CN103992990A - 一种嗜环弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种嗜环弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用。嗜环弧菌噬菌体于2014年5月9日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.9101，分类命名为嗜环弧菌噬菌体。用该嗜环弧菌噬菌体液对疾病爆发期的刺参进行浸浴或将稀释后该嗜环弧菌噬菌体液进行参池喷洒，每隔5天浸浴或喷洒1次，连续进行3次，每次施用用量≥10⁷pfu/m³养殖水体。噬菌体作为天然的抗菌微生物广泛存在于自然界中，人工筛选、富集并使用噬菌体制剂可代替传统化药、抗生素的使用，具有无公害，无残留，廉价、高效抗菌等特点，是一种应用前景广阔、潜力巨大的天然杀菌剂。

Description

一种嗜环弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用

技术方案 

本发明属于生物技术领域，涉及一株能够特异性裂解嗜环弧菌(Vibrio cyclitrophicus)菌株的噬菌体分离物及其在海参疾病预防领域中的应用，从而提高海参养殖企业的经济效益。 

背景技术

海参(Holothurioidea)是中国北方沿海地区产值最大的海水养殖动物之一。据统计，目前我国海参养殖面积近9万公顷，产量近10万吨，年产值100多亿元(中国海参学术研究与产业发展论坛，2009)，而在2012年，全国年产值突破300亿。然而，近年随着刺参养殖规模和养殖密度的迅速增大，养殖水体逐渐恶化，病害问题也日趋严重。嗜环弧菌(Vibrio cyclitrophicus)是由大连理工大学生命科学与技术学院动物生物技术与营养实验室在2011年于患病海参中发现的一种菌，能引起幼年海参的皮肤溃烂，与其它刺参腐皮病致病菌一起，严重限制海参养殖业的持续健康发展。 

目前，常采用抗生素类药物治疗由细菌引起的刺参腐皮病，结果将会导致大量的耐药菌株的出现，并破坏养殖环境微生态的平衡，对海参养殖造成进一步危害，因此需要一种新型抗菌制剂用来预防海参疾病的发生。 

噬菌体是一种可以感染细菌的病毒。裂解性噬菌体(以下简称噬菌体)在感染细菌后，能引起宿主细胞破裂，利用这一特性可以将噬菌体应用于抗菌治疗。上世纪70-80年代，细菌耐药性问题，特别是超级细菌的出现，应用抗生素进行抗菌治疗面临着巨大挑战，有关噬菌体作为抗菌制剂的研究受到普遍关注。目前，在美国以及一些东欧国家，噬菌体已经成功地应用于动物性食品生产过程中，控制沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7李斯特菌、金黄色葡萄球菌等细菌 性感染的防治，并有一些产品面世，在控制动物细菌性疾病方面彰显优势。因此，在水产动物疾病的预防控制方面，也迫切需要通过噬菌体来进行治疗。近年来，研究发现噬菌体治疗能有效防治水产动物细菌性疾病。如利用噬菌体防治鰤鱼格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)感染、香鱼冷水病、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)感染、对虾哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病以及河流弧菌(Vibrio fluvialis)引起的皱纹盘鲍脓疱病等。 

本发明中的噬菌体分离物是从自然界中分离的烈性噬菌体，经小鼠安全性实验证明其安全、无毒副作用，并对嗜环弧菌具有强烈的裂解作用。该噬菌体经纯化后有望开发成为生物杀菌剂防控由嗜环弧菌引起的海参疾病。 

发明内容

本发明提供了一种应用裂解性噬菌体预防海参养殖中由嗜环弧菌引起的疾病，降低由该病引起的死亡率，可提高海参养殖企业经济效益的技术方法。 

本发明的技术方案是提供一种嗜环弧菌噬菌体(Vibrio cyclitrophicus)，该噬菌体于2014年4月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.9101，分类命名为嗜环弧菌噬菌体。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该嗜环弧菌噬菌体(Vibrio Phage Vc1)为有尾噬菌体目，长尾噬菌体科，头部衣壳直径为42±3nm，尾部长146±10nm、宽8nm；一步生长曲线表明该噬菌体感染宿主菌的潜伏期约35min，裂解量约218PFU/感染细胞，裂解性较强。 

本发明中噬菌体经小鼠安全性实验，腹腔注射给予噬菌体实验组10⁹pfu/kg的噬菌体液，对照组给予等量生理盐水，连续给予20天后，将小鼠脱颈处死，尸检，其肺部、肝脏、肾脏、腹腔均未发现病变症状，初步验证该噬菌体制剂 的安全性。嗜环弧菌噬菌体在海参疾病预防中的应用，用该嗜环弧菌噬菌体液对疾病爆发期的刺参进行浸浴或将稀释后该嗜环弧菌噬菌体液进行参池喷洒，每隔5天浸浴或喷洒1次，连续进行3次，每次施用用量≥10⁷pfu/m³养殖水体，以达到治疗或预防相应疾病的效果。 

本发明的有益效果： 

1.海参腐皮病是海参养殖过程中严重的细菌性疾病，施用噬菌体后，可防治由相应细菌引起的海参腐皮病，提高海参成活率，减少经济损失。 

2.使用噬菌体控制嗜环弧菌，替代抗生素防治海参腐皮病，可减少抗生素在海参养殖过程中的使用量，降低耐药菌株的出现几率，提高抗生素治疗其他疾病的作用效果。 

3.噬菌体作为天然的抗菌微生物广泛存在于自然界中，人工筛选、富集并使用噬菌体制剂可代替传统化药、抗生素的使用，具有无公害，无残留，廉价、高效抗菌等特点，是一种应用前景广阔、潜力巨大的天然杀菌剂。 

附图说明

图1是透射电镜观察噬菌体Vibrio Phage Vc1形态。 

图2是噬菌体Vibrio Phage Vc1的一步生长曲线。 

具体实施方式

以下结合附图和技术方案具体说明本发明的具体实施方式。 

实施例1 

噬菌体的筛选和纯化 

(一)水样采集及处理 

(1)宿主菌的准备 

将溶藻弧菌经细菌学鉴定后接种于2216E固体培养基中，保存于4℃冰箱 中。筛选用宿主菌经28℃过夜培养，挑取单个菌落，接种于2216E液体培养基中，28℃振荡培养8h后，用来分离噬菌体用。 

(2)水样的处理 

取来自于大连某刺参养殖场及大连市某水产市场排污口废水样品各200mL，对水样做预处理：加入CaCl2、MgCl₂，使其终浓度为1mmol/L，作用大约10min。 

(二)水样噬菌体的富集 

将上述经过预处理的水样，10000g离心5min，收集上清；将上清过0.22μm滤膜，除菌体、杂质等其他成分，即得噬菌体原液；取10mL滤液加入处于对数生长期(接种后5h左右，噬菌体终浓度达到10⁶-10⁷CFU/mL时，即对数生长期)的50mL菌液中，28℃过夜培养12-18h，目的是使噬菌体数量扩增，观察并记录；收集菌液，10000g离心5min，收集上清，再过滤膜(0.22μm)，即得增殖后的噬菌体上清液。 

(三)噬菌体的筛选 

采用双层平板法进行噬菌体的鉴定，下层为1.5％琼脂的2216E固体培养基，置于4℃备用，用前放于28℃，约30min；上层为0.5％琼脂2216E培养基，将上层培养基加热溶解，放置于50℃的水浴锅中待用，取8支10mL离心管，分别加1mL宿主菌液，吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至10^-6，将7种不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出10μL，加到10mL离心管中，设置一个对照组，仅加入1mL宿主菌液和10μL2216E培养基，在28℃下作用10min，加入5mL含0.5％琼脂的2216E培养基充分混匀后，立刻加到上层，待凝固后，倒置培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。 

(四)噬菌体的纯化 

初次分离的噬菌斑的大小、形状不一致，对分离的噬菌体进一步的纯化，使噬菌体在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑。用无菌200μL枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个，将其分别加入到1mL无菌PBS的离心管中，涡旋震荡1min，置于4℃,4h，使噬菌体充分释放入PBS中；4℃、10000g离心5min，收集上清，过膜(0.22μm)，将噬菌体虑液进行梯度稀释，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化噬菌体。噬菌体电镜照片见附图1。 

(五)噬菌体的富集与扩增 

采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下：将噬菌体液按一定比例加入到培养12h的宿主菌液中，再于28℃摇床中培养12h，将混合液于4℃、10000g离心5min，去处细菌碎片，上清液用0.22μm的滤膜过滤，即可获得高效价的噬菌体富集液。 

实施例2 

噬菌体一步生长曲线测定 

噬菌体感染复数(multiplicity of infection,MOI)是指初始感染时加入噬菌体和宿主菌数量的比值。在宿主菌液中加入感染复数为0.1的噬菌体，混匀，28℃静置，吸附15min；4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用2216E液体培养基重悬，重复上述离心操作，除尽未吸附的噬菌体。沉淀重悬于100mL2216E液体培养基中，此时计时为T₀＝0；28℃120rpm培养，每隔10min取样测定噬菌体效价。 

结果显示，该噬菌体感染宿主菌的潜伏期约35min，裂解量约218PFU/cell，裂解性较强，结果见附图2。 

实施例3 

噬菌体宿主谱分析 

考察筛选的噬菌体对不同细菌的裂解能力，构建噬菌体的宿主谱。选用的细菌包括： 

分离的病原菌嗜环弧菌(Vibrio cyclitrophicus)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)ABTNL01、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)1H00047、哈维弧菌(Vibrio harveyi)1H00040、塔式弧菌(Vibrio tubiashii)1H00065、叶氏假交替单胞菌(Pseudoalteromonas elyakovii)1B00018、产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)1B00017、志贺氏菌(Shigella sp.)1B00019、海底嗜冷杆菌(Psychrobacter submarinus)1B00013。结果如下表所示：该噬菌体只能裂解其宿主菌嗜环弧菌，宿主专一性强。 

表1 噬菌体Vc1的宿主谱 

注1)：裂解记为“+”；不能裂解记为“-” 

实施例4 

噬菌体防治由嗜环弧菌引起的海参疾病应用效果分析 

取购自大连某海参养殖厂健康海参40只，随机分成四组，每组10只，采用浸浴方式处理各组。 

第一组：阴性对照组。加入菌液至终浓度为2×10⁶CFU/mL。 

第二组：阳性对照组。加入菌液至终浓度为2×10⁶CFU/mL，6h后加入硫酸卡那霉素至终浓度10mg/L。 

第三组：噬菌体预防性实验组。加入噬菌体至终浓度2×10⁷PFU/mL，6h后加入菌液至终浓度为2×10⁶CFU/mL。 

第四组：噬菌体治疗性实验组。加入菌液至终浓度为2×10⁶CFU/mL，6h后加入噬菌体至终浓度2×10⁷PFU/mL(MOI＝10)。 

观察各组刺参的生存状态，统计存活率，结果如下表所示： 

表2 噬菌体Vibrio Phage Vc1治疗由VDL-1感染的刺参 

Claims (2)

1.一种嗜环弧菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体于2014年4月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.9101，分类命名为嗜环弧菌噬菌体。 

2.一种嗜环弧菌噬菌体在海参疾病预防中的应用，其特征在于，用嗜环弧菌噬菌体液对疾病爆发期的刺参进行浸浴或将稀释后的嗜环弧菌噬菌体液进行参池喷洒，每隔5天浸浴或喷洒1次，连续进行3次，每次施用用量≥10⁷pfu/m³养殖水体。