CN112481221A - 迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用 - Google Patents

迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种迟钝爱德华氏菌高效烈性噬菌体vB_EtaM‑IME523及其应用，涉及迟钝爱德华氏菌污染和感染的生物处理。vB_EtaM‑IME523保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18191。vB_EtaM‑IME523具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约为95nm，可以收缩的尾部，长度约为125nm；vB_EtaM‑IME523在迟钝爱德华氏菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑，可裂解迟钝爱德华氏菌，使菌液澄清化；vB_EtaM‑IME523对动物有明显的保护作用。vB_EtaM‑IME523的应用，用于特异性地抑制、杀死迟钝爱德华。

Description

迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用
技术领域
本发明涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种迟钝爱德华氏菌高效烈性噬菌体 vB_EtaM-IME523及其应用。
背景技术
为了防控疾病，抗生素和化学消毒剂被长期、广泛使用。然而，抗生素易诱发细菌产生 耐药性，形成″超级细菌″，严重威胁人类和动物健康；抗生素和化学消毒剂没有专一性，破 坏我们依赖的正常菌群，损害健康并危害环境的生态平衡；抗生素和化学消毒剂在养殖产品 中残留，被人体摄入后，会影响肠道细菌群落、抑制免疫***，危害人类健康。
噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。裂解性噬菌体又称为烈性噬菌体或者毒性噬 菌体(virulent phage)。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、 植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而 消亡，不会残留在动物体内。烈性噬菌体安全性高，是最具潜力的抗生素替代品，在抗菌药 物研发方面具有巨大的潜力和优势。
迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，爱德华氏菌属 (Edwardsiella)的代表菌，该菌为革兰氏阴性、兼性厌氧菌，分布非常广泛，是“人-兽-鱼” 共患性条件致病菌，能够引起各类哺乳动物以及鱼、虾、蟹、鳖等感染发病，可导致腹泻、 败血症、腰大肌与硬膜外脓肿等，甚至可引起死亡。摄食迟钝爱德华氏菌污染的水产品可能 造成严重的食源性感染。近年来，迟钝爱德华氏菌引发的鱼类病害屡见不鲜，在水产养殖当 中，由迟钝爱德华氏菌引发的病害曾在全国多省份暴发性流行，给养殖户造成了巨大的经济 损失。研发能够高效裂解迟钝爱德华氏菌的噬菌体具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、快速地裂解迟钝爱德华氏菌的新的噬菌 体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解迟钝爱德华氏菌，对动物有保护作用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以致病性迟钝爱德华氏菌为靶标分 离获得的特异侵染迟钝爱德华氏菌的新的裂解性噬菌体，依据噬菌体命名原则命名为 vB_EtaM-IME523(vB_EtaM即Virus of bacteria，Edwardsiella tarda，Myoviridae的缩写； IME523为株号)，其分类上属于肌尾科Myoviridae。vB_EtaM-IME523于2019年7月10日， 保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18191，保藏 机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 噬菌体vB_EtaM-IME523对动物有保护作用，对斑马鱼的相对保护率为46.7％。
该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_EtaM-IME523具有呈现二十面体近似球形的头 部，直径约为95nm，可以收缩的尾部，长度约为125nm；噬菌体vB_EtaM-IME523在迟钝爱 德华氏菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_EtaM-IME523可裂解迟钝爱德华氏 菌，使菌液澄清化；vB_EtaM-IME523的宿主范围具有种特异性。
上述噬菌体vB_EtaM-IME523的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)迟钝爱德华氏菌的活化、培养
迟钝爱德华氏菌来源于军事医学科学院流行病学研究所。取迟钝爱德华氏菌菌种划线接 种于含1.5％(W/V)琼脂的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落， 接种到装有5mL LB液体培养基的试管内，摇床(37℃、220rpm)培养12小时。从试管中取 1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(37℃、220rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.5，即得到对数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_EtaM-IME523分离自北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水(North latitude：39.8622002；East longitude：116.2957407)。将5L污水用中性滤纸进行过滤处理后， 离心12000rpm，5min，收集上清；将上清用0.22μm的滤器过滤后，装入30kD的透析袋中， 在透析袋周围撒上PEG8000进行浓缩，过夜后，收集透析袋中剩余液体；取200μL该液体加 入5mL用LB液体培养基培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；将 该混合培养液于12000rpm离心2min，收集上清，上清用0.22μm的滤器过滤细菌，所得滤液 即为噬菌体富集后的原液。
以常规LB固体培养基(含1.5％琼脂)平板为下层平板，取500μL培养至对数期的迟钝 爱德华氏菌加入42-45℃上层半固体LB培养基(含0.7％琼脂)中，立即混匀并倾倒至下层平 板上，待上层平板凝固后。取噬菌体富集后的原液滴入对应的双层平板中，共滴三个区，每 个滴2μL；对照区滴PBS作为对照。滴液被培养基吸收后，将双层平板倒置于37℃恒温培养 箱培养9h，观察、确定噬菌环的出现。
(3)噬菌体的纯化培养
取100μL确认可导致噬菌环的噬菌体富集后的原液，用PBS缓冲液梯度稀释至8个滴 度(10-1～10-8)，各取100μL稀释液与500μL培养至对数期(OD600值约为0.5左右)的迟 钝爱德华氏菌混合均匀，静置孵育10min，然后将混合液体分别加入5mL 42-45℃的上层半 固体LB培养基中，立即混匀并含有下层固体LB培养基的培养皿中，凝固后倒置37℃培养 箱中培养9h；从噬菌斑分布均匀的双层平板中，用剪口的无菌枪头挑取形态大小有差异的 噬菌斑分别接种至5mL的培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养； 将过夜培养液12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；取过滤液 重复上述双层平板噬菌斑试验，三代后得到的噬菌斑形态大小均一，取第三代噬菌斑和对数 期迟钝爱德华氏菌液的混合培养液离心12000rpm离心2min，上清经0.22μm的滤器过滤， 过滤液即为纯化培养的噬菌体悬液。
(4)噬菌体的扩大培养
取迟钝爱德华氏菌单克隆菌落至液体LB培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；然后取该菌液100μL接种于5mL的LB液体培养基中，共接3管，标记为1，2，3，37℃，220 rpm培养至对数期；将管1的菌液加入至1000mL的新鲜配制的无菌LB液体培养基中，37℃， 220rpm培养至对数期；将500μL步骤(3)纯化培养的噬菌体悬液接种至管2中，37℃， 220rpm培养5h；管3为管2的对照组，加入500μL的LB培养基，37℃，220rpm培养5 h，用于判断管2内菌液裂解程度；将管2内培养液分装于离心管中，12000rpm离心2min 收集上清，加入已培养至对数期的1000mL宿主菌液中，37℃，220rpm过夜培养。
(5)噬菌体的浓缩与纯化
将步骤(4)制备的1000mL的噬菌体裂解培养物于12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；在每个50mL的超速离心管(Beckman公司)各加25mL 的该滤液，然后用注射器从底部慢慢加入8mL的20％(w/v)的蔗糖溶液，再从底部慢慢 加入4mL的50％(w/v)的蔗糖溶液，4℃，27500rpm/min离心3h；吸取离心管中的噬菌 体沉淀至100kD的透析袋中，用SM缓冲液透析12h以去除蔗糖；收集透析液至新的50mL 的超速离心管中，如上所述从离心管底部依次加入20％、50％的蔗糖后离心，取噬菌体沉淀 至100kD的透析袋中，用SM缓冲液透析12h以去除蔗糖，如此重复两次；收集最后一次 透析的透析液至30kD的超滤管中，3500rpm，10min离心，收集上层液体即为浓缩、纯化 的噬菌体。
上述裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523的应用，用于抑制迟钝爱德华氏菌生长、杀死迟钝 爱德华氏菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种迟钝爱德华氏菌裂解性噬菌体 vB_EtaM-IME523及其分离方法和应用，vB_EtaM-IME523的基因组序列不存在于已有数据 库中，是一株未被报导的新的噬菌体；该病毒具有高特异性，专一性感染、裂解迟钝爱德华 氏菌，这是保证生态安全的重要前提；此裂解病毒vB_EtaM-IME523的大量培养、纯化较为 容易，操作简单，成本低廉，且不会造成环境污染；vB_EtaM-IME523对动物有明显的保护 作用。
综上所述，本发明提供一种新的迟钝爱德华氏菌裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其分 离方法和应用，该噬菌体可高效、快速、专一地感染、杀死迟钝爱德华氏菌，对动物有明显 的保护作用。
附图说明
图1为噬菌体vB_EtaM-IME523在迟钝爱德华氏菌双层平板上的噬菌斑形态
图2左侧试管为迟钝爱德华氏菌对照菌液，右侧试管中的菌液因添加了噬菌体vB_EtaM-IME523而变澄清
图3为负染的噬菌体vB_EtaM-IME523的透射电镜图
图4为动物保护实验中实验组与对照组斑马鱼，处于上部的鱼属于添加了噬菌体vB_EtaM-IME523的实验组；处于下部的鱼属于对照组，因迟钝爱德华氏菌感染呈现肿胀。
图5为动物保护实验各组斑马鱼的累积死亡率折线图
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
实施例1
噬菌体vB_EtaM-IME523的分离纯化
(1)迟钝爱德华氏菌的活化、培养
取迟钝爱德华氏菌菌种划线接种于含1.5％(W/V)琼脂的LB固体培养基平板上，37℃倒 置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管内，摇床(37℃、 220rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(37℃、220rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.5，即得到对 数期菌液。
(2)噬菌体的富集
噬菌体vB_EtaM-IME523分离自北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水(North latitude：39.8622002；East longitude：116.2957407)。将5L污水用中性滤纸进行过滤处理后， 离心12000rpm，5min，收集上清；将上清用0.22μm的滤器过滤后，装入30kD的透析袋中， 在透析袋周围撒上PEG8000进行浓缩，过夜后，收集透析袋中剩余液体；取200μL该液体加 入5mL用LB液体培养基培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；将 该混合培养液于12000rpm离心2min，收集上清，上清用0.22μm的滤器过滤细菌，所得滤液 即为噬菌体富集后的原液。
以常规LB固体培养基(含1.5％琼脂)平板为下层平板，取500μL培养至对数期的迟钝 爱德华氏菌加入42-45℃上层半固体LB培养基(含0.7％琼脂)中，立即混匀并倾倒至下层平 板上，待上层平板凝固后。取噬菌体富集后的原液滴入对应的双层平板中，共滴三个区，每 个滴2μL；独照区滴0.01M的PBS作为对照。滴液被培养基吸收后，将双层平板倒置于37℃ 恒温培养箱培养9h，观察、确定噬菌环的出现。
(3)噬菌体的纯化培养
取100μL确认可导致噬菌环的噬菌体富集后的原液，用0.01M的PBS缓冲液梯度稀释至8个滴度(10-1～10-8)，各取100μL稀释液与500μL培养至对数期(OD600值约为0.5 左右)的迟钝爱德华氏菌混合均匀，静置孵育10min，然后将混合液体分别加入5mL 42-45℃ 的上层半固体LB培养基中，立即混匀并含有下层固体LB培养基的培养皿中，凝固后倒置 37℃培养箱中培养9h；从噬菌斑分布均匀的双层平板中，用剪口的无菌枪头挑取形态大小 有差异的噬菌斑分别接种至5mL的培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过 夜培养；将过夜培养液12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤； 取过滤液重复上述双层平板噬菌斑试验，三代后得到的噬菌斑形态大小均一，取第三代噬菌 斑和对数期迟钝爱德华氏菌液的混合培养液离心12000rpm离心2min，上清经0.22μm的 滤器过滤，过滤液即为纯化培养的噬菌体悬液。
(4)噬菌体的扩大培养
取迟钝爱德华氏菌单克隆菌落至液体LB培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；然后取该菌液100μL接种于5mL的LB液体培养基中，共接3管，标记为1，2，3，37℃，220 rpm培养至对数期；将管1的菌液加入至1000mL的新鲜配制的无菌LB液体培养基中，37℃， 220rpm培养至对数期；将500μL步骤(3)纯化培养的噬菌体悬液接种至管2中，37℃， 220rpm培养5h；管3为管2的对照组，加入500μL的LB培养基，37℃，220rpm培养5 h，用于判断管2内菌液裂解程度；将管2内培养液分装于离心管中，12000rpm离心2min 收集上清，加入已培养至对数期的1000mL宿主菌液中，37℃，220rpm过夜培养。
(5)噬菌体的浓缩与纯化
将步骤(4)制备的1000mL的噬菌体裂解培养物于12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；在每个50mL的超速离心管(Beckman公司)各加25mL 的该滤液，然后用注射器从底部慢慢加入8mL的20％(w/v)的蔗糖溶液，再从底部慢慢 加入4mL的50％(w/v)的蔗糖溶液，4℃，27500rpm/min离心3h；吸取离心管中的噬菌 体沉淀至100kD的透析袋中，用SM缓冲液透析12h以去除蔗糖；收集透析液至新的重50 mL的超速离心管中，如上所述从离心管底部加入20％、50％的蔗糖后离心，取噬菌体层液 体透析，如此重复两次；收集最后一次透析的透析液至30kD的超滤管中，3500rpm，10min 离心，收集上层液体即为浓缩、纯化的噬菌体。
将纯化的噬菌体vB_EtaM-IME523与对数生长期的迟钝爱德华氏菌感染混合，进行噬菌 斑实验，可以得到透明的圆形噬菌斑，其周围无晕环，边缘清晰规则(图1)。将噬菌体vB_EtaM-IME523添加至迟钝爱德华氏菌菌液后，菌体裂解菌液变得澄清(图2)。
其中LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min；SM缓冲液的配方如下：氯化钠5.8g，硫酸镁 2.0g，1mol/L Tris-HCl 50mL，2％明胶5mL，加水至1L，pH7.5，121℃高压灭菌20min； 0.01M的PBS配方如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，加水 至1L，pH7.4，121℃高压灭菌20min。
该纯化的噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.18191，保藏日期2019年7月10日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2
噬菌体vB_EtaM-IME523的形态观察
取实施例1所分离纯化的噬菌体-菌培养裂解液低速离心(4℃，12000g，15min)弃沉 淀，取1mL上清液高速离心(4℃，58000g，1h)弃上清，沉淀加入200μL的0.01M PBS 悬浮，得到噬菌体悬液。用移液枪取一滴噬菌体悬液至铜网上，静置10min后用中性滤纸从 侧面吸去多余水分。在铜网上滴一滴3％乙酸双氧铀，染色20s后，用中性滤纸从侧面吸去 染色剂。静置10min晾干后使用透射电镜(日立H-7650)观察噬菌体形态。
结果如图2所示，该噬菌体vB_EtaM-IME523具有呈现二十面体近似球形的结构的头部， 直径约为95nm，尾部长度约为125nm。
实施例3
噬菌体vB_EtaM-IME523对动物的保护实验
购买体长3-4厘米的健康斑马鱼作为实验对象，将斑马鱼分为三组，分别为实验组、对 照组和空白组。实验组和对照组水体添加原始浓度为5.6×109CFU/mL的迟钝爱德华氏菌， 使其终浓度为1×108CFU/mL，三个小时后往实验组水体中添加原始浓度为2×1011PFU/mL 的vB_EtaM-IME523，使其终浓度为1×108PFU/mL；对照组用与噬菌体等体积的SM缓冲 液代替。空白组水体不做任何处理。每日投饲两次，观察记录斑马鱼状况。实验进行到第8 天时再次在实验组和对照组中补充一次迟钝爱德华氏菌，在实验组中补充一次噬菌体，补充 量与初次相同。
空白组实验鱼如常。而截至第12天实验结束，对照组累积死亡率为100％，实验组累积 死亡率为53.3％(表1；图5)。实验组累计死亡率比对照组小46.7％，即噬菌体 vB_EtaM-IME523对斑马鱼的相对保护率为46.7％。
表1噬菌体vB_EtaM-IME523动物保护实验中斑马鱼存活数
Figure BSA0000190666420000071
上述结果显示，噬菌体vB_EtaM-IME523对受迟钝爱德华氏菌感染的斑马鱼有明显的保 护作用。
实施例4
噬菌体vB_EtaM-IME523的宿主范围检定
将迟钝爱德华氏菌及其他待试菌株(详见表2)分别培养至对数期(OD600≈0.6)。其中， 来自海洋环境的菌(见表2右侧列)采用LB海水培养基，来自陆地的菌(见表2左侧列)采用LB培养基培养。将这些对数期菌液与噬菌体vB_EtaM-IME523悬液分别按按体积100∶1混合作为实验组，对照组用相应培养基代替噬菌体，每组设两个平行，各组均置摇床上培养过夜。其中海洋来源菌的培养条件是29℃、180rpm；来自陆地菌的培养条件是37℃、220rpm。过夜孵育后，用酶标仪测出各组的OD600值，取平行组平均值，计算对照组与实验组平均 值的比值。若比值大于1.2认为噬菌体可感染该菌，为阳性结果；反之则认为噬菌体不能感 染该菌，为阴性结果；肉眼、显微镜观察感染、裂解情况，确认OD600法判定的结果。结果 vB_EtaM-IME523对宿主感染有种特异性和株特异性，只感染、裂解陆地来源的致病性迟钝 爱德华氏菌。
表2噬菌体vB_EtaM-IME523的宿主范围检定结果
Figure BSA0000190666420000081
Figure BSA0000190666420000091
“+”代表感染，“-”代表不感染
其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用过滤海水定容至1L， 调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人 员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围， 本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18191。
2.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：是以致病性迟钝爱德华氏菌为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_EtaM-IME523；vB_EtaM-IME523使致病性迟钝爱德华氏菌菌液澄清化，在其菌平板上可以形成透明的噬菌斑。
3.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径95nm，以及可收缩的尾部，长度为125nm。
4.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水，位置为North latitude：39.8622002，East longitude：116.2957407；具体制备方法如下：
(1)迟钝爱德华氏菌的活化、培养
取迟钝爱德华氏菌菌种划线接种于含1.5％琼脂的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管内，摇床上于37℃、220rpm培养12小时；从试管中取1mL培养液稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床上37℃、220rpm培养至菌液OD600≈0.5，即得到对数期菌液；
其中所用的LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min；
(2)噬菌体的富集
取北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水，用中性滤纸进行过滤处理后，离心12000rpm、5min，收集上清；将上清用0.22μm的滤器过滤后，装入30kD的透析袋中，在透析袋周围撒上PEG8000进行浓缩，过夜后，收集透析袋中剩余液体；取200μL该液体加入5mL用LB液体培养基培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；取将该混合培养液于12000rpm离心2min，收集上清，上清用0.22μm的滤器过滤，所得滤液即为噬菌体富集后的原液；
以常规含1.5％琼脂的LB固体培养基平板为下层平板，取500μL培养至对数期的迟钝爱德华氏菌加入42-45℃的含有0.7％琼脂的半固体LB培养基中，立即混匀并倾倒至下层平板上，待上层平板凝固后，取噬菌体富集后的原液滴入对应的双层平板中，共滴三个区，每个滴2μL；对照区滴0.01M PBS作为对照。滴液被培养基吸收后，将双层平板倒置于37℃恒温培养箱培养9h，观察、确定噬菌环的出现；
其中，0.01M的PBS配方如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，加水至1L，pH7.4，121℃高压灭菌20min；
(3)噬菌体的纯化培养
取100μL确认可导致噬菌环的噬菌体富集后的原液，用0.01M PBS缓冲液梯度稀释至8个稀释度(10-1～10-8)，各取100μL稀释液与500μL培养至对数期的迟钝爱德华氏菌混合均匀，静置孵育10min，然后将混合液体分别加入5mL 42-45℃的上层半固体LB培养基中，立即混匀，倾倒于含有下层固体LB培养基的培养皿中，凝固后倒置37℃培养箱中培养9h；从噬菌斑分布均匀的双层平板中，用剪口的无菌枪头挑取噬菌斑分别接种至5mL的培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；将过夜培养液12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；取过滤液重复上述双层平板噬菌斑试验，三代后得到的噬菌斑形态大小均一，取第三代噬菌斑和对数期迟钝爱德华氏菌液的混合培养液离心12000rpm离心2min，上清经0.22μm的滤器过滤，过滤液即为纯化培养的噬菌体悬液。
(4)噬菌体的扩大培养
取迟钝爱德华氏菌单克隆菌落至液体LB培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；然后取该菌液100μL接种于5mL的LB液体培养基中，共接3管，标记为1，2，3，37℃，220rpm培养至对数期；将管1的菌液加入至1000mL的新鲜配制的无菌LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；将500μL步骤(3)纯化培养的噬菌体悬液接种至管2中，37℃，220rpm培养5h；管3为管2的对照组，加入500μL的LB培养基，37℃，220rpm培养5h，用于判断管2内菌液裂解程度；将管2内培养液分装于离心管中，12000rpm离心2min收集上清，加入已培养至对数期的1000mL宿主菌液中，37℃，220rpm过夜培养；
(5)噬菌体的浓缩与纯化
将步骤(4)制备的1000mL的噬菌体裂解培养物于12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；在每个50mL容量的的Beckman公司超速离心管中各加25mL的该滤液，然后用注射器从底部慢慢加入8mL的20％的蔗糖溶液，再从底部慢慢加入4mL的50％的蔗糖溶液，4℃，27500rpm/min离心3h；吸取离心管中的噬菌体沉淀至100kD的透析袋中，用SM缓冲液透析12h以去除蔗糖；收集透析液至新的50mL的超速离心管中，如上所述从离心管底部依次加入20％、50％的蔗糖后离心，取噬菌体沉淀至100kD的透析袋中，用SM缓冲液透析12h以去除蔗糖，如此重复两次；收集最后一次透析的透析液至30kD的超滤管中，3500rpm，10min离心，收集上层液体即为浓缩、纯化的噬菌体vB_EtaM-IME523；
其中，SM缓冲液的配方如下：氯化钠5.8g，硫酸镁2.0g，1mol/L Tris-HCl 50mL，2％明胶5mL，加水至1L，pH7.5，121℃高压灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523的应用，其特征在于宿主具有种特异性和株特异性，专一性感染、裂解高致病性迟钝爱德华氏菌。
6.根据权利要求5所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523的应用，其特征在于对高致病性迟钝爱德华氏菌具有强烈的裂解作用，可用于抑制、杀死高致病性迟钝爱德华氏菌。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523的应用，其特征在于对动物尤其梭子蟹具有保护作用。
8.根据权利要求1-7任意一项所述所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523的应用，其特征在于可用于但不限于制备生物制剂，这些生物制剂可用于病害防控和食品包括水产品、生产环境或生产器具的消毒。
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