CN103952392B - 用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制备方法，属于生物技术领域。具体地说，用带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体作为活性中心，部分取代N,N´‑亚甲基双丙烯酰胺交联剂，采用反相悬浮聚合技术制备了高机械强度和大孔结构的表面含环氧基团的多孔聚合物微球，将固定化时间从72小时缩短到12小时，提高了固定化酶的活性和操作稳定性，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制备方法，属于生物技术领域。具体地说，采用反相悬浮聚合技术制备了机械强度高和酶固定化时间短的表面含环氧基团的多孔聚合物微球。
背景技术
青霉素酰化酶（E.C.3.5.1.11，Penicillin G acylase，简称PGA）是半合成β-内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA），又能催化6-APA和7-ADCA与侧链缩合，生产多种半合成β-内酰胺类抗生素（如Ampicillin，Amoxicillin，Cephalexin和Cefadroxil等）。但是直接将游离酶用于催化反应中存在许多不足，如在高温、强酸强碱和有机溶剂中不稳定，容易丧失催化活性；游离酶回收困难，经济上不合理，还造成产物难以分离提纯，严重影响产品质量；生产过程难以实现连续操作，只能一次性间歇操作等。固定化酶克服了游离酶的上述不足，不仅保持了游离酶特有的催化特性，还提高了操作稳定性，生产过程易于实现连续操作，反应完成后易于与产物分离且可以重复使用，所得的产品纯度高，生产成本低。因此，酶的固定化一直是催化化学、生物化学和材料化学等领域的研究热点，其中高性能的固定化载体的合成技术是关键。
含环氧基团的聚合物载体，载体表面的环氧基团能够在室温条件下开环与生物酶分子中的胺基反应形成共价键，从而在温和条件下实现生物酶的固定化。这种借助于环氧基团使生物酶固定于载体表面，不仅操作条件温和简便，而且固定化过程对酶活损失也很小，因而，非常适合于固定化酶的工业化生产。
我们（中国发明专利CN1408859A）用反相悬浮聚合技术合成了一系列用于青霉素酰化酶固定化的含环氧基团的聚合物载体，但聚合过程中以甲基丙烯酸缩水甘油酯为功能性单体，以Span-60和硬脂酸钙为复合分散剂，存在着聚合物载体在后处理过程中硬脂酸钙不易被洗涤除去和在重复使用过程中载体易破碎等缺点。然后我们（催化学报, 2010, 31(5): 586-590）以Span-60和Tween-20为复合分散剂，替代原有的硬脂酸钙复合分散剂，减少后处理过程中所需的时间和溶剂用量；同时用分子链柔性较好的烯丙基缩水甘油醚部分替代刚性的甲基丙烯酸缩水甘油酯，提高聚合物载体的机械强度。但是聚合物载体的合成条件有待继续优化，进一步改善聚合物载体的孔结构和机械强度，缩短酶固定化时间，提高固定化酶的综合性能。
发明内容
本发明目的是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种机械强度高和酶固定化时间短的表面含环氧基团的多孔聚合物微球的制备方法，使以该聚合物微球为载体制备的固定化青霉素酰化酶具有较高的活性、操作稳定性和机械稳定性。
所述的含环氧基团的多孔聚合物微球，采用改进的反相悬浮聚合技术进行制备，具体包括如下步骤：
将带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体、N,N´-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚等聚合物单体以及偶氮二异丁腈引发剂加入到甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和Tween20复合分散剂的由正庚烷和四氯乙烯组成的混合溶剂中，在氮气保护下于45~65℃进行反相悬浮聚合反应3~6小时，反应结束后用乙醇洗涤，正庚烷浸泡，50~70℃真空干燥8~16小时，得到聚合物微球。
所述的带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体为聚醚丙烯酸酯预聚体（三羟甲基丙烷-环氧乙烷-丙烯酸共聚物预聚体）和聚氨酯丙烯酸酯预聚体（双季戊四醇-异佛尔酮二异氰酸酯–丙烯酸羟乙酯共聚物预聚体）的一种或二种，多官能度聚合物预聚体与N,N´-亚甲基双丙烯酰胺的重量比为0.05~0.3。
所述的含环氧基团的多孔聚合物微球，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。
青霉素酰化酶的固定化：称取0.30克聚合物微球置于25毫升锥形瓶中，加入0.93毫升青霉素酰化酶溶液并用pH=7.5的1mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至5毫升，在28℃的水浴摇床中固定12小时后，用pH=7.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤抽滤。
固定化青霉素酰化酶的活性和操作稳定性测定方法采用文献（催化学报, 2010,31(5): 586-590）报道的测定方法。
本发明的关键在于使用带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体作为活性中心，部分取代原有的N,N´-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，获得了高机械强度和大孔结构的含环氧基团的多孔聚合物微球，将固定化时间从72小时缩短到12小时，提高了固定化酶的活性和操作稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是限制本发明的保护范围。
对比例
将90毫升正庚烷与30毫升四氯乙烯混合后加入装有温度计、冷凝管、导气管和搅拌桨的反应釜中，向其中加入0.29克Span-60和0.78克Tween-20后，加热至55℃。在氮气保护和强烈搅拌下，再加入17.5毫升溶有3.9克N,N´-亚甲基双丙烯酰胺、0.54克甲基丙烯酰胺、1.35毫升甲基丙烯酸缩水甘油酯、1.35毫升烯丙基缩水甘油醚和0.55克偶氮二异丁腈引发剂的甲酰胺溶液。在55℃聚合反应4小时后，停止搅拌，冷却至室温，通过200目分样筛过筛，得到聚合物微球，所制得的聚合物微球依次经100毫升乙醇浸泡洗涤48小时、100毫升正庚烷浸泡洗涤48小时、60℃真空干燥12小时后即可使用。将上述聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为72小时，得到的固定化酶初始活性为320U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了90%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌6小时聚合物微球就已大部分破碎。
实施例 1
将90毫升正庚烷与30毫升四氯乙烯混合后加入装有温度计、冷凝管、导气管和搅拌桨的反应釜中，向其中加入0.29克Span-60和0.78克Tween-20后，加热至55℃。在氮气保护和强烈搅拌下，再加入17.5毫升溶有0.3克聚醚丙烯酸酯预聚体（三羟甲基丙烷-环氧乙烷-丙烯酸共聚物预聚体）、3.6克N,N´-亚甲基双丙烯酰胺、0.54克甲基丙烯酰胺、1.35毫升甲基丙烯酸缩水甘油酯、1.35毫升烯丙基缩水甘油醚和0.55克偶氮二异丁腈引发剂的甲酰胺溶液。在55℃聚合反应4小时后，停止搅拌，冷却至室温，通过200目分样筛过筛，得到聚合物微球，所制得的聚合物微球依次经100毫升乙醇搅拌洗涤1小时、100毫升正庚烷搅拌洗涤1小时、60℃真空干燥12小时后即可使用。将上述聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为346U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了100%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌12小时聚合物微球才开始破碎。
实施例 2
将聚醚丙烯酸酯预聚体0.3克改为0.2克，N,N´-亚甲基双丙烯酰胺3.6克改为3.7克，其他聚合物微球的合成条件与实施例1相同。将合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为337U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了100%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌10小时聚合物微球才开始破碎。
实施例 3
将聚醚丙烯酸酯预聚体0.3克改为0.8克，N,N´-亚甲基双丙烯酰胺3.6克改为3.1克，其他聚合物微球的合成条件与实施例1相同。将合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为378U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了89%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌7小时聚合物微球才开始破碎。
实施例 4
将0.3克聚醚丙烯酸酯预聚体改为0.5克聚氨酯丙烯酸酯预聚体（双季戊四醇-异佛尔酮二异氰酸酯–丙烯酸羟乙酯共聚物预聚体），N,N´-亚甲基双丙烯酰胺3.6克改为3.4克，其他聚合物微球的合成条件与实施例1相同。将合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为268U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌16小时聚合物微球才开始破碎。
实施例 5
将0.3克聚醚丙烯酸酯预聚体改为0.2克聚氨酯丙烯酸酯预聚体，N,N´-亚甲基双丙烯酰胺3.6克改为3.7克，其他聚合物微球的合成条件与实施例1相同。将合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为295U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了95%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌11小时聚合物微球才开始破碎。
实施例 6
将0.3克聚醚丙烯酸酯预聚体改为0.8克聚氨酯丙烯酸酯预聚体，N,N´-亚甲基双丙烯酰胺3.6克改为3.1克，其他聚合物微球的合成条件与实施例1相同。将合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化时间为12小时，得到的固定化酶初始活性为198U/g(湿)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了84%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中以280rpm的转速搅拌25小时聚合物微球才开始破碎。
Claims (3)
1.一种用于生物酶固定化的聚合物微球的制备方法，其特征在于，用带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体作为活性中心，部分取代N,N/-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，采用反相悬浮聚合技术制备了机械强度高和酶固定化时间短的表面含有环氧基团的多孔聚合物微球，所述带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体为选自聚醚丙烯酸酯预聚体和聚氨酯丙烯酸酯预聚体中的一种或二种，所述聚醚丙烯酸酯预聚体为三羟甲基丙烷-环氧乙烷-丙烯酸共聚物预聚体，所述聚氨酯丙烯酸酯预聚体为双季戊四醇-异佛尔酮二异氰酸酯-丙烯酸羟乙酯共聚物预聚体；所述多官能度聚合物预聚体与N,N/-亚甲基双丙烯酰胺的重量比为0.05-0.3；
所述反相悬浮聚合技术具体包括如下步骤：
将带有长支链结构的多官能度聚合物预聚体、N,N/-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚聚合物单体以及偶氮二异丁腈引发剂加入到甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和Tween20复合分散剂的由正庚烷和四氯乙烯组成的混合溶液中，在氮气保护下于45-65℃进行反相悬浮聚合反应3-6小时，反应结束后用乙醇洗涤，正庚烷浸泡，50-70℃真空干燥8-16小时，得到聚合物微球。
2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述的含环氧基团的多孔聚合物微球，用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶的固定化。
3.根据权利要求2所述的用于生物酶固定化的聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述的含环氧基团的多孔聚合物微球适用于青霉素酰化酶的固定化。
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