CN108640968A - 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途 - Google Patents

一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108640968A
CN108640968A CN201810595613.2A CN201810595613A CN108640968A CN 108640968 A CN108640968 A CN 108640968A CN 201810595613 A CN201810595613 A CN 201810595613A CN 108640968 A CN108640968 A CN 108640968A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
aspergillus terreus
inflammatory drug
meroterpenoids
aspergillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810595613.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108640968B (zh
Inventor
吴长景
刘晓萌
崔香
杨明生
李博
宋亚杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhoukou Normal University
Original Assignee
Zhoukou Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhoukou Normal University filed Critical Zhoukou Normal University
Priority to CN201810595613.2A priority Critical patent/CN108640968B/zh
Publication of CN108640968A publication Critical patent/CN108640968A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108640968B publication Critical patent/CN108640968B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J73/00—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms
    • C07J73/001—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms by one hetero atom
    • C07J73/003—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms by one hetero atom by oxygen as hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。该混源萜类化合物的结构如式I所示，其制备方法为将海洋来源土曲霉ML‑44发酵物经提取、分离纯化得到。本发明具有抑制LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，表明具有抗炎活性，因此可用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病，为开发新型抗炎药物提供先导化合物。

Description

一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途
技术领域
本发明涉及一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。
背景技术
混源萜用于描述通过异戊烯基途径杂合其他生物合成途径形成的天然产物，具有复杂多变的结构多样性，进而显示了多种多样的生物活性。部分该类化合物已作为治疗药物用于临床，如抗肿瘤药物长春花碱、免疫抑制剂霉酚酸酯、乙酰胆碱酯酶抑制剂土震素B等。Terretonins是一类以3,5-demethylorsellinic acid（DMOA）和arnesylpyrophosphate（FPP）为合成前体的真菌来源混源萜类化合物，主要从曲霉菌发酵产物中分离得到（Guo et al., Molecular genetic characterization of a cluster in A. terreus for biosynthesis of the meroterpenoid terretonin. Org Lett. 2012, 14:5684–5687）。截止目前，Terretonin（Springer, Terretonin, a toxic compound fromAspergillus terreus. J Org Chem, 1979, 44: 4852–4854）及其结构类似物terretonins A–D（Li et al., Sesterterpenoids, terretonins A-D, and analkaloid, asterrelenin, from Aspergillus terreus. J Nat Prod, 2005, 68:1243–1246）、H–K（Matsuda et al., Uncovering the unusual D-ring construction interretonin biosynthesis by collaboration of a multifunctional cytochrome P450and a unique Isomerase. J Am Chem Soc, 2015, 137:3393–3401）和M（Shaaban et al.Terretonin M: A new meroterpenoid from the thermophilic Aspergillus terreusTM8 and revision of the absolute configuration of penisimplicins. Nat ProdRes, 2017, doi: 10.1080/14786419.2017.1419230）均分离自土曲霉Aspergillus terreus发酵物中，分子中存在式I中显示的一个独特的骈四环结构母核，且天然产物的绝对构型一致，其中14-H为β取向。近期发现的两个结构类似物，“terretonin H”和“terretonin I”分离自海洋来源焦曲霉Aspergillus ustus（Oleinikova et al., Twonew sesterterpenoids, terretonins H and I, from the marine-derived fungusAspergillus ustus. Phytochem Lett, 2016, 17:135–139），与上述化合物相比其结构特征是C-14位的绝对构型发生转变，即14-H为α取向。Terretonins E和F作为线粒体呼吸链抑制剂分离自海洋来源真菌Aspergillus insuetus发酵物中（Lopez-Gresa et al.,Terretonins E and F, inhibitors of the mitochondrial respiratory chain fromthe marine-derived fungus Aspergillus insuetus. J Nat Prod, 2009, 72:1348–1351），其与terretonin L属于一类特殊的terretonins亚型。
中国专利CN201510244085.2报道了一种α-吡喃酮混源萜及其制备方法和应用，应用于制备抗流感病毒药物。CN107362077A 仅仅一次性提到了马尾藻属植物富含甘油糖脂、植物甾醇、混源萜类、褐藻多酚、含氮化合物等成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗病毒等多种生物活性。因此，迄今关于terretonins活性研究报道非常少，并无报道terretonin及其类似物具有抗炎活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。该混源萜类化合物及其结构类似物具有抗炎活性，为开发新型抗炎药物提供先导化合物，用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病。
本发明提供的混源萜类（terretonins）化合物如下述式I结构所示：
I
本发明涉及的式I化合物，区别于已知化合物terretonin D，其14-H为α取向。
本发明的还涉及式I化合物、与式I化合物的结构类似物terretonin，即化合物II、terretonin A，即化合物III、terretonin D，即化合物IV单独或以组合物形式（如药学上可接受的辅助剂等）在制备抗炎药物中的用途。
II III IV
本发明提供了的土曲霉（Aspergillus terreus）ML-44，其保藏编号为CGMCC No.15664，保藏日期为2018年04月17日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株是从太平洋牡蛎的消化道样品中分离，经分类学研究鉴定为土曲霉（Aspergillus terreus）。
本发明提供的式I化合物及其结构类似物的制备方法包括如下步骤：
将上述的土曲霉进行发酵培养，获得含有式I化合物及其结构类似物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到所述化合物。也可以使用曲霉属的其它能够产生式I化合物的生产菌进行发酵培养。
所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如萃取、柱层析、高效液相制备等。
本发明提供的式I化合物的具体制备方法包括如下步骤：
1) 将上述的土曲霉进行大米固体发酵培养，获得发酵物；
2) 将所得发酵物用50%-90%（v/v）的丙酮水溶液超声浸提、过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮，残余混悬液用乙酸乙酯萃取，得到发酵物的乙酸乙酯萃取物；
3) 将步骤2)得到乙酸乙酯萃取物减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；
4) 将乙酸乙酯总浸膏依次用硅胶柱层析，石油醚‒二氯甲烷‒甲醇梯度洗脱、SephadexLH-20柱层析，甲醇洗脱，和ODS柱层析，水→100%甲醇梯度洗脱，分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；
5) 将含有所述化合物的柱层析组分经HPLC分离。
步骤2)中的丙酮水溶液为70%-90%（v/v），优选为75%-85%（v/v），更优选为80%（v/v）。
本发明采用Griess法，对式I化合物及其上述结构类似物对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的抑制作用进行了测试。经实验证实，式I化合物及上述结构类似物可显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞NO的释放，因而具有抗炎作用。
本发明的还提供了土曲霉ML-44的发酵物的提取物，所述提取物含有本发明的式I化合物及其结构类似物。具体地，所述提取物为土曲霉ML-44发酵物的乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯总浸膏、或者层析组分。所述提取物可以参照上面本发明的化合物的制备方法的相应步骤制得。具体地，所述提取物可以通过萃取、柱层析、高效液相制备得到。
本发明还提供了土曲霉ML-44发酵物的提取物在制备抗炎药物中的用途。
总之，本发明提供了含有所述的具有式I所示的结构及其上述结构类似物（II-IV）或其药学上可接受的盐的药物，所述药物包括药学上可接受的辅助剂；所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂等。
所述的混源萜类化合物或其药学上可接受的盐单独或以组合物形式在制备抗炎的的药物的应用。
本发明提供一种抗炎的药物，包括有效量的所述的混源萜类化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
本发明的还提供上述土曲霉ML-44在制备本发明的式I化合物中或者发酵物的提取物中的用途。
本发明的式I化合物及其上述结构类似物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗炎药物，用于炎症性疾病的治疗。
本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01-100 mg/kg体重/天。
本发明提供了式I化合物及其上述结构类似物（II- IV）的细胞活性测试，本发明具有抑制LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，表明具有抗炎活性，因此可用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病，为开发新型抗炎药物提供先导化合物。
附图说明
图1为化合物I的X射线单晶衍射结构。
图2为化合物I的HR-ESI-MS谱图。
图3为化合物I的1H NMR谱图。
图4为化合物I的13C NMR谱图。
图5为化合物I的DEPT谱图。
图6为化合物I的1H-1H COSY谱图。
图7为化合物I的HMQC谱图。
图8为化合物I的HMBC谱图。
图9为化合物I的NOESY谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在以下实施例中，称为化合物I的为式I所示化合物，系本发明首次发现的新化合物；称为化合物II的是已知化合物terretonin；称为化合物III的是已知化合物terretoninA；称为化合物IV的是已知化合物terretonin D。
***数字表示相应标位。
I
在下面实施例的结构研究中，比旋光度用日本JASCO P-1020型旋光仪测定。ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国Thermo Scientific公司LCQ Fleet液质联用仪和Agilent公司LCT6200 series TOF/6500型质谱仪测定，NMR谱图用瑞士Bruke公司Avance III 500型超导核磁共振仪（500 MHz 1H-NMR，125 MHz 13C-NMR）测定。
实施例1：微生物发酵培养与化合物的制备
1. 发酵培养与发酵物的提取处理
1) 生产菌株
本实施例中用于发酵生产化合物I-IV的产生菌是分离自太平洋牡蛎消化道的土曲霉菌（Aspergillus terreus）ML-44株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 15664。
2) 发酵培养
按微生物培养的常规方法，从4℃冰箱取出曲霉菌（Aspergillus terreus）ML-44试管斜面，在无菌条件下用接种环刮取适量孢子，划线接种于新配制的5个PDA固体培养基（组成：葡萄糖2%、琼脂2%、NaCl 1.5%，用20%土豆的水煮液配制）平板上，28℃培养箱中活化培养5天，分别用10ml无菌水洗取孢子，并将全部孢子合并分散于100 ml无菌水中，得到孢子悬液。将该孢子悬液按每瓶4 ml的接种量，分别接种于装有大米固体培养基（每瓶80 g市售大米加150 ml天然海水，放置隔夜后于121℃灭菌30 min制得）的24个1000 ml三角烧瓶中，于室温静置培养35天。
2. 提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备
将发酵物用体积分数为80％的丙酮水溶液（每瓶500 ml）浸泡混悬，超声处理1h，室温浸提24h后用4层纱布过滤，重复操作3次。合并滤液，减压浓缩至不含丙酮后，残余水层约3L用等体积乙酸乙酯萃取3次，得发酵物乙酸乙酯萃取物，减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏66.2 g。
3. 乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有目标化合物I-IV的柱层析组分的制备
将上述乙酸乙酯浸膏66.2 g用二氯甲烷-甲醇（v/v 1:1）200ml溶解，滤除不溶物，加入90 g层析硅胶（200-300目）吸附拌样，减压蒸干后添加到预装硅胶玻璃减压柱（120 g硅胶，柱床4.8 × 18.0 cm）上，用石油醚-二氯甲烷-甲醇溶剂***进行梯度洗脱层析，得到若干流分。根据硅胶薄层分析结果合并相应流分，按洗脱极性顺序得到8个组分：Fr-1（12.4 g,石油醚）、Fr-2（6.3 g，石油醚-二氯甲烷1:1洗脱）、Fr-3（4.5 g，石油醚-二氯甲烷1:2洗脱）、Fr-4（11.6 g，二氯甲烷洗脱）、Fr-5（15.8 g，二氯甲烷-甲醇99:1洗脱）、Fr-6（6.2 g，二氯甲烷-甲醇95:5洗脱）、Fr-7（1.4 g，二氯甲烷9:1洗脱）、Fr-8（1.9 g，二氯甲烷-甲醇7:3洗脱）。
将组分Fr-3（4.5 g）用50 ml甲醇溶解，上样到甲醇预装的Sephadex LH-20柱（柱床4.8 × 42 cm），甲醇洗脱层析，按洗脱先后顺序将流份合并成4个子组分：Fr-3-1-Fr-3-5。Fr-3-3（1.1 g）用甲醇溶解并用0.45μm滤膜过滤后，采用QuikSep中低压色谱***（慧德易，北京，中国）以80%甲醇（流速10 ml/min，室温）在预装有ODS的玻璃柱（柱床1.8cm×30cm）上进行分离。根据紫外检测结果得到5个组分：Fr-3-3-1-Fr-3-3-5。其中，Fr-3-3-1中含有目标化合物I-IV。
4. 化合物I-IV的HPLC制备
将含有化合物I-IV的组分Fr-3-3-1（570 mg）用10 ml甲醇溶解，用0.45μm滤膜过滤后，用Waters 2545型HPLC***，利用Gemini C18制备柱（21.2 mm × 250 mm）进行HPLC分离（柱温26℃，以75%甲醇为流动相，流速10 ml/min，每次进样0.5 ml，检测波长为210和254nm)，制得化合物I（28 mg，t R = 17.3 min）、化合物II（118 mg, t R = 12.9 min）、化合物III（85 mg, t R = 26.8 min）和化合物IV（130 mg, t R = 24.9 min）。
化合物I-IV 的理化常数与波谱数据
化合物I为无色块状结晶（MeOH），m.p. 172–174 oC，[α] -86.8o (c 1.0，MeOH)。UV(MeOH)：末端吸收。正离子ESI-MS：m/z 475 [M + H]+，497 [M + Na]+，971 [2M + Na]+；负离子ESI-MS：m/z 491 [M + H2O - H]-，509 [M + Cl]-。HR-ESI-MS：m/z 实测值475.2332[M + H]+，计算值C26H35O8 [M + H]+ 475.2324；实测值497.2151 [M + Na]+，计算值C26H34O8Na [M + Na]+ 497.2146；实测值509.1942 [M + Cl]-，计算值C26H34O8Cl [M + Cl]-509.1950。NMR数据如表1和表2所示。
化合物I的核磁数据经COSY、HSQC和HMBC等二维图谱分析予以归属，推出其平面结构与化合物IV（terretonin D）一致；其绝对构型经NOESY图谱解析和X射线单晶衍射分析鉴定为terretonin D在C-14位的差向异构体。
表1 化合物I-IV的1H NMR数据（500 MHz，CDCl3）
化合物II为白色粉末（MeOH），[α] -96.8 (c 1.0，MeOH)。正离子ESI-MS：m/z 489[M + H]+，511 [M + Na]+，999 [2M + Na]+；负离子ESI-MS：m/z 487 [M - H]-。1H和13C NMR数据如表1和表2所示。
化合物III为白色粉末（MeOH），[α] -112.5 (c 1.0，MeOH)。正离子ESI-MS：m/z473 [M + H]+，495 [M + Na]+，967 [2M + Na]+；负离子ESI-MS：m/z 471 [M - H]-。NMR数据如表1和表2所示。
化合物IV为白色粉末（MeOH），[α] -63.4 (c 1.0，MeOH)。Positive ESI-MS: m/ z 475 [M + H]+, 497 [M + Na]+, 971 [2M + Na]+; negative ESI-MS: m/z 473 [M -H]-, 509 [M + Cl]-. NMR数据如表1和表2所示。
表2 化合物I-IV的13C NMR数据（125 MHz，CDCl3）
实施例2：化合物I-IV的抗炎活性测试
1. 实验材料
1) 被测样品溶液的配制
测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I-IV。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测试活性。
2) 细胞系及细胞的继代培养
活性测试采用小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系。RAW 264.7细胞用含10％胎牛血清以及青霉素和链霉素各100 μg/ml的DMEM培养基常规传代，并于37℃通入5％二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。
2. 活性测试方法
1) 化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的抑制作用
采用Griess法，对化合物I-IV对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的抑制作用进行了测试。取对数生长期的RAW 264.7细胞，用新鲜DMEM培养基配制细胞密度为2×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μl，37℃培养12 h后样品组每孔加样品液各2 μl，空白对照组则每孔加甲醇各2 μl，于37℃处理1 h，然后每孔加入LPS（1 μg/mL），继续培养24 h。培养结束后，每孔各取上清液100 μl，分别与等体积Griess试剂（1%磺胺，0.1%盐酸萘乙二胺和2.5%磷酸）混合，反应后测定各孔在540 nm处的吸光度值（OD值）。按公式IR%＝(ODLPS-OD样品)/(ODLPS-OD空白)×100%计算NO生成抑制率（IR%）。
2) 化合物对RAW 264.7细胞活力的影响
采用MTT法检测化合物对RAW 264.7细胞活力的影响。取出100 μl上清液用于测定NO水平之后，每孔加预冷的5mg/ml的MTT溶液（用PBS 溶液配制）各20 μl，37℃孵育4 h后，于4℃、2000 rpm离心10 min，吸去上清液，每孔各加150 μl DMSO，置于酶标仪上充分振荡使MTT紫色产物完全溶解，测量每孔570 nm处的OD值。实验中样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取OD平均值，按IR%＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100%公式，计算样品对RAW 264.7细胞的抑制率（IR%）。
3. 实验结果
1) MTT法测试结果
在MTT法测试中，结合显微镜观察检查，化合物I-IV在100 μg/ml作用浓度下对RAW264.7细胞均未显示出细胞毒性和抑制作用（表3）。
2) Griess法测试结果
实验结果显示化合物I-IV在50 μg/ml作用浓度下对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放具有显著的抑制作用（表4）。
4. 结论
化合物I-IV均具有抑制LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，表明化合物I-IV具有抗炎活性，因此化合物I-IV可用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种用于抗炎的混源萜类化合物，其特征在于具有如下所示的结构：
I
以及
II III IV。
2.权利要求1所述的混源萜类化合物的制备方法，其特征在于它是从土曲霉（Aspergillus terreus）ML-44的发酵培养物中制备分离得到的，具体步骤如下：
1）将土曲霉（Aspergillus terreus）ML-44进行发酵培养，获得发酵物；
2）将发酵物用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯浸膏；
3）将步骤2）中得到的乙酸乙酯总浸膏依次用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和ODS柱层析分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；
4）将含有所述化合物的柱层析组分经HPLC纯化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于制备土曲霉（Aspergillus terreus）ML-44的发酵培养物的步骤是：按微生物培养的常规方法，从曲霉菌（Aspergillus terreus）ML-44试管斜面，在无菌条件下用接种环刮取适量孢子，划线接种于新配制的5个PDA固体培养基平板上，其中，固体培养基的质量组成为：葡萄糖2%、琼脂2%、NaCl 1.5%，用20%土豆的水煮液配制，28℃培养箱中活化培养5天，分别用10ml无菌水洗取孢子，并将全部孢子合并分散于100 ml无菌水中，得到孢子悬液；将该孢子悬液按每瓶4 ml的接种量，分别接种于装有大米固体培养基的24个1000 ml三角烧瓶中，于室温静置培养35天；大米固体培养基的质量组成为：每瓶80 g市售大米加150 ml天然海水，放置隔夜后于121℃灭菌30 min制得。
4.权利要求3所述的制备方法得到的发酵物。
5.土曲霉（Aspergillus terreus）ML-4在制备权利要求1所述的混源萜类化合物中的应用。
6.权利要求1所述的混源萜类化合物或其药学上可接受的盐单独或以组合物形式在制备抗炎的的药物的应用。
7.一种抗炎的药物，其特征在于包括有效量的权利要求1所述的混源萜类化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求6所述的在制备抗炎的药物的应用，其特征在于所述的药物包括药学上可接受的辅助剂。
9.根据权利要求6所述的在制备抗炎的药物的应用，其特征在于所述的药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
10.土曲霉ML-44，其保藏编号为CGMCC No.15664。
CN201810595613.2A 2018-06-11 2018-06-11 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途 Active CN108640968B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810595613.2A CN108640968B (zh) 2018-06-11 2018-06-11 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810595613.2A CN108640968B (zh) 2018-06-11 2018-06-11 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108640968A true CN108640968A (zh) 2018-10-12
CN108640968B CN108640968B (zh) 2020-12-04

Family

ID=63752245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810595613.2A Active CN108640968B (zh) 2018-06-11 2018-06-11 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108640968B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028500A (zh) * 2019-04-09 2019-07-19 嘉兴市爵拓科技有限公司 表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途
CN112159376A (zh) * 2020-09-24 2021-01-01 中国人民解放军海军特色医学中心 一种二倍半萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途
CN113621526A (zh) * 2021-09-07 2021-11-09 鲁东大学 一种海洋真菌杂色曲霉m-7-sw9、混源萜类化合物及其提取方法和应用
CN115894408A (zh) * 2021-08-17 2023-04-04 周口师范学院 一种三异戊烯基取代aspulvinone类化合物及其制备方法和应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028500A (zh) * 2019-04-09 2019-07-19 嘉兴市爵拓科技有限公司 表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途
CN112159376A (zh) * 2020-09-24 2021-01-01 中国人民解放军海军特色医学中心 一种二倍半萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途
CN112159376B (zh) * 2020-09-24 2022-04-05 中国人民解放军海军特色医学中心 一种二倍半萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途
CN115894408A (zh) * 2021-08-17 2023-04-04 周口师范学院 一种三异戊烯基取代aspulvinone类化合物及其制备方法和应用
CN113621526A (zh) * 2021-09-07 2021-11-09 鲁东大学 一种海洋真菌杂色曲霉m-7-sw9、混源萜类化合物及其提取方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108640968B (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107298671B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸h及制备抗人结肠癌药物的应用
CN108640968A (zh) 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途
CN103865809B (zh) 一种源于桔青霉的青霉烯醇b1的抗肿瘤用途
CN107298672B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸i在制备抗人结肠癌药物的应用
CN101463058B (zh) 羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸、其衍生物及其制备方法和用途
CN102766184A (zh) 原人参二醇过氧化衍生物及其制备方法与应用
CN104592082B (zh) 源于桔青霉的青霉烯醇 d2制备方法及其应用
CN103058974B (zh) 天然化合物及其制备方法和用途
CN110407792B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸类化合物Secalonic acid J及制备方法
CN102030753A (zh) 异戊烯基化吲哚类生物碱及其制备方法和应用
CN108017600A (zh) 六种来源于荔枝草的萜类化合物及其制备方法和用途
CN109134416B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸h在制备人子***药物的应用
CN102250197B (zh) 一种麦冬总甾体皂苷提取物的制备方法及应用
CN102020649B (zh) 二酮哌嗪类化合物、其组合物、其制备方法和用途
CN110407794B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸k及在抑制癌细胞增殖上的应用
CN103610682A (zh) 3α-羟基-30-齐墩果-12,20(29)-二烯-28-酸的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102051394A (zh) 一种硫代二酮哌嗪类化合物制备方法及其应用
CN109134417B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸i及抗人子***药物的应用
CN105111168A (zh) 天然抗肿瘤化合物及其制备方法和用途
CN104788528B (zh) 霞草齐墩果烷型五环三萜化合物，含有该化合物的药物组合物及其应用
CN104447475B (zh) 源于桔青霉的青霉烯醇 d1制备方法及其应用
CN103242348A (zh) 吲哚啉二酮哌嗪类螺环化合物及其制备方法和用途
CN102618448B (zh) 补身烷型倍半萜环己烯酮衍生物、其制备方法及用途
CN110403929B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸m及在抑制人癌细胞增殖上的应用
CN110407796B (zh) 源于草酸青霉的黑麦酮酸类化合物Secalonic acid L及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant