品时记录过程的区域中气泡形成，从而使荧光信号失真。
该方法使得不能对在它们的生理学性质方面与体内***类似的体外***进行模拟，并且不能对凝血***中的病症进行更准确的诊断。
此外，上述方法使得不能在纤维蛋白凝块增长过程中对凝血因子(尤为重要的是凝血酶)的空间动力学进行充分研究，并且不提供评价凝血因子在非均匀***中的凝血过程的不同阶段中的作用的机会。
因此，存在改善现有方法和装置以更好地确定血液和血液组分的凝血性质的明显需要。
发明内容
本发明的目的是研究在纤维蛋白凝块增长过程中凝血因子的空间动态和评估凝血因子在非均匀***中的凝血过程的不同阶段中的作用，这可以用于诊断一些疾病和评价影响凝血参数的药物活性。
可以通过实现所保护的解决方法获得的技术成果是提高了方法对凝血的血浆和血小板部分的病症的敏感性。
通过提供用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法实现了该目的，该方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质的样品(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)和分布在测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原；
将荧光底物浸入体外***中，在用蛋白水解酶切割所述底物期间进一步释放标志物；
在预定的时间，光照测试介质样品以激发标志物的荧光；
在预定的时间，与所述光照同时记录样品中标志物荧光的空间分布；
考虑标志物与所研究介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题(inverse problem)，从给定时间的标志物荧光的空间分布集合获得蛋白水解酶活性的时空分布。
还通过提供用于确定蛋白水解酶活性的时空分布的方法的第二种变体实现了该目的，该方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质的样品(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原；
将生色底物浸入体外***中，在通过蛋白水解酶切割所述底物期间进一步释放标志物；
在预定的时间，用处于一个波长的光照射所述测试介质样品，在所述波长下标志物的光吸收是显著的；
在预定的时间，记录介质内标志物的光吸收的空间分布；
考虑介质中的标志物与介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从给定时间的标志物的光吸收的空间分布集合确定(限定或计算)蛋白水解酶活性的时空分布。
还通过提供用于确定蛋白水解酶活性的时空分布方法的第三种变体实现了该目的，该方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质的样品(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原；
将发光底物浸入体外***中，在通过蛋白水解酶切割所述底物期间进一步释放标志物；
在预定的时间，记录样品中标志物的发光信号的空间分布；
考虑介质中的标志物与介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从给定时间的标志物发光性的空间分布集合确定(限定或计算)了蛋白水解酶活性的时空分布。
还通过另外将引起蛋白水解酶活性时空分布改变的活化剂放入体外***中实现。
还通过选择活化剂来实现，活化剂选自由以下所组成的组：固定在表面上的组织因子、可溶性组织因子、组织型纤维蛋白溶酶原活化因子、具有组织因子表达能力的细胞、体组织样品、玻璃或塑料。
还通过另外在给定时间光照所研究的测试介质样品以记录测试样品的空间参数来实现，所述参数选自由以下所组成的组中：样品内光散射的空间分布、光透射的空间分布或它们的组合。
还通过将底物以溶液形式加入到测试介质样品中来实现。
还实现了在放置测试介质样品之前，将底物以冻干形式施用于体外***的壁上。
还实现了以每分钟1至1800次的频率进行所述光照和标志物荧光变化的记录。
还实现了所述样品是全血或血浆，血浆选自富血小板血浆、无血小板血浆和乏血小板血浆。
还实现了在对于测试样品整体稳定的温度(优选地控制在约37℃)下进行该方法的所有步骤。
还实现了该方法包括在测试样品整体中稳定的压力，优选地高于大气压。
优选地，样品的pH稳定在7.2-7.4的范围内。
所研究的测试介质中的蛋白水解酶可以由于生物化学过程来自酶原；它还可以由于该***内的生物化学过程在测试介质中逐渐被破坏。
在给定的时间，将标志物和所形成的凝块的空间分布显像。
使用暗场法(dark-field method)记录来自测试介质样品的光散射。
使用荧光显微术法记录标志物荧光。
还使用了在给定时间提供光学***和光照/辐射处理***重新聚焦的共聚焦显微镜法进行测试介质中光散射分布和标志物荧光分布的记录。
还通过提供用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的装置实现了该目的，该装置包括：
体外***，其包含用于放置测试介质样品(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)、分布在所述介质样品中的蛋白水解酶或其酶原和荧光或生色或发光底物的比色杯；
在预定的时间用于光照测试介质样品的装置；
用于在预定的时间记录在用蛋白水解酶切割上述底物期间所形成的标志物信号的空间分布的装置，
用于控制所述光照/记录方式的装置。
以及同时它含有将激活剂放置并***到比色杯中以提供蛋白水解酶活性时空分布变化起始的装置。
以及同时它含有在测试介质样品内提供稳定温度(优选37℃)的装置。
以及同时它含有在测试介质样品的整体内提供稳定压力(优选地，高于大气压)的装置。
以及同时它含有根据暗场法用可见光辐射光照测试介质样品的装置。
以及同时控制光照和记录装置的装置提供了调节开/关时间、光照强度以及光照和记录装置之间同步的可能性。
以及同时它连接至计算装置，提供及时计算蛋白水解酶活性空间分布的可能性，或者开启所述装置。
当提供了基于对非均匀体外***中蛋白水解酶(凝血因子)活性的时空分布的记录，用于诊断止血***中病症的方法时，进一步实现了该目的，其包括以下步骤：
使用血液组分作为样品，血液组分选自由以下所组成的组中：全血、无血小板血浆、乏血小板血浆、富血小板血浆、加入抗凝血剂的血液、加入抗凝血剂的血浆；
通过实施至少一种操作提供了用于在测试样品中形成蛋白水解酶和用于观察其的条件，所述操作选自下组：将测试样品与固定在表面上的凝血激活剂接触；加入通过所研究的蛋白水解酶切割的底物；加入钙盐；加入凝血接触激活的抑制剂；
在确定的时间，记录在样品中从底物切割的标志物的信号的空间分布；
考虑介质中的标志物与介质组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从给定时间的标志物信号的空间分布集合确定蛋白水解酶(凝血因子)活性的时空分布，
根据蛋白水解酶时空分布的异常，估计止血***的状况。
以及通过在确定的时间(at difinite moments oftime)另外提供测试样品的光照和通过使用暗场法记录在测试介质样品中形成的纤维蛋白凝块的光散射的空间分布。
以及通过研究作为凝血因子的蛋白水解酶，蛋白水解酶选自凝血酶、因子Xa、因子VIIa、因子IXa、因子XIIa、因子XIa、胞浆素。
以及通过使用时空凝血酶或纤维蛋白分布的至少一种参数以评估样品中凝血***的状况并作出诊断；参数应选自下组：凝血酶波的空间传播速率、样品中凝血酶的最大浓度、波运动部分中凝血酶的最大浓度、凝血酶浓度的增长速率、凝血酶浓度根据空间的积分、凝血酶浓度根据时间和空间的积分、纤维蛋白前部(光散射)的空间传播速率、样品中的最大纤维蛋白浓度(光散射量)。
所提议的方法允许对在生理学性质方面与体内***接近的体外***进行模拟，和更准确地诊断凝血***中的病症。
将所得的蛋白水解酶活性的时空数据阵列(即时空分布)用于计算每个点中蛋白水解酶活性对于空间和时间的变化率，基于此以下是可能的：
判断样品中凝血***的状况；
通过与健康供体相比较，对患者中凝血***的状况做出结论：
估计治疗的功效；
选择药物制剂(medical preparation)的最佳单个剂量；
确定药物制剂的作用机制；
在开发药物制剂的过程中，筛选化学物质；
获得有关凝血***的工作机制的信息；
研究血液***病症的发病机制和病原学；
研究纤维蛋白凝块增长过程中凝血因子的空间动态；
使得能够评估非均匀***中不同凝血阶段中凝血因子的作用。
本方法确保了当所有其它测试不能揭示它们时早期高凝血状况的可靠诊断。对于医学实践中的第一次，这允许以高度的精确性检测患者对广泛病理的易患病性，病理包括多种病原学的高凝血综合征、出血、血栓形成、心脏病发作和中风；研究疾病的发病机制；监控常规和新一代药物，包括抗血友病制剂。
本装置使得能够实施本发明的方法并确保非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的更精确的确定。
附图说明
参考附图，通过本发明优选实施方式的描述，将进一步说明本发明，其中：
图1示意性显示了凝血调控的空间概念；
图2是用于确定凝血因子空间动态的已知装置的示意图；
图3显示了在凝血因子XIa的时空分布研究中获得的AMC浓度对距离和时间的典型依赖性；凝血激活剂位于坐标原点；
图4是根据本发明用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的装置的示意图；
图5a-b显示了根据本发明纤维蛋白凝块(a)和荧光团(b)形成的空间动态的显像；
图6a-b显示了使用根据本发明所述的装置获得的体外***中纤维蛋白凝块(a)形成和蛋白水解酶(凝血酶)(b)浓度的时空动态的实例；凝血激活剂位于坐标原点。
具体实施方式
方法的第一实施方式
根据本发明，提供了用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法，如下所示实施所述方法：
将体外***用于放置测试介质的样品(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原。
将荧光底物浸入体外***中。
在蛋白水解酶和荧光底物之间的反应中，切割底物并且从中释放出标志物-荧光团。
在预定的时间，用激发辐射光照测试介质样品以激发标志物的荧光；在预定的时间与光照同时记录样品中标志物荧光的空间分布。
除了记录样品中标志物信号的空间分布之外，可以在预定的时间光照测试介质样品并记录样品的光学特征，光学特征选自由以下所组成的组中：样品中光散射的空间分布、样品中光透射的空间分布或它们的组合。此外，记录纤维蛋白的空间分布。
考虑标志物与介质组分的结合程度，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从标志物荧光的空间分布集合确定蛋白水解酶活性的时空分布。
根据标志物(荧光团)的激发光谱，选择激发波长。选择光照波长以确保最大的信噪比(信号/噪音比率)，具体地，在凝血***研究中，信号是从纤维蛋白凝块的光散射，而噪音是从体外***的血浆及其它成分的光散射。
在该实验中，可以在体外***中加入活化剂以诱导蛋白水解酶活性时空分布的变化。活化剂可以是选自由以下所组成的组中的试剂：固定在表面上的组织因子、可溶性组织因子、组织型纤维蛋白溶酶原活化因子、具有组织因子表达能力的细胞、体组织样品、玻璃或塑料。
在一个实施方式中，在测试介质中由于生物化学过程直接从其酶原形成所进行分析的蛋白水解酶。在另一个实施方式中，由于在介质中发生的生物化学过程，所分析的蛋白水解酶在测试介质中逐渐被破坏。
可以通过在预定的时间提供光学***和光照/辐射处理***重新聚焦的共聚焦显微镜法或通过荧光显微法记录样品中标志物的光散射和荧光的空间分布。
在预定的时间，将标志物和所得凝块的空间分布进一步显像。
使用暗场技术记录从测试介质样品的光散射。
方法的第二实施方式
第二实施方式与第一实施方式的不同点在于底物是生色底物。
在蛋白水解酶和生色底物之间的反应中，切割底物并且从中释放出发色团。用具有一定波长的光光照该***，在所述波长光基本上被发色团所吸收。在预定的时间记录测试介质颜色变化的空间分布。由样品颜色变化的空间分布确定样品中发色团的空间分布。考虑介质中发色团与介质组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从发色团的分布确定蛋白水解酶活性的时空分布。
在预定的时间光照测试介质样品并通过照相机记录样品的光学特征，光学特征选自由以下所组成的组中：样品中光散射的空间分布、样品中光透射的空间分布或它们的组合。
方法的第三实施方式
方法的第三实施方式与第一实施方式的不同在于底物是在与蛋白水解酶的反应中切割以释放化学发光产物的底物。在预定的时间记录样品中发光强度的空间分布。考虑介质中化学发光产物与介质组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从发光的分布确定蛋白水解酶活性的时空分布。
在预定的时间光照测试介质样品并通过照相机记录测试样品的光学特征，光学特征选自由以下所组成的组中：样品中光散射的空间分布、样品中光透射的空间分布或它们的组合。
在该方法的所有实施方式中，在整个体外***中保持均匀的温度，优选在约37℃；出于此目的，对该***进行热调控。为了避免测试样品中形成气泡，体外***中的压力优选维持在高于大气压的水平。样品的pH稳定至7.2-7.4的范围。
可以将底物以溶液形式加入到测试介质样品中。还可以在放置测试介质样品之前，将底物以冻干形式施用于体外***的壁上。
以每分钟1至1800次的频率进行光照和标志物信号的记录。在样品中建立稳定的温度后进行光照。
混合物是从测试血浆样品、接触相抑制剂、氯化钙、对所测试的凝血因子特异的底物制备的；该混合物用于该研究的所有变体。
具体地，样品是全血或血浆，血浆选自由富血小板血浆、无血小板血浆和乏血小板血浆所组成的组中。
具体地，所分析的凝血因子是凝血酶。
根据本发明，还提供了基于非均匀体外***中蛋白水解酶(凝血因子)活性的时空分布的变化，用于诊断止血***中病症的方法，该方法包括作为样品使用血液组分，血液组分选自由以下所组成的组中：全血、无血小板血浆、乏血小板血浆、富血小板血浆、加入抗凝血剂的血液、加入抗凝血剂的血浆。
通过实施至少一种操作提供了用于在测试样品中形成蛋白水解酶和用于观测其的条件，所述操作选自下组：将测试样品与固定在表面上的凝血激活剂接触；加入通过所研究的蛋白水解酶切割的底物；加入钙盐；加入凝血接触激活的抑制剂。
在确定的时间，记录样品内从底物切割的标志物的信号的空间分布。
将样品温度以1度的精度维持稳定在25-45℃的范围内。样品的pH稳定在7.2-7.4的范围内。
考虑介质中的标志物与介质组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从给定时间的标志物信号的空间分布集合确定蛋白水解酶(凝血因子)活性的空间分布。在此基础上，及时计算凝血因子分布的时空分布。
根据蛋白水解酶时空分布的异常，估计止血***的状况。
另外，在确定的时间光照测试样品并记录从测试介质样品中形成的纤维蛋白凝块的光散射的空间分布以使所形成的纤维蛋白凝块显像。
所研究的凝血因子是蛋白水解酶，其选自由以下所组成的组中：凝血酶、因子Xa、因子VIIa、因子IXa、因子XIIa、因子XIa、胞浆素。
使用时空凝血酶或纤维蛋白分布的至少一种参数以评估样品中凝血***的状况并作出诊断；参数应选自下组：凝血酶波的空间传播速率、样品中凝血酶的最大浓度、波运动部分中凝血酶的最大浓度、凝血酶浓度的增长速率、凝血酶浓度根据空间的积分、凝血酶浓度根据时间和空间的积分、纤维蛋白前部(光散射)的空间传播速率、样品中的最大纤维蛋白浓度(光散射量)。
用于实现确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法(其实施的变体)的装置(设备)包括体外***，体外***包含用于放置测试介质的样品21(选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、凝胶和淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶)和分布在测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原的比色杯20(图4)。比色杯20具有特定的几何尺寸和形式、长方形截面并且由塑料制成。
为了减少对流(层越薄，则液体流动下降越快)并且确保快速加热，样品层的厚度应是最小的。为了提高信号强度，则样品层厚度应是最大的。最佳厚度在0.1-1.5mm之间。
该装置进一步包括设计为将引起蛋白水解酶活性时空分布变化的处理激活剂23放置和***到比色杯中的激活装置22。
该装置(设备)进一步包括用于确保体外***中均匀温度的装置24。该装置使得能够进行不同类型的温度控制，包括水温控制和空气温度控制；并且凝胶也可用于温度控制，但是在这种情况下，应考虑介质对辐射必须是透光的。在所描述的实施方式中，使用了水温控制。在温度控制中，以1℃的精度，将温度维持在25-45℃内。该装置还包括用于维持体外***中压力的装置(未显示)；所述装置设计为在围绕测试样品介质的空间中维持恒定的气压(与用于维持均匀温度的装置24一起，它们形成了温度和压力的控制单元25)。该装置维持0.2至0.5atm的超压(excesspressure)，其防止分析的样品中形成气泡。气泡形成是由于样品中所含的溶解气体的溶解度降低所造成的。通常，该现象与加热样品有关。就使介质生理性变差(即偏离模拟条件)而言和就酶分布的计算而言，气泡导致局部变形。
该装置包括用于在预定的时间，在向样品加入荧光底物的情况下用激发标志物荧光的激发辐射或者在向样品加入生色底物的情况下用标志物大量吸收光的波长的光来光照测试介质样品21的装置26。装置26通过恒温器24中的窗口垂直于比色杯20的壁施加辐射。光照装置26包括UV源，例如，UV LED。用于用可见光光照测试介质样品的装置27提供了与比色杯20的壁成一定角度的光。该装置包括用于将辐射引至比色杯的镜28，以及用于提取荧光信号的激发滤光器29和发射滤光器30。光学元件的发射不应导致样品的局部加热。装置26-30的组合形成了光照/照射单元31。
该装置进一步包括用于在预定的时间记录测试介质样品中标志物荧光强度/光散射(或发色团标志物的吸收)的空间分布的单元32。记录单元32包括用于采集样品不同深度的图像的装置，其包括用于聚焦光学器件的光学***33和孔(未显示)。荧光强度取决于分析的蛋白水解酶的活性。来自底物的荧光垂直于比色杯20的壁传播，穿过对该发射光谱透光的镜28，然后穿过发射滤光器30并通过光学***33进入可以是数字照相机的记录装置34。
该装置包括光照/照射开关控制方式，如处理器(未显示)，它控制开/关时间、光照/照射强度和持续时间以及光照/照射方式和记录装置(未显示)操作的同步。
计算装置(未显示)计算蛋白水解酶活性随时间的空间分布。
还将通过暗场技术用于使形成/溶解的凝块显像的装置和用于使标志物(荧光团/发色团)形成/破坏的空间图像显像的装置(未显示)连接到控制装置。
在下文中，在实施的不详尽的实施例中考虑了该装置的运行和限定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法。
材料
使用了以下试剂：磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱；7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)；Z-Gly-Gly-Arg-AMC；玉米胰蛋白酶抑制剂；因子VIII；因子VIII测试；因子VIII缺乏血浆；糖蛋白IIb-IIIa拮抗剂。
血液采集和血浆制备
正常血浆样品获自健康供体的新鲜人血液。以9∶1的体积比将血液采集在3.8％的柠檬酸钠(pH5.5)中。以1600g将血液离心15分钟，然后以10000g将上清液再离心5分钟以获得无血小板血浆；然后，将上清液冷冻并保存在-70℃。在每次实验前，将样品在水浴中解冻。
为了制备富血小板血浆，将血液以100g离心8分钟。通过用无血小板血浆溶解，使血小板浓度达到250000个细胞/μl。为了稳定pH，将28mMHepes加入到血浆(pH7.4)中。
将缺乏一些凝血因子的可商购的血浆解冻并用Hepes处理以稳定pH，如用富血小板血浆进行。
激活剂的制备
如前所述，使用激活剂-固定在塑料表面上的单层组织因子(TF)激活凝血。将激活剂保存在+4至+8℃。
实验
我们在不同的测试介质样品中考虑了空间凝块增长。
A)无血小板血浆中凝块的空间增长
如上所述制备的血浆补充了抑制剂，例如，玉米胰蛋白酶抑制剂(0.2mg/ml)、0.1μM脂质囊泡(20/80摩尔比的磷脂丝胺酸/磷脂酰胆碱)。加入底物Z-GGR-AMC(800μM)以用于监控凝血酶的形成。将样品在37℃培育10分钟，然后加入钙盐，具体地，CaCl2(20mM)。将所研究的样品放入实验比色杯中，并通过激活剂引起凝块的形成，通过使激活剂与制备的血浆样品接触用组织因子覆盖它的表面。
使用专门设计的视频显微***进行实验，该***使得能够同时观察纤维蛋白凝块和蛋白水解酶(具体地，凝血酶)的空间分布或增长。室中的温度维持在37℃，并通过红色(625nm)和紫外(365nm)LED进行光照。当用红光照射时，通过样品的光散射检测凝块的增长(图5a)，并且通过紫外LED激发AMC荧光(图5b)。将多通道发射滤光器用于分离红光散射、AMC发射和激发发射。通过数字CCD照相机检测通过微距透镜(macrolens)的荧光和红光散射。通常每分钟顺序获得1至4次红光和蓝光图像。为了防止AMC烧毁，将LED与照相机同步并且只有在曝光期间(即约0.5秒)打开。
B)富血小板血浆中凝块的空间增长
为了防止凝块收缩，使用25μtg/ml的糖蛋白抑制剂IIb/IIIa。另外，在0.5％低熔融温度琼脂糖凝胶上进行实验，因为在一些情况下即使高浓度的拮抗剂不能完全抑制收缩。
除了使用富血小板血浆代替无血小板血浆外，如上所述制备样品。复钙后，将血浆预热至42℃2分钟。加入琼脂糖溶液，并将混合物在实验的室内培育3分钟以形成凝胶。然后，如上所述开始实验。
数据处理
图像处理
开始，以相同方式处理红光和紫外光图像。为了获得光散射(图6a)或AMC荧光，沿着垂直于激活剂表面的线，在各自范围中测量每一帧(frame)的光强度。将数值平均至150-300条线。
根据光散射图上半极限强度点(half-maximal intensity point)的运动计算凝块增长率。将初始增长率确定为其增长前10分钟中凝块尺寸随时间变化的图的直线化部分的斜率。在凝块增长40分钟后，以相同方式计算稳定速率；当凝块边界远离激活剂时，它对凝块增长的影响变得不明显。
通过校准将AMC荧光强度曲线转化为其浓度曲线。用相同血浆中已知的AMC浓度，计算均匀分布内的强度校准曲线。如下所示，计算每个点(Ci)中的AMC浓度：
C i = ( I i - I bgr ) * C cal ( I cal - I bgr )
其中：Ii是荧光强度，Ibgr是背景强度，Ical是已知的AMC浓度的荧光强度，所有均在帧的相同点中，并且Ccal是AMC的校准浓度。
凝血酶浓度的计算
通过解决下列反应-扩散等式的逆问题，从AMC的一维分布计算出凝血酶的浓度(图6b)：
∂ AMC ∂ t = D AMC ∂ 2 AMC ∂ x 2 + k cat IIa × S K m + S
IIa ( x , t ) = Km + S S × k cat ( ∂ AMC ( x , t ) ∂ t - D AMC ∂ 2 AMC ( x , t ) ∂ x 2 )
其中：AMC、S和IIa分别是AMC、荧光底物和凝血酶的浓度；DAMC是AMC扩散系数；Km、kcat是米氏常数或通过凝血酶的底物切割反应常数。
通过将实验扩散曲线与理论曲线拟合，实验测量了AMC扩散系数。
凝血酶浓度分布的逆问题是病态的，因此实验噪声并且甚至小的AMC曲线失真会导致其不存在解。为了克服这种情况，将数值算法用于降低AMC信号的噪声和失真水平。
AMC信号失真是由于纤维蛋白凝块上光散射的激发造成的。在凝块内部，荧光强度提高。这种提高与AMC浓度和凝块密度成正比。为了克服这种情况和计算真实的AMC浓度，使用了以下公式：
AMC visible = AMC real + ( k 1 + k 2 · AMC real ) Clot k 3
其中，AMCvisible是通过校准获得的AMC浓度；AMCreal是真实的AMC浓度；Clot是由纤维蛋白的光散射强度(scattering of light intensity)；系数ki、k2、k3已通过实验测量。
为了减少噪音，使用了下列导数计算算法：
∂ [ AMC ] ∂ t = 1 J Σ j J [ AMC ] ( x , t + j * Δt ) - [ AMC ] ( x , t ) j * Δt
∂ 2 [ AMC ] ∂ x 2 = 1 I Σ i I [ AMC ] ( x + i * Δx , t ) - 2 · [ AMC ] ( x , t ) + [ AMC ] ( x - i * Δx , t ) ( i * Δx ) 2
其中：Δt帧与帧之间的时间，通常为1分钟；Δx是像素大小(4.3μm)；选择最佳的I和J值，以最小的信号失真最小化噪音。通常，选择J=3和I=40，在这种情况下，求和可以从大于1(unity)的I和J值开始。

Claims (24)

1.一种用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法，所述方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质样品和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原，所述测试介质选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶；
将荧光底物浸入所述体外***中，在通过所述蛋白水解酶切割所提及的底物期间伴随标志物的进一步释放；
在预定的时间，光照所述测试介质样品以激发所述标志物的荧光；
在预定的时间，与所述光照同时记录所述样品中标志物荧光信号的空间分布；
考虑介质中所述标志物与所述介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，由所述标志物的荧光信号的分布集合确定所述蛋白水解酶活性的时空分布。
2.一种用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法，所述方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质样品和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原，所述测试介质选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶；
将生色底物浸入所述体外***中，在通过蛋白水解酶切割所提及的底物期间伴随标志物的进一步释放；
在预定的时间，通过具有对应于由所述标志物大量吸收的光的波长的光照射所述测试介质样品；
在预定的时间，记录所述样品中所述标志物的光吸收的空间分布；
考虑介质中所述标志物与所述介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，从所述标志物的发色团信号的分布集合确定(限定或计算)所述蛋白水解酶活性的时空分布。
3.一种用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的方法，所述方法包括下列步骤：
提供体外***，其包含测试介质样品和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原，所述测试介质选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶；
将发光底物浸入所述体外***中，在通过蛋白水解酶切割所提及的底物期间伴随标志物的进一步释放；
在预定的时间，记录所述样品中所述标志物的发光信号的空间分布；
考虑介质中所述标志物与所述介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，由所述标志物的发光信号的分布集合确定(限定或计算)所述蛋白水解酶活性的时空分布。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，另外将活化剂放入所述体外***中以引起所述蛋白水解酶活性时空分布的变化。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述活化剂是选自由以下所组成的组中的试剂：固定在表面上的组织因子、可溶性组织因子、组织型纤维蛋白溶酶原活化因子、具有组织因子表达能力的细胞、体组织样品、玻璃或塑料。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在预定的时间进行所述测试样品介质另外的光照，并记录所述测试样品的空间参数，所述空间参数选自由以下所组成的组中：样品中光散射的空间分布、样品中光透射的空间分布或它们的组合。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，将所述底物作为溶液加入到所述测试介质样品中。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在将所述测试介质样品放置其中之前，将所述底物以冻干形式施用于所述体外***的壁上。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述测试介质是选自由以下所组成的组中的血浆：富血小板血浆、无血小板血浆和乏血小板血浆。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，以每分钟1至1800次的频率进行光照和所述标志物的荧光信号改变的记录。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述方法的所有步骤均是在约37℃的控制温度进行的。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述方法的所有步骤均是在稳定压力进行的，优选高于大气压。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述测试样品的pH稳定在7.2-7.4的范围内。
14.一种用于确定非均匀***中蛋白水解酶活性的时空分布的装置，所述装置包括：
体外***，其包括放置测试介质样品和分布在所述测试介质样品中的蛋白水解酶或其酶原以及荧光或生色或发光底物的比色杯，所述测试介质选自由以下所组成的组中：血浆、全血、水、淋巴、胶体溶液、晶体溶液或凝胶；
在确定的时间光照所述测试介质样品的装置；
在确定的时间，记录由于通过蛋白水解酶切割所述底物所产生的标志物信号空间分布的装置；
控制光照和记录装置的装置。
15.根据权利要求14所述的装置，包括将提供蛋白水解酶活性的时空分布的变化起始的处理激活剂放置并***比色杯中的激活装置。
16.根据权利要求14所述的装置，包括在所述测试介质样品内提供稳定的温度的装置，优选为37℃。
17.根据权利要求14所述的装置，包括在整个所述测试样品内提供稳定的压力的装置，优选高于大气压。
18.根据权利要求14所述的装置，包括通过暗场技术，通过可见光辐射光照所述测试介质样品的装置。
19.根据权利要求14所述的装置，其中，所述控制光照和记录装置的装置提供调节开/关时间、光照强度以及光照和记录装置之间同步的可能性。
20.根据权利要求14所述的装置，其连接到计算装置，提供及时计算蛋白水解酶活性的空间分布的可能性，或开启该计算装置。
21.一种用于诊断止血***病症的方法，其基于非均匀体外***中蛋白水解酶活性的时空分布的变化，所述方法包括下列步骤：
使用血液组分作为样品，所述血液组分选自由以下所组成的组中：全血、无血小板血浆、乏血小板血浆、富血小板血浆、加入抗凝血剂的血液、加入抗凝血剂的血浆；
通过实施选自下组中的至少一种操作提供用于在测试样品中形成蛋白水解酶和用于观察其的条件：将所述测试样品与固定在表面上的凝血激活剂接触；加入通过所研究的蛋白水解酶切割的底物；加入钙盐；加入凝血接触激活的抑制剂；
在确定的时刻，记录所述样品中从所述底物切割的标志物的信号的空间分布；
考虑介质中标志物与所述介质的组分的结合，通过解决“反应-扩散-对流”型逆问题，由确定时间的标志物信号的空间分布集合确定蛋白水解酶(凝血因子)活性的时空分布；
根据所述蛋白水解酶的时空分布的异常估计所述止血***的状况。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，在确定的时刻另外光照所述测试样品并通过暗场法记录来自在测试介质样品中形成的纤维蛋白凝块的散射光的空间分布。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所研究的凝血因子是蛋白水解酶，其选自下组中：凝血酶、因子Xa、因子VIIa、因子IXa、因子XIIa、因子XIa、胞浆素。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，使用时空凝血酶或纤维蛋白分布的至少一种参数以评估所述样品中凝血***的状况并作出诊断；所述参数应选自下组中：凝血酶波的空间传播速率、样品中凝血酶的最大浓度、波运动部分中凝血酶的最大浓度、凝血酶浓度的增长速率、凝血酶浓度根据空间的积分、凝血酶浓度根据时间和空间的积分、纤维蛋白前部(散射光)的空间传播速率、样品中的最大纤维蛋白浓度(散射光量)。
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Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20140820

Assignee: The Central Laboratory of hemr limited liability company

Assignor: Blood limited liability company

Contract record no.: 2014990000786

Denomination of invention: Method for determining the activity of a proteolytic enzyme (variants), device for the implementation of same and diagnostic method

License type: Common License

Record date: 20140930

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140820