CN106282152A - 一种固定化酶及由其催化二氢杨梅素酰化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶催化技术领域，公开了一种固定化酶及由其催化二氢杨梅素酰化的方法。所述固定化酶的制备方法为：将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris‑HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液，然后加入盐酸多巴胺，在pH为8.0～9.5条件下震荡反应1～90min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；然后所得载体材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，冷冻干燥后得到所述固定化酶。所得固定化酶可在二甲基亚砜中，以乙酸乙烯酯为酰基供体催化二氢杨梅素酰化，且酰化产物为二氢杨梅素‑16‑乙酸酯。具有催化效率高，区域选择性高、酶能迅速分离并重复催化DMY酰化的优点。

Description

一种固定化酶及由其催化二氢杨梅素酰化的方法
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种固定化酶及由其催化二氢杨梅素酰化的方法。
背景技术
二氢杨梅素是一种具有类黄酮结构的天然产物，研究表明二氢杨梅素具抗氧化、抗菌、抗肿瘤、保护肝脏等作用，但是由于二氢杨梅素结构的特殊性，其脂溶性很差，因此很难透过细胞膜被人体吸收。
目前，对二氢杨梅素进行改性，主要是将其酰化，提高其脂溶性，同时保护其结构的稳定性。而对于二氢杨梅素的酯化，研究者最常采用的方法是化学法。李卫等人以十二酰氯为酰基供体，采用化学方法成功将二氢杨梅素酰化。张友胜等人通过对反应条件的考察得出：在反应温度为120℃，使用碱性催化剂K2CO3，反应体系中二氢杨梅素与硬脂酰氯、催化剂用量的相对重量比例为1:2.5:0.05时，能够使二氢杨梅素硬脂酸酯的合成变得更为容易。严赞开等人采用了不同摩尔比的乙酸酐与二氢杨梅素，以磷酸作为催化剂，丙酮和甲苯作为反应溶剂，合成了不同酯化程度的二氢杨梅素酯。化学法通常还需要添加一些重金属催化剂，但是由于重金属本身所具有的毒副性，使得通过化学法进行结构修饰后的产物或多或少的带上一些毒性，这在很大程度上限制了该产物在食品和医药领域的应用；另外，化学法的化学、立体和区域选择性差，在实际反应中，人们往往需要对其进行局部基团的保护，以及最终的基团脱保护，这就使得整个反应过程变得很繁琐和复杂甚至会变得难以控制，也使得结构修饰的整体时间延长。相比之下，酶催化具有化学、立体和区域选择性高的特点，也就是说，在反应过程中，我们不需要对天然产物进行基团保护以及反应后的基团脱保护，使得整个操作变得简单、省时；酶法进行结构修饰，其反应条件不像化学法那样苛刻，需要严格控制反应条件，它的反应条件更加温和，更加容易控制，也很容易达到反应的要求，其反应往往是能够一步到位，对环境友好。另外，酶的固定化技术的迅速发展，为天然产物的大规模酶法结构修饰提供了极大的技术支持，促使其商业化生产成为现实。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种固定化酶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的固定化酶。
本发明的再一目的在于提供一种由上述固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；然后向所得基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0～9.5，在室温下震荡反应1～90min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；
(2)将步骤(1)所得载体材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为0～4℃，固定化时间1～12h，冷冻干燥后得到所述固定化酶。
优选地，步骤(1)中所述的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制备得到。
优选地，所述四氧化三铁纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为1:(0.5～5)。
优选地，步骤(1)中所述pH为8.5；步骤(2)中磷酸缓冲液的pH为8.0。
优选地，步骤(2)中所述的酶为脂肪酶；所述脂肪酶优选黑曲霉脂肪酶；所述黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。
优选地，步骤(2)中所述震荡固定化的震荡速率为100～500rpm。
一种固定化酶，通过上述方法制备得到。
上述固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，包括如下步骤：
将固定化酶在介质二甲基亚砜中，以乙酸乙烯酯为酰基供体，催化二氢杨梅素酰化，反应温度为20～60℃、pH为6.5～9.0，加入的固定化酶量为20-80U，反应底物乙酸乙烯酯:二氢杨梅素的摩尔比为(2.5～25):1，得到酰化产物二氢杨梅素-16-乙酸酯。
优选地，上述方法中所述反应温度为35～50℃，pH为7.0～8.0；所述乙酸乙烯酯:二氢杨梅素的摩尔比为(10～25):1。
本发明的原理为：通过四水合氯化亚铁和六水合氯化铁与氨水共沉淀能够得到四氧化三铁纳米粒子，同时多巴胺在类似于海水的弱碱性(pH＝8.5)条件下，能够自聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团中的羟基能够与铁原子形成配位键，其作用力非常大，使得聚多巴胺分子能够紧紧包裹在纳米四氧化三铁表面，同时聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团在碱性条件下极容易氧化成邻苯二醌，从而能够与酶分子中的氨基或者巯基发生反应，将蛋白质牢固“粘合”在四氧化三铁纳米粒子基体表面，实现了酶的固定化。脂肪酶分子一般由两部分构成，一部分亲水，另一部分疏水，对脂肪酶催化性能起着最重要作用的活性中心就在疏水端附近。酶分子活性中心结构除了含有β-折叠、α-螺旋、β-转角以外，其上方还有一个由疏水作用和静电作用所稳定的“盖子”，但是在底物或者一种有机溶剂存在的情况下，这个盖能够移开。结果活性部位变得容易与底物接近。脂肪酶催化的酰化或反向的水解反应遵循-乒乓bi-bi机理。组成催化三联体的三种氨基酸的特殊的氢键重组增加了色氨酸残基的亲核能力，它能够进攻酰基供体的羰基，形成“酰-酶复合体”。随后，底物将进一步进攻酰-酶复合体生产产物。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明通过聚多巴胺的修饰有效改善了天然载体对蛋白的粘附能力，酶的固定化效果更好；
(2)发明使用固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，相比于以往的化学催化方法，具有绿色、反应过程温和、催化效率高、专一性强、能够迅速回收利用等特点。
附图说明
图1为实施例1中所得固定化酶在不同反应底物比下催化DMY酰化的活性曲线图；
图2为实施例2中所得固定化酶在不同温度下催化DMY酰化的活性曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；然后向所得基材溶液中加入盐酸多巴胺(四氧化三铁纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为1:0.5)，调pH为8.0，在室温下震荡反应30min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；上述载体材料在磷酸缓冲液(pH为8.0)中与黑曲霉脂肪酶进行震荡固定化，固定化温度为4℃，固定化时间12h，冷冻干燥后得到所述固定化酶(ANL@PD-MNPs)。
本实施例所得固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，具体步骤如下：
洗净烘干7个带塞10ml玻璃三角瓶，将其编号为1、2、3、4、5、6、7，分别往里面添加12.81mg二氢杨梅素(DMY)，100mg ANL@PD-MNPs，按编号大小，按照乙酸乙烯酯/二氢杨梅素的摩尔比为2.5、5、7.5、10、15、20、25的比值分别加乙酸乙烯酯(VA)的量为8.6mg、17.20mg、25.80mg、34.40mg、51.61mg、68.81mg、86.01mg，再分别都加入2mL DMSO，混合均匀同时避免二氢杨梅素粘在瓶壁上，用封口胶封住。置于恒温摇床内(pH 7.0，45℃，200r/min)进行反应。定时，用移液枪取样20μL，用流动相稀释20倍，离心(10,000r/min)5min后，用进样针取上清液(50μL)，排尽里面气泡后快速注入液相色谱进行分析。其在不同反应底物比下的相对酶活曲线图如图1所示。
实施例2
将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；然后向所得基材溶液中加入盐酸多巴胺(四氧化三铁纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为1:0.5)，调pH为8.0，在室温下震荡反应90min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；上述载体材料在磷酸缓冲液(pH为8.0)中与胞外产黑曲霉脂肪酶进行震荡固定化，固定化温度为4℃，固定化时间12h，冷冻干燥后得到所述固定化酶(ANL@PD-MNPs)。
本实施例所得固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，具体步骤如下：
洗净烘干5个带塞10ml玻璃三角瓶，将其编号为1、2、3、4、5，分别往里面加入12.81mg二氢杨梅素(DMY)，100mg ANL@PD-MNPs，51.61mg乙酸乙烯酯(VA)，2mL DMSO，混合均匀同时避免二氢杨梅素粘在瓶壁上，用封口胶封住。分别置于温度不同转速相同的恒温摇床中进行反应，温度按照梯度分别是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，pH 8.0。定时，用移液枪取样20μL，用流动相稀释20倍，离心(10,000r/min)5min后，用进样针取上清液(50μL)，排尽里面气泡后快速注入液相色谱进行分析。本实施例所得固定化酶在不同温度下催化DMY酰化的曲线图如图2所示。
实施例3
将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；然后向所得基材溶液中加入盐酸多巴胺(四氧化三铁纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为1:2.5)，调pH为8.0，在室温下震荡反应90min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；上述载体材料在磷酸缓冲液(pH为8.0)中与胞外产黑曲霉脂肪酶进行震荡固定化，固定化温度为4℃，固定化时间1h，冷冻干燥后得到所述固定化酶(ANL@PD-MNPs)。
本实施例所得固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，具体步骤如下：
洗净烘带塞10ml玻璃三角瓶，分别往里面加入34.4mg二氢杨梅素(DMY)，100mgANL@PD-MNPs，51.61mg乙酸乙烯酯(VA)，2mL DMSO，混合均匀同时避免二氢杨梅素粘在瓶壁上，用封口胶封住。置于恒温摇床内(pH 8.0，40℃，200r/min)进行反应。定时，用移液枪取样20μL，用流动相稀释20倍，离心(10,000r/min)5min后，用进样针取上清液(50μL)，排尽里面气泡后快速注入液相色谱进行分析。所取得的产率为80％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；然后向所得基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0～9.5，在室温下震荡反应1～90min，反应产物经洗涤、干燥，得到载体材料；
(2)将步骤(1)所得载体材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为0～4℃，固定化时间1～12h，冷冻干燥后得到所述固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制备得到。
3.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：所述四氧化三铁纳米粒子与盐酸多巴胺的质量比为1:(0.5～5)。
4.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述pH为8.5；步骤(2)中磷酸缓冲液的pH为8.0。
5.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的酶为脂肪酶。
6.根据权利要求5所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶是指黑曲霉脂肪酶。
7.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述震荡固定化的震荡速率为100～500rpm。
8.一种固定化酶，通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。
9.权利要求8所述的固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，其特征在于包括如下步骤：
将固定化酶在介质二甲基亚砜中，以乙酸乙烯酯为酰基供体，催化二氢杨梅素酰化，反应温度为20～60℃、pH为6.5～9.0，加入的固定化酶量为20～80U，反应底物乙酸乙烯酯:二氢杨梅素的摩尔比为(2.5～25):1，得到酰化产物二氢杨梅素-16-乙酸酯。
10.根据权利要求9所述的固定化酶催化二氢杨梅素酰化的方法，其特征在于：所述反应温度为35～50℃，pH为7.0～8.0；所述乙酸乙烯酯:二氢杨梅素的摩尔比为(10～25):1。
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