CN103945870A - 生物可降解交联的水凝胶 - Google Patents

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Abstract

描述了利用交联化合物在合适的pH和温度条件下降解的水凝胶，所述交联化合物通过消去反应被切割。所述水凝胶可用于递送各种试剂，例如药物。本发明提供了在生理条件作用下通过非酶过程降解为较小的可溶成分的水凝胶，还提供了它们的制备方法。水凝胶由交联剂制备，所述交联剂在生理条件下发生消去反应，从而将交联剂从水凝胶骨架上切割下来。本发明还涉及形成本发明的水凝胶的交联剂自身以及中间体。根据本发明的方法制备的可生物降解水凝胶可用于众多领域，包括生物医药工程、吸收剂材料，以及用作递送药物的载体。

Description

生物可降解交联的水凝胶
相关申请
本申请要求2011年9月7日提交的美国申请序列号61/531,990的权益，其通过引用全文纳入本文。
背景技术
水凝胶是天然或合成的亲水聚合物链的三维网状物，其中水(多达99％)是分散介质。脆弱大分子通常需要水分充足的环境以保持活性和结构完整性，而水凝胶的高水合程度可保护蛋白质生物活性所需的蛋白质折叠。水凝胶的高水含量使材料具有生物相容性，并且使组织与该凝胶接触时的炎性反应最小化，并且提供与活组织相当的柔韧度。因此，水凝胶成为了生物医学工程领域的兴趣点，其作为用于伤口包扎和一次性尿片的吸收材料，以及作为药物缓释的载体。水凝胶已经通过亲水性天然或合成聚合物的物理或化学交联来制备。
由天然聚合物交联形成的水凝胶的示例包括由透明质酸、壳聚糖、胶原蛋白、右旋糖苷、果胶、聚赖氨酸、明胶或琼脂糖形成的那些(参见：Hennink,W.E.,等,Adv.Drug Del.Rev.(2002)54:13-36；Hoffman,A.S.,Adv.Drug Del.Rev.(2002)43:3-12)。这些水凝胶由高分子量的多糖或多肽链组成。其应用的一些示例包括：在化学交联的右旋糖苷型水凝胶中包封重组人白介素-2(Cadee,J.A.,等,J Control.Release(2002)78:1-13)和电离交联的壳聚糖/透明质酸复合物中的胰岛素(Surini,S.,等,J.Control.Release(2003)90:291-301)。
由合成聚合物的化学或物理交联形成的水凝胶的示例包括：聚(乳酸-乙二醇共聚物)酸(PLGA)聚合物、(甲基)丙烯酸-寡聚乳酸-PEO-寡聚乳酸-(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇)(PEO)、聚(丙二醇)(PPO)、PEO-PPO-PEO共聚物()、聚(膦腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙撑亚胺)等(参见，例如，Hoffman,A.S.,Adv.Drug Del.Rev(2002)43:3-12)。采用此类水凝胶包封蛋白质聚合物的示例包括：在物理交联的PEG-g-PLGA和PLGA-g-PEG共聚物中包封胰岛素(Jeong,B.,等,Biomacromolecules(2002)3:865-868)和在化学交联的丙烯酸-PGA-PEO-PGA-丙烯酸大分子单体中包封血清白蛋白(Sawhney A.S.,等,Macromolecules(1993)26:581-587)。
视孔径而定，包封化合物的释放通常需要水凝胶降解。降解使孔径增加至一定程度，使得药物能够从水凝胶内部扩散出来进入周围体液。一旦药物递送完成，就更需要降解以从体内去除所述水凝胶，因为通过手术去除用完的水凝胶载体常常是痛苦的。尽管，许多已知的水凝胶在理论上是生物可降解的，但在实践中，所述降解不受控制并因此不可预知。因此，需要能以预定速率生物降解的新型水凝胶材料。
为使水凝胶有效降解，在生理条件下可切割的(cleavable)交联剂是有用的。在一种方法中，酶切割作为底物的交联剂可使该结果有效。然而，基于酶降解则导致患者间差异以及体内和体外结果间的差异。
本发明利用不同文献(即公开的从大分子运载体释放药物的文献)中描述的酶切割机制，例如，美国申请US2006/0171920和WO2009/158668、WO2011/140393、WO2011/140392和WO2011/140376中的公开内容。消去反应依赖于调节基团以控制质子酸性；该质子的离子化导致药物释放。
据申请人了解，该机制尚未被用于建立水凝胶的可切割交联剂，其导致该凝胶降解。
发明内容
本发明提供在暴露至生理学条件后以非酶过程降解成较小、可溶成分的水凝胶，以及制备所述水凝胶的方法。所述水凝胶由交联剂制备，所述交联剂在生理学条件下发生消去反应，从而从所述水凝胶骨架切割交联剂。本发明还涉及交联剂本身，以及本发明水凝胶形成过程中的中间体。根据本发明方法制备的生物可降解水凝胶可用于不同领域，包括生物医学工程、吸收材料以及作为药物递送运载体。
因此，一方面，本发明涉及可在生理学条件下生物降解的水凝胶，所述水凝胶包含通过接头(linker)交联的一种或多种聚合物，所述接头通过消去反应分解。更具体地，所述水凝胶包含当处于聚合物中时具有式(1)残基的接头：
其中，R1、R2或R5连同X的至少一个与所述一种或多种聚合物偶联。或者，所述接头是具有式(2)的残基：
其中，所述R1、R2或R5中有至少两个偶联至一种或多种聚合物。R1、R2、R5、m、X、W、s、n、t和Q的定义在下文中有详细描述。在式(2)的情况中，所述偶联可通过存在于相同式(2)分子的两个R1，或通过一个R1和一个R5来进行，例如，式(2)中。要求是，这些取代基中至少两个与一种或多种聚合物偶联，就是意味着式(2)交联剂本身中必须有至少两个连接点。在一些实施方式中，R1、R2和R5取代基在各t“臂”中一致。
所述水凝胶还可包含一种或多种药物。所述一种或多种药物可简单地包含在所述水凝胶的孔中，或可与交联剂偶联，所述交联剂进而偶联至所述水凝胶的聚合物骨架。
本发明还提供用于制备生物可降解的水凝胶的方法，所述方法包括同时或依序地使至少一种反应性聚合物接触可切割的交联剂化合物，其中，所述可切割的交联剂化合物包含与所述反应性聚合物反应的官能团，和在生理学条件下通过消去反应被切割的部分(moiety)，所述部分还包含与一种或多种聚合物反应的官能团。本发明还提供用于制备释药型生物可降解水凝胶的方法，其中释药速率和水凝胶降解速率是受控的。
因此，可将药物或其它试剂简单地包封在水凝胶中，或由通过接头的偶联作用来包括在水凝胶中，所述接头也通过消去反应释放所述药物，而不需要所述凝胶本身降解。
在另一方面，本发明提供交联剂，所述交联剂包含能够在生理学条件下通过消去反应被切割的部分，还包含能够与反应性聚合物形成共价键的反应基团。
在另一方面，本发明提供通过本发明交联剂与至少一种反应性聚合物反应形成的中间体。
附图简要说明
图1说明本发明的一个实施方式，其中水凝胶通过使多臂聚合物与式(1)交联剂交联来形成。四臂聚合物(其中各臂止于环辛炔(CO))和式(1)的交联剂(其中一个R5是(CH2)rN3且X是O-CO-NH-CH2CH2(OCH2CH2)p-N3)(实施例20)提供4x4水凝胶，所述水凝胶在各交联中包含β-消去接头L。所述水凝胶的降解受接头L上合适选择的调节基团R1控制。还通过碳酸琥珀酰亚胺和氨基-PEG-叠氮化物的反应说明(1)的形成。
图2A和2B说明本发明的两种实施方式，其中通过使多臂聚合物与式(2)化合物交联来形成水凝胶。图A显示4臂聚合物(其中各臂止于环辛炔(CO))和另一个式(2)的4臂聚合物(其中各臂止于β-消去性接头叠氮化物(L2-N3))的交联。所得的4x4水凝胶在各交联中包含β-消去性接头。水凝胶的降解速率受合适选择的接头L2控制。图B显示8臂聚合物的交联，其中4个臂止于环辛炔(CO))，剩余的臂连接至腐蚀探针(EP)或可释放性连接的药物(L1-D)。与4臂聚合物(其中各臂止于β-消去性接头叠氮化物(L2-N3))的交联提供4x8水凝胶，所述4x8水凝胶在各交联中包含β-消去性接头L2，并且包含通过另一个β-消去性接头L1共价连接的药物D。所述水凝胶的释药速率和水凝胶降解速率由合适选择的接头L1和L2分别控制。
图3显示4x4PEG水凝胶在pH7.4、37℃时的降解，所述降解通过实施例28中所述溶解的荧光素-PEG片段来检测；采用如下不同调节物的反向凝胶时间：R1＝(4-氯苯基)SO2，30小时，R1＝苯基-SO2，55小时；R1＝O(CH2CH2)2NSO2，22天；R1＝CN，105天。采用溶解的荧光素作为腐蚀探针，将完全溶解的点定义为脱胶时间。
图4显示检测的实施例28的4x4水凝胶的脱胶时间与从采用当量接头的可溶性PEG偶联物检测的5-(氨基乙酰氨基)荧光素释放速率之间的相关性。
图5显示实施例28的4x4PEG水凝胶脱胶的pH依赖性，其中L2具有调节物R1＝(4-氯苯基)SO2。
图6显示pH与实施例28的凝胶的脱胶时间之间的相关性。
图7显示药物替代物5-(氨基乙酰胺基)荧光素从实施例29的4x8PEG凝胶的释放。
图8显示药物替代物5-(氨基乙酰胺基)荧光素从实施例29的4x8PEG凝胶释放的pH依赖性。在pH7.4(23.0小时)；pH7.8(14.0小时)；pH8.1(6.9小时)；pH8.4(3.2小时)；pH8.7(1.9小时)；和pH9.0(1.1小时)检测释放的半衰期。
图9显示pH和实施例29的8x4水凝胶的药物释放半衰期之间的相关性。
图10显示在pH8.8，37℃下，肽艾塞那肽(醋酸艾塞那肽(exendin-4))的释放，所述肽通过可释放的接头L1(具有调节物R11＝CH3SO2)共价连接至8x4PEG水凝胶，所述水凝胶与可降解的接头L2(具有调节物R1＝CN)交联(实施例33)。知道接头释放和凝胶降解具有pH依赖性，还给出pH7.4下的对应标尺。总溶解艾塞那肽(圆形)在pH8.8下的释放具有表观t1/2＝20.7小时，对应于pH7.4下的t1/2＝21天。pH8.8下在172小时观察到脱胶(方形＝溶解的荧光素腐蚀探针)，对应于pH7.4下的180天。
图11说明了本发明的一个实施方式，其中释药型水凝胶通过如下方式形成：使第一聚合物(包含至少两个正交官能团(B和C))与式(3)的接头-药物(其中所述接头-药物包含仅与所述第一聚合物上存在的一个正交官能团(B)反应的官能团(B'))反应，使所述接头-药物通过残基B*连接至所述第一聚合物。通过用所得载药第一聚合物上剩余的正交官能团(C)与式(1)或式(2)化合物反应来形成水凝胶，其中这些化合物包含仅与所述载药第一聚合物上存在的剩余正交官能团反应的官能团(C')以通过残基C*交联所述水凝胶。
本发明的实施方式
本发明的水凝胶是由接头交联的一种或多种聚合物，所述接头通过"消去反应"使所述一种或多种聚合物分离。"消去反应"是一种反应机制，通过该反应从分子去除质子H和离去基团X，以形成烯烃。在本发明的一个实施方式中，所述消去反应是1,2-消去反应，如下所示
在本发明的其他实施方式中，所述消去反应是1,4-消去反应，如下所示
在所述消去机制中，所示质子H通过碱移去；在水性介质中，所示碱通常是氢氧根离子，从而消去反应的速率由该介质的pH决定。在生理学条件下，环绕和渗透所示水凝胶的液体的pH看来是控制所示消去反应速率的主要因素。因此，当X和Y代表处于生理学环境中的聚合物基体内的链时，pH依赖性消去反应导致X和Y之间键的破坏，以及随后所述聚合物基体的生物降解，该降解过程不需要酶作用。
“能够在生理学条件下通过消去反应被切割的部分”指一种结构，所述结构包含基团H-C-(CH＝CH)m-C-X，其中m是0或1且X是离去基团，其中上述用以去除HX成分的消去反应可以如此速度发生，使得生理学pH和温度条件下所述反应的半衰期是1～10,000小时。在生理学pH和温度条件下，所述反应的半衰期优选是1～5,000小时，更优选地是1～1,000小时。生理学pH和温度条件指pH是7～8且温度是30～40℃的条件。
应注意，本申请中给出的范围，例如1～1,000小时，应认为其中间的区间数是被具体且明确地公开的。这免去了列出一长列数值的必要性，并且申请人明确地意在包括外边界之间的任何随机范围。例如，范围1～1,000也包括1～500和2～10。
水凝胶指含有大量的水的三维的，主要属亲水性的聚合物网络，其由天然或合成的均聚物、共聚物或寡聚物经化学或物理交联而形成。水凝胶可通过交联如下物质来形成：聚乙二醇(认为是聚氧化乙烯的同义词)、聚丙二醇、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸酯、聚磷腈、聚交酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乙烯亚胺、琼脂糖、右旋糖苷、明胶、胶原、聚赖氨酸、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、果胶、角叉聚糖。所述聚合物可以是如下所示的多臂聚合物。
水凝胶还可以具有环境敏感性，例如在低温下是液体但在37℃凝胶化，例如由聚(N-异丙基丙烯酰胺)形成的水凝胶。
中孔水凝胶指具有直径为约1nm～约100nm的孔的水凝胶。这些中孔水凝胶中的孔足够大以允许生物分子(如蛋白质)的自由扩散。大孔水凝胶指具有直径大于约100nm的孔的水凝胶。微孔水凝胶指具有直径小于约1nm的孔的水凝胶。
反应性聚合物和反应性寡聚物指包含能与其它官能团反应的官能团的聚合物或寡聚物，所述反应最优选在与肽、蛋白质和其它生物分子的稳定性要求相适应的温和条件下进行。反应性聚合物中发现的合适的官能团包括马来酰亚胺类、硫醇类或经保护的硫醇类、醇类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、胺类或经保护的胺类、羧酸类或经保护的羧酸类、叠氮化物类、炔烃类(包括环炔烃类)、1,3-二烯类(包括环戊二烯类和呋喃类)、α-卤代羰基类和N-羟基琥珀酰亚胺基类、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基类，或硝基苯基酯类或碳酸酯类。
能够连接至反应性聚合物的官能团指与反应性聚合物的相应官能团反应以形成连至所述聚合物的共价键的官能团。能够连接至反应性聚合物的合适的官能团包括马来酰亚胺类、硫醇类或经保护的硫醇类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、胺类或经保护的胺类、羧酸类或经保护的羧酸类、叠氮化物类、炔烃类(包括环炔烃类)、1,3-二烯类(包括环戊二烯类和呋喃类)、α-卤代羰基类和N-羟基琥珀酰亚胺基类、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基类，或硝基苯基酯类或碳酸酯类。
生物可降解的水凝胶指通过在生理学pH和温度条件下切割组成性化学键而失去其结构完整性的水凝胶。生物降解可以是酶促催化的或可以是单独依赖于环境因素(如pH和温度)的。生物降解导致聚合物网络片段的形成，所述聚合物网络片段足够小而可溶，因而得以通过常规生理学通路从***清除。
交联剂指包含至少两个官能团的化合物，所述官能团能够与一种或多种反应性聚合物或寡聚物形成共价键。所述反应性聚合物或寡聚物通常是可溶的，而交联导致形成不溶性三维网络或凝胶。所述交联剂的两个官能团可以相同(同双功能)或不同(异双功能)。选择所述异双功能交联剂的官能团，从而允许一个官能团与所述反应性聚合物或寡聚物的关联基团反应，且允许第二官能团与相同或不同反应性聚合物或寡聚物的关联基团反应。选择双功能交联剂的两个官能团，从而其不与其自身反应(即，它们不关联)。
官能团的关联反应对的示例包括：
叠氮化物+乙炔、环辛炔、马来酰亚胺
硫醇+马来酰亚胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯砜、乙烯磺酰胺，卤代羰基
胺+羧酸、活化的羧酸
马来酰亚胺+1,3-二烯、环戊二烯、呋喃
因此，作为一个示例，可制备具有叠氮化物和胺基团但不是叠氮化物和环辛炔基团的异双功能交联剂。
"经取代的"指包含替代了一个或多个氢原子的一个或多个取代基基团的烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基基团。取代基基团一般可选自：卤素(包括F、Cl、Br和I)；低级烷基(包括直链、支链和环状)；低级卤代烷基(包括氟烷集、氯烷基、溴烷基和碘烷基)；OH；低级烷氧基(包括直链、支链和环状)；SH；低级烷硫基(包括直链、支链和环状)；氨基、烷基氨基、二烷基氨基、甲硅烷基(包括烷基甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基和芳基甲硅烷基)；硝基；氰基；羰基；羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺；氨基羰基；氨基酰基；氨基甲酸酯；脲；硫代氨基甲酸酯；硫脲；酮；砜；磺酰胺；芳基(包括苯基、萘基和蒽基)；杂芳基(包括5元杂芳基，包括吡咯、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、噻二唑、***、噁二唑和四唑)、6元杂芳基(包括吡啶、嘧啶、吡嗪)，以及稠合杂芳基(包括苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并咪唑、吲哚、苯并噻唑、苯并异噁唑和苯并异噻唑)。
R1和R2的性质可通过任选添加供电子取代基或吸电子取代基来调节。术语“供电子基团”指导致R1R2CH的酸性降低的取代基；供电子基团通常与负哈米特σ(Hammettσ)或塔夫特σ*(Taftσ*)常数相关联，并且是物理有机化学领域中熟知的。(哈米特常数指芳基/杂芳基取代基，塔夫特常数指非芳香部分上的取代基。)合适的供电子取代基的示例包括但不限于：低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和甲硅烷基。类似地，术语“吸电子基团”指导致R1R2CH的酸性提高的取代基；吸电子基团通常与正哈米特σ(Hammettσ)或塔夫特σ*(Taftσ*)常数相关联，并且是物理有机化学领域中熟知的。合适的吸电子取代基的示例包括但不限于：卤素、二氟甲基、三氟甲基、硝基、氰基、C(＝O)-RX，其中RX是H、低级烷基、低级烷氧基或氨基，或S(O)mRY，其中m＝1～2且RY是低级烷基、芳基或杂芳基。如本领域中熟知，取代基基团的电子影响可能取决于所述取代基的位置。例如，芳基环的邻位或对位上的烷氧基取代基是供电子的，并且通过负哈米特σ常数来表征，而芳基环的间位上的烷氧基取代基是吸电子的，并且通过正哈米特σ常数来表征。哈米特σ和塔夫特σ*常数值如下所示。
“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链或环状的1～8个碳原子或1～6个碳原子或1～4个碳原子的烃基团，其中，烷基是饱和烃，烯基包括一个或多个碳-碳双键，而炔基包括一个或多个碳-碳三键。除非另有说明，这些包含1～6个碳原子。
“芳基”包括6～18个碳原子(优选6～10个碳原子)的芳族烃基团，包括如下基团：苯基、萘基和蒽基。“杂芳基”包括含有3～15个碳原子和至少一个N、O或S原子，优选含有3～7个碳原子和至少一个N、O或S原子的芳环，包括如下基团：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等。
"卤素"包括氟、氯、溴和碘。“马来酰亚胺”是下式基团
术语“蛋白质”和“肽”可互换使用而无关链长，并且这些术语还包括含有非酰胺连接基团的线性假肽，例如CH2NH2连接基团和肽模拟物。
术语“核酸”和“寡核苷酸”也可互换使用而无关链长。所述核酸或寡核苷酸可以是单链或双链的，或可以是DNA、RNA或其带有经过改变的连接基团的经修饰形式，例如，磷酸二酯、氨基磷酸酯等。就可作为药物用于本发明的蛋白质和核酸而言，这些术语还包括具有天然中不存在的侧链的那些蛋白质和具有天然中不存在的碱基的那些核酸。
在药物情况中，小分子是本领域熟知的术语，并且意在包括除蛋白质和核酸以外的化合物，其可以是合成的或分离自天然的，且一般不像蛋白质或核酸。其分子量通常<1,000，尽管没有特定的公认截止值。不过，该术语是药理与医学领域中众所周知的。本发明提供交联剂，所述交联剂包含能够在生理学条件下通过消去反应被切割的部分(moiety)，还包含能够与反应性聚合物形成共价键的反应基团。在一个实施方式中，所述交联剂具有式(1)
m是0或1；
X包含能够连接至反应性聚合物的官能团(所述反应性聚合物在生理学条件下易从接头消去)，以及偶联至反应性聚合物的第二反应性基团Z2；
其中，R1、R2和R5中至少一个包含能够连接至聚合物的第一官能团Z1；
R1和R2中至少一个或两者独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；芳基或芳烷基，各自任选经取代；杂芳基或杂芳烷基，各自任选经取代；或OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；芳基或芳烷基，各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，各自任选被取代；其中R1和R2可接合以形成3～8元环；且
其中R1和R2中有且只有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，各自任选被取代；且
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基(其中p＝1-1000)、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，各自任选被取代。式(1)的交联剂包含能够在生理学条件下通过消去反应被切割的部分。因此，采用式(1)的交联剂形成的水凝胶在生理学条件下是生物可降解的。所述消去反应的机制取决于介质的pH和温度。尽管所述交联剂在低pH和温度下对于通过消去反应的切割而言是稳定的，在生理学值的pH(约7.4)和温度(约37℃)下，该消去反应以受控的速率发生，该速率主要受R1和R2基团控制，并且由R5基团控制到较低程度。
所述消去反应的速率可基于R1、R2和R5基团的结构来预期。吸电子R1和R2基团加速所述消去反应，而供电子R1和R2基团延迟所述消去反应，从而可获得不同速率，以提供具有数分钟至数年的消去反应半衰期的接头。烷基R5基团相对于芳基R5基团使所述消去反应稍有减速。通过改变R1和R2基团，因而可能控制所述消去反应发生的速率，并因此可在宽范围控制所述水凝胶的的生物降解速率。因此，预期采用式(1)交联剂形成的水凝胶可用于临时需要凝胶基体的应用，例如作为药物递送载体或储藏物或作为组织再生的临时支架。
X的实施方式
X包含能够连接至反应性聚合物的官能团，并且在生理学条件下又能发生消去反应。所得的酸HX的pKa通常是10或更低，优选pKa是8或更低。因此，合适的X基团的示例包括碳酸酯类、羰酰卤类、氨基甲酸酯类、硫醚类、酯类和任选被取代的酚类。在本发明的一个实施方式中，X是活化的碳酸酯，例如琥珀酰亚胺基碳酸酯、磺基琥珀酰亚胺基碳酸酯或硝基苯基碳酸酯。在本发明的另一个实施方式中，X是羰酰卤，例如O(C＝O)Cl或O(C＝O)F。
在本发明的另一个实施方式中，X是下式的氨基甲酸酯
其中T*是O、S或NR6，其中R6是H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基，或任选被取代的杂芳烷基；z是1～6；且Y不存在或是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000，且Z2是能够与反应性聚合物连接的官能团。在本发明的一个特定实施方式中，Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000；或Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～100；或Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～10。
在另一个实施方式中，X是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000，且Z2是能够与反应性聚合物连接的官能团。在某些实施方式中，本发明提供式(1)的交联剂，其中R5是R1、R2和R5中的取代基，其还包含能够连接至聚合物的官能团。在更具体的实施方式中，本发明提供式(1)的交联剂，其中R5之一还包括能够连接至聚合物的官能团，而其它R5是H。
因此，本发明提供式(1a)的交联剂
其中m是0～1；r是2～8；且R1、R2、R5、m、X和Z如上定义。在一个更具体的实施方式中，本发明提供式(1a)的交联剂，其中R5是H。在一个甚至更具体的实施方式中，本发明提供式(1a)的交联剂，其中R1是CN或R8SO2，其中R8是任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基，或者OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；R2和R5是H，且m＝0。
在另一个实施方式中，本发明提供式(1a)的交联剂，其中X具有下式
其中T*是O、S或NR6，其中R6是H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基，或任选被取代的杂芳烷基；z是1～6；且Y不存在或是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000，且Z2是能够与反应性聚合物连接的官能团。在本发明的一个特定实施方式中，Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000；或Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～100；或Y是(OCH2CH2)p，其中p＝1～10。
在本发明的另一个实施方式中，X是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000，且Z2是能够与反应性聚合物连接的官能团。
在一个实施方式中，本发明提供具有式(1b)的交联剂
其中m是0～1；且R1、R2、R5、m、X和Z2如上定义。在一个更具体的实施方式中，本发明提供式(1b)的交联剂，其中R5是H。在一个甚至更具体的实施方式中，本发明提供式(1b)的交联剂，其中R1是CN或R8SO2，其中R8是任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基，或者OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；R2和R5是H，且m＝0。
制备式(1)化合物(其中X是OH、Cl或O-琥珀酰亚胺基)的方法已在先公开于专利公开文本WO2009/158668、WO2011/140393和WO2011/140392中。具有下式的式(1)化合物(其中X是氨基甲酸酯)
可采用下文工作实施例中所述的方法从式(1)化合物(其中X是Cl或O-琥珀酰亚胺基)通过与式R6-NH-(CH2)zY-Z2的胺反应来制备。
在本发明的另一个实施方式中，提供式(2)的多价交联剂
其中，R1、R2和R5中至少一个包含能够连接至聚合物的官能团Z1，其它同式(1)中定义；
其中
m是0或1；
n是1～1000；
s是0～2；
t是2、4、8、16或32，
W是O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)、S、或
且
Q是价态＝t的核心基团，其中t＝2、4、8、16或32。
所述核心基团Q是价态＝t的基团，其连接所述交联剂的多个臂。Q的典型示例包括C(CH2)4(t＝4)，其中所基于季戊四醇核心制备多臂剂；(t＝8)，其中基于六甘油核心制备多臂剂；和(t＝8)，其中基于三季戊四醇核心制备多臂剂。
式(2)化合物可通过多臂聚乙二醇和式(1)试剂的反应来制备。多种多臂聚乙二醇是市售可得的，例如来自NOF公司和键凯科技有限公司(JenKemTechnologies)。
在本发明的一个具体实施方式中，t是4。在本发明的另一个实施方式中，t是8。
水凝胶的制备
另一方面，本发明提供用于制备生物可降解的水凝胶的方法，所述方法包括同时或依序地使至少一种反应性聚合物接触可切割的交联剂化合物，其中，所述可切割的交联剂化合物包含与所述反应性聚合物反应的官能团，和在生理学条件下通过消去反应被切割的部分(moiety)。
在本发明的一个实施方式中，生物可降解的水凝胶通过使单一反应性聚合物和可切割的交联剂化合物反应来形成，其中所述可切割的交联剂化合物包含：与所述反应性聚合物反应的官能团以及还包含与在生理学条件下通过消去反应切割的反应性聚合物反应的官能团的部分。在该实施方式中，所述反应性聚合物是多价的，从而允许所述三维水凝胶基体中形成结点。作为该方法的一个例子，使多臂PEG(其中各臂止于如下定义的反应性官能团Z3)与式(1)或(2)的交联剂试剂反应，从而形成水凝胶。大小不同且具有不同反应性官能团的多臂PEG市售可得，例如来自NOF公司和键凯科技有限公司(JenKem Technologies)。作为该方法的另一个例子，使直链聚合物(其包含反应性官能团Z3的多种拷贝)与式(1)或(2)的交联剂试剂反应，从而形成水凝胶。此类包含多个Z3基团的直链聚合物的例子有：透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、右旋糖苷、胶原、壳聚糖、藻酸盐和琼脂糖。
在另一个实施方式中，本发明提供用于通过第一反应性聚合物、第二反应性聚合物和可切割的交联剂化合物的反应来形成生物可降解水凝胶的方法，所述可切割的交联剂化合物包含与所述第一反应性聚合物反应的第一官能团、与所述第二反应性聚合物反应的第二官能团和通过在生理学条件下的消去反应切割的部分。所述第一和第二官能团可相同或不同。就三维凝胶网络的形成而言，所述反应性成分(第一反应性聚合物、第二反应性聚合物(若有))将是多臂的并因而其作用是在所述凝胶基体中形成结点。在本发明的优选实施方式中，该形成结点的反应性成分包含至少3个臂且更优选至少4个臂。
在每个实施方式中，所述反应性聚合物可以是均聚或共聚的聚乙二醇、聚丙二醇、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸酯、聚磷腈、聚交酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乙烯亚胺、琼脂糖、右旋糖苷、明胶、胶原、聚赖氨酸、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、果胶或角叉聚糖，其在其天然状态下具有合适的反应性官能团，或经衍生化从而具有合适的反应性官能团。典型的合适官能团包括：马来酰亚胺类、硫醇类或经保护的硫醇类、醇类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、胺类或经保护的胺类、羧酸类或经保护的羧酸类、叠氮化物类、炔烃类(包括环炔烃类)、1,3-二烯类(包括环戊二烯类和呋喃类)、α-卤代羰基类和N-羟基琥珀酰亚胺类、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯类或碳酸酯类。不包含有效的反应性基团多重性的天然聚合物可在水凝胶形成之前通过与产生反应性基团的有效多重性的试剂反应来转换。
在一些实施方式中，聚合物包括多价支链结构的式[Z3-(CH2)s-(CH2CH2O)n]tQ，其中Z3是选自上文为Z1和Z2设定的反应性官能团，s是0～2，Q是具有价态t的多价核心基团，其中t是2、4、8、16或32。n的值可以是10～1000，或其中间值如20、50、100等。该数列意在包括10和1000之间的所有中间整数。
凝胶形成反应可在不同的合适溶剂中进行，所述溶剂例如水、醇、乙腈或四氢呋喃，并且优选在水性介质中进行。
所述水凝胶的形成可以逐步或一步的方式进行。因此，在本发明的一个实施方式中，使第一反应性聚合物与式(1)或(2)的交联剂反应以形成未交联的中间组合体，其任选被分离。然后，使该未交联的组合体与第二反应性聚合物反应以形成最终的交联凝胶。在本发明的另一个实施方式中，以单次操作，将第一反应性聚合物、第二反应性聚合物和式(1)或(2)的交联剂合并以反应并形成水凝胶。
在一个实施方式中，本发明提供通过使聚合物和式(1)交联剂交联来形成水凝胶的方法。基于所具有的官能团，所述聚合物可以是其天然状态或可以先采用本领域已知的方法衍生化以引入官能团，所述官能团与式(1)化合物上的官能团交叉反应。在该实施方式中，所述能够与式(1)化合物上的聚合物反应的两个官能团通常是相同的。图1中说明了该实施方式的示例。如图所示，具有两个叠氮化物官能团的式(1)的可切割交联剂与具有环辛炔官能团的4臂聚合物交联。制备具有上述Z1、Z2和Z3的其它实施方式的替代性凝胶以提供类似或等同的结果。
在另一个实施方式中，本发明提供通过使两种不同取代的聚合物(其中一个包含对消去反应敏感的交联剂)交联来形成水凝胶的方法。该实施方式的两个示例示于图2。图A显示第一4臂聚合物(其中各臂止于环辛炔(CO))和第二4臂聚合物(其中各臂止于β-消去性接头式(1)的叠氮化物化合物(L2-N3)，其因此是式(2)的4臂化合物)的交联。所得的4x4水凝胶在各交联中包含β-消去性接头。因此，该凝胶包含来自所述4臂聚合物和来自式(2)的交替结点。
如图B中所示，该方法还可采用具有更多臂的聚合物。如图所示，8臂聚合物的一些臂可通过与下文所示式(3)化合物偶联来衍生化至药物。此外，或替代性地，所述臂中的一个或多个可与标志物化合物(如荧光染料)偶联，以评价所述凝胶的瓦解速率与环境条件的关系和/或与R1、R2和/或R5的关系。该“腐蚀探针”允许设计具有所需瓦解速率的凝胶。
在该设计的一方面，通过在药物存在下形成凝胶可使所述药物简单地包含在所述凝胶的孔中，并且所述药物的递送速率受导致凝胶形成的交联化合物中合适选择的取代基的控制。
还可制备既在孔中包含药物又使药物通过下式(3)中所示的连接基团与所述聚合物偶联的凝胶。然后，可比较从所述连接基团释放的速率和从所述孔释放的速率。
在第三个替代方式中，所述药物可以式(3)形式简单提供，从而仅通过该药物从所述凝胶的消去反应即可确定从所述凝胶的释放速率。
在另一个方面，本发明提供根据上述方法形成的水凝胶。这些水凝胶可包含各种亲水性聚合物，所述聚合物如上所述以如下物质的天然形式或经修饰的形式包括在水凝胶中：聚乙二醇、聚丙二醇、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸酯、聚磷腈、聚交酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乙烯亚胺、琼脂糖、右旋糖苷、明胶、胶原、聚赖氨酸、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、果胶、角叉聚糖或已经说明的多臂聚合物，并且通过其交联度来表征，交联包括在生理学条件下能够通过消去反应被切割的至少一个部分。因此，这些水凝胶是通过pH依赖性过程而生物可降解的。
通过合适选择反应物和化学计算量来测定所得水凝胶的孔径。本发明的水凝胶可以是微孔、中孔或大孔水凝胶，并且具有一定范围的生物降解速率，所述生物降解速率由其制备中所用交联剂的性质确定。
本发明的水凝胶还可包含凝胶化过程中未消耗的剩余的反应性基团，其通过化学计算量的选择，通过不完全交联或通过纳入因正交反应性而不参与凝胶化过程的官能团而包含在水凝胶内。这些剩余的反应性基团可用于进一步修饰所得水凝胶，例如通过共价连接药物或前药。在本发明的一个实施方式中，所述剩余的反应性基团用于连接前药，所述前药包含连接至接头的药物，所述接头后续从所述水凝胶基体释放该药物。在本发明的一个更具体的实施方式中，药物从水凝胶基体的释放通过消去反应机制而发生。用于药物接合(conjugation)的消去性接头的应用在例如PCT公开文本WO2009/158668和WO2011/140393中已有描述，其通过引用纳入本文。本发明的释药型可降解水凝胶的一个实施方式示于图2B，并于下文中工作实施例29和33中有说明。第一聚合物上的官能团亚组与可释放的接头-药物(其中所述接头包含控制释药速率的第一调节物基团)的反应提供中间体载药聚合物；剩余的官能团与式(1)或(2)的交联剂(包含控制水凝胶降解的第二调节物基团)反应以提供载药的可降解水凝胶。通过适当选择所述药物接头上和所述交联剂上的调节物基团，可控制释药速率和水凝胶降解速率。在本发明的一个实施方式中，在第一步中用接头-药物处理所述第一聚合物；任选地分离中间体载药聚合物；然后通过在单独步骤中与交联剂反应来形成水凝胶。在本发明的第二方法中，所述第一聚合物、接头-药物和交联剂在单一步骤中合并。如果所述聚合物上的所有反应性官能团通过与接头-药物连接或偶联都未被消耗，则可任选地通过与合适的试剂反应来对所述过量的官能团加帽。例如，过量的环辛炔可通过与短PEG-叠氮化物(例如，叠氮基-七甘醇)反应来加帽。
因此，在本发明的一个实施方式中，提供用于形成释药型可降解水凝胶的方法，所述方法由如下步骤组成：
(a)使第一多价聚合物(包含反应性官能团)与低于化学计算量的接头-药物(具有式(3))反应
其中m、R1、R2和R5可具有在式(1)和(2)中针对它们所列的实施方式(尽管，当然，是独立地选择的)，从而包含式(1)或(2)和式(3)这两个残基的凝胶无需包含这些符号表示的相同取代基，D是药物残基，而Y在该情况中是NH或NBCH2，其中B是H、烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中R1、R2、R5中的至少一个被对应于Z1的官能团取代，所述官能团可与第一聚合物上的官能团反应；从而形成载药的第一聚合物；
(b)任选地分离所述载药的第一聚合物；和
(c)使所述载药的第一聚合物上剩余的反应性官能团与式(1)或式(2)化合物交联，从而形成水凝胶。
式(3)的接头-药物的制备在PCT公开文本WO2009/158668和WO/2011/140393中有详细描述，其通过引用纳入本文。所连接的药物D可以是小分子或多肽，包括肽和蛋白质。下文的工作实施例32详细描述了释药型可降解水凝胶的制备方法，其中D是肽艾塞那肽，该肽具有如下序列：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:1)。
在本发明的一个实施方式中，所述艾塞那肽通过氨基基团偶联至接头，以提供：
其中R1、R2、R5和m如上式(3)的定义。在某些实施方式中，m＝0，R2是H，一个R5是H，且另一个R5是(CH2)nY，其中n＝1～6或CH2(OCH2CH2)pY，其中p＝1～1000且Y是包括N3、SH、StBu、马来酰亚胺、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔烃、环辛炔、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基砜或乙烯基磺酰胺基团的基团。在本发明的某些实施方式中，R1是CN或SO2R3，其中R3是任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、OR9，或N(R9)2，其中R9各自独立地是H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基，且其中N(R9)2可形成杂环。所述接头可偶联至所述肽上的任何游离氨基基团，即，N末端胺或任何侧链胺(例如赖氨酸的ε-氨基基团)。
在本发明的一个特定实施方式中，式(3)的接头-药物在一个R5上包含反应性叠氮化物基团。因此，使低于化学计算量的接头-药物与在各臂末端包含反应性环辛炔基团的多臂聚合物反应。反应性环辛炔基团的示例包括在与叠氮化物的无铜1,3-偶极环加成反应中有效的那些，包括例如：二苯并环辛炔、二苯并氮杂环辛炔(DBCO)、二氟环辛炔(DIFO)，和张力二环化的(strained bicyclic)环辛炔(例如二环辛炔(BCN))。
在本发明的一个实施方式中，所述第一聚合物包含至少8个臂，各臂止于反应性官能团。如图2B所示，第一聚合物的3个臂用于与式(1)或(2)的化合物交联。在本发明的一个优选实施方式中，第一聚合物的至少4个臂用于与式(1)或(2)的化合物交联。因此，所用的低于化学计算量的接头-药物的量可以是0.01～5摩尔当量(相对于第一聚合物)，导致装载0.01～5个分子的药物D/8臂第一聚合物。在本发明的一个实施方式中，所用的低于化学计算量的接头-药物的量可以是0.1～5摩尔当量(相对于第一聚合物)。在本发明的另一个实施方式中，所用的低于化学计算量的接头-药物的量可以是1～5摩尔当量(相对于第一聚合物)。
因此，在本发明的某些实施方式中，艾塞那肽释放型可降解水凝胶通过使在各臂末端包含环辛炔基团的多价第一聚合物与低于化学计算量的式(4)接头-药物反应来制备。
其中R1＝CN；NO2；
任选经取代的芳基；
任选经取代的杂芳基；
任选经取代的烯基；
任选经取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选经取代的烷基；
芳基或芳烷基，各自任选经取代；
杂芳基或杂芳烷基，各自任选经取代；或
OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；或
SR4，其中
R4是任选经取代的烷基；
芳基或芳烷基，各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，各自任选被取代；
从而形成载有艾塞那肽的第一聚合物，其任选地被分离，分离例如通过沉淀、尺寸排阻或离子交换色谱，或本领域已知的其它方法进行。在本发明的特定实施方式中，式(4)中的R1是CN或SO2R3。
然后，使该载有艾塞那肽的第一聚合物与式(1)或(2)的可切割化合物反应以形成艾塞那肽释放型可降解水凝胶。在本发明的某些实施方式中，所述艾塞那肽释放型第一聚合物是8臂聚乙二醇，而用于水凝胶形成的可切割的化合物是式(2)化合物。在本发明的某些实施方式中，用于水凝胶形成的可切割化合物是式(2)化合物，其中m是0，n是10～150，s是0，t是4，且Q是C(CH2)4。
如上所述，释药速率和水凝胶降解速率主要受药物-接头和交联剂上分别选定R1和R2基团的控制。选定的释药速率通常通过所述药物的所需药代动力学来确定，例如，在给药过程中游离药物的最大和/或最小浓度，这在如下文献中已有描述：Santi等PNAS(2012)(已提交)和共通待审的PCT申请(2012年9月7日提交)(代理人案卷号670573000540)，所述两篇文献通过引用纳入本文。然后，选定式(I)和(II)化合物上的R1和R2基团以提供最优水凝胶降解速率，以在给药过程中供给所需量的游离药物，同时使该水凝胶在身体中的半衰期最小化。
在本发明的另一个实施方式中，通过一种方法制备释药型可降解的水凝胶，其中使多臂第一聚合物(其中各臂止于包含至少两个正交官能团的基团)和式(3)的接头-药物(其中所述接头-药物包含仅与所述第一聚合物上存在的正交官能团之一反应的官能团)反应。通过用所得载药第一聚合物上剩余的正交官能团与式(1)或式(2)化合物反应来形成水凝胶，其中这些化合物包含仅与所述载药第一聚合物上存在的剩余正交官能团之一反应的官能团。该方法有如下优点：其将提供结构比通过化学计算量控制成分形成的那些水凝胶更有序的释药型可降解水凝胶。该方法描述于下文的工作实施例37中。可通过使多臂聚合物(其中各臂止于单一官能团)与合适的多官能衔接物缩合来制备所述多臂第一聚合物，其中各臂止于包含至少两个正交官能团的基团。这示于图11中。
可在体外制备本发明的水凝胶，然后按需植入身体内。所述凝胶可模制成特定的形状，或制备成微粒或微球悬浮液以供注射。或者，所述水凝胶可通过原位凝胶化来形成，在该情况中，制备药学上可接受的水凝胶制剂成分；混合所述成分，然后在凝胶化之前注射或应用。注射可以是皮下、肌内、眼内、瘤内或静脉内注射。本发明的水凝胶可局部应用，例如通过在向皮肤或手术创口施用之后的混合成分的原位凝胶化来应用。本发明的水凝胶还可作为医疗器械的覆层或外科敷料应用。
本文引用的所有参考文献都通过引用完整地纳入本文。本发明通过以下实施例进一步说明，但不受限于这些实施例。
实施例1
6-叠氮己醛的制备
(1)6-叠氮-1-己醇：将6-氯-1-己醇(25g,183mmol)和叠氮化钠(32.5g,500mmol)在200mL水中的混合物回流加热20小时，然后冷却至常温并用乙酸乙酯提取3次。合并的提取物用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并浓缩以获得淡黄色油状的产物(28.3g)。
(2)6-叠氮己醛：将固体三氯异三聚氰酸(4.3g)分成小部分加入剧烈搅拌下的6-叠氮基-1-己醇(7.15g)、TEMPO(50mg)和碳酸氢钠(5.0g)在二氯甲烷(100mL)和水(10mL)中的混合物里。添加之后，使该混合物另搅拌30分钟，
然后通过赛力特(Celite)硅藻土垫过滤。有机相经分离，接着用饱和水性NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤，并浓缩以提供产物(5.8g)，该产物无需进一步纯化即可使用。
实施例2
ω-叠氮基-PEG-醛的制备
向剧烈搅拌下的O-(2-叠氮乙基)七甘醇(n＝7；250mg)、1mg TEMPO、100mg NaHCO3、2mL CH2Cl2和0.2mL水的混合物添加固体三氯异三聚氰酸(60mg)。该混合物变成橘色，并在约30分钟后形成白色悬浮液。TLC分析(1:1丙酮/己烷)指示，形成经磷钼酸染色的产物。该混合物用10mL CH2Cl2稀释，通过与MgSO4搅拌干燥，过滤，并蒸发以产出粗产物。使其溶解于CH2Cl2并加载至在己烷中平衡的4-gm硅胶柱，随后用己烷、75:25己烷/丙酮、50:50己烷/丙酮和25:75己烷/丙酮各25mL洗脱该柱。合并包含产物的部分，并蒸发以提供纯化产物。
实施例3
叠氮醇的制备
向经搅拌的内含R-SO2CH3(5.0mmol)的无水四氢呋喃(THF)(15mL)溶液(冷却至-78℃)逐滴添加内含1.6M的正丁基锂(3.1mL,5.0mmol)的己烷溶液。添加之后，移去冷却浴，并使该混合物缓慢升温约30分钟至0℃。然后，使该混合物再冷却至-78℃，然后添加6-叠氮己醛(5.5mmol)。搅拌15分钟后，移去冷却浴并允许该混合物升温。在该混合物变得澄清时，添加5mL饱和水性NH4Cl，并允许该混合物继续升温至常温。该混合物用乙酸乙酯稀释，随后用水和盐水依次洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发以提供油状粗产物。采用乙酸乙酯己烷梯度的硅胶色谱提供纯化产物。按照该方法制备的化合物包括：
1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇:来自4-(三氟甲基)苯甲砜(1.73g,94％):1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.08(2H,d,J＝8.4-Hz),7.87(2H,d,J＝8.4-Hz),4.21(1H,m),3.25(2H,t,J＝6.8-Hz),3.28(1H,dd,J＝8.8,14.4-Hz),3.20(1H,dd,J＝2.0,14.4-Hz),3.12(1H,d,J＝2.8-Hz),1.58(2H,m),1.5～1.3(6H,m)；
1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自4-氯苯甲砜；无色油状物(1.49g,产率90％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.90(2H,d,J＝8.8-Hz),7.70(2H,d,J＝8.8-Hz),4.83(1H,d,J＝6-Hz),3.86(1H,m),3.39(2H,m),3.29(2H,t,J＝6.8-Hz),1.2～1.5(8H,m)；
1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自苯甲砜；浅黄色油状物(1.25g,85％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.89(2H,m),7.72(1H,m),7.63(2H,m),4.84(1H,d J＝6-Hz),3.86(1H,m),3.33(2H,m),3.28(2H,t,J＝6.8-Hz),1.47(2H,m),1.2～1.4(6H,m)；
1-(4-甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自4-(甲磺酰基)甲苯；无色油状物(1.39g,产率85％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.76(2H,d,J＝6.4-Hz),7.43(2H,d,J＝6.4-Hz),4.82(1H,d,J＝6-Hz),3.85(1H,m),3.31(2H,m),3.28(2H,t,J＝6.8-Hz),2.41(3H,s),1.4～1.5(2H,m),1.2～1.4(6H,m)；
1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自4-甲氧基苯甲砜(1.53g,产率94％):1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.85(2H,d,J＝8.8-Hz),7.04(2H,d,J＝8.8-Hz),4.13(1H,m),3.90(3H,s),3.24(2H,t,J＝6.8-Hz),3.20(1H,dd,J＝8.8,14.4-Hz),3.14(1H,dd,J＝2.4,14.4-Hz),2.47(3H,s),1.57(2H,m),1.5～1.3(6H,m)；
1-(2,4,6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自(2,4,6-三甲基)苯甲砜(1.30g来自4.0mmol反应；96％):1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ6.99(2H,s),4.30(1H,m),3.49(1H,d,J＝2-Hz),3.25(2H,t,J＝6.8-Hz),3.18(1H,d,J＝1-Hz),3.17(1H,s),2.66(6H,s),2.31(3H,s),1.59(2H,m),1.5～1.3(6H,m)；
1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自1-吗啉代甲基磺酰胺(1.36g来自10mmol反应,89％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ4.99(1H,d,J＝6.4Hz),3.88(1H,m),3.62(4H,t,J＝4.8-Hz),3.32(2H,t,J＝6.8-Hz),3.20～3.15(6H,overlap),1.53(2H,m),1.46～1.25(6H,m)；和
1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇；来自二甲基砜；无色油状物(880mg,75％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)。
实施例4
叠氮醇的制备
向搅拌下的内含R-SO2CH3(5.0mmol)的无水四氢呋喃(THF)(15mL)溶液(冷却至-78℃)逐滴添加1.6M内含正丁基锂(3.1mL,5.0mmol)的己烷溶液。添加之后，移去冷却浴，允许该混合物缓慢升温约30分钟至0℃。然后，使该混合物再冷却至-78℃，并添加ω-叠氮基-七甘醇醛(n＝7,1.2g)。搅拌15分钟后，移去冷却浴并使该混合物升温。在该混合物变得澄清时，添加5mL饱和水性NH4Cl，并允许该混合物继续升温至常温。该混合物用乙酸乙酯稀释，随后用水和盐水依次洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发以提供粗产物。硅胶色谱提供纯化产物。
实施例5
叠氮基-接头氯甲酸酯的制备
向搅拌下的内含实施例3的叠氮醇(1.0mmol)和三光气(500mg)的15mL无水THF溶液逐滴添加吡啶(160μL)。所得悬浮液搅拌10分钟，然后过滤并浓缩以提供油状粗制氯甲酸酯。
按照该方法制备的化合物包括：
1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯
1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(2,4,6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；和
1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯。
其它氯甲酸酯可按该通用方法制备。
实施例6
叠氮基-接头氯甲酸酯的制备
向搅拌下的内含实施例4的叠氮醇(1.0mmol)和三光气(500mg)的15mL无水THF溶液逐滴添加吡啶(160μL)。所得悬浮液搅拌10分钟，然后过滤并浓缩以提供粗制氯甲酸酯。
实施例7
叠氮基-接头琥珀酰亚胺基碳酸酯的制备
向搅拌下的内含实施例5的氯甲酸酯(1.0mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(350mg)的15mL无水THF溶液逐滴添加吡啶(300μL)。所得悬浮液搅拌10分钟，然后过滤并浓缩以提供粗制琥珀酰亚胺基碳酸酯。通过硅胶色谱的纯化提供油状的纯化产物，其自发结晶。采用乙酸乙酯/己烷可实现重结晶。
按照该方法制备的化合物包括：
O-[1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯：来自40:60乙酸乙酯/己烷的晶体(280mg,55％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.12(2H,m),8.04(2H,m),5.18(1H,m),4.15(1H,dd,J＝9.2,15.2),3.96(1H,dd,J＝2.4,15.2),3.29(2H,t,J＝6.8),2.80(4H,s),1.68(2H,m),1.47(2H,m),1.27(4H,m)；
O-[1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:来自40:60乙酸乙酯/己烷的晶体(392mg,83％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.85(2H,m),7.72(2H,m),5.14(1H,m),4.04(1H,dd,J＝9.6,15.6),3.87(1H,dd,J＝2.4,15.6),3.29(2H,t,J＝6.8),2.81(4H,s),1.68(2H,m),1.47(2H,m),1.27(4H,m)；
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:来自40:60乙酸乙酯/己烷的晶体(391mg,89％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.91(2H,m),7.76(1H,m),7.66(2H,m),5.12(1H,m),3.96(1H,dd,J＝8.8,15.2),3.83(1H,dd,J＝2.8,15.2),3.29(2H,t,J＝6.8),2.81(4H,s),1.69(2H,m),1.47(2H,m),1.27(4H,m)；
O-[1-(4-甲苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:色谱法后经静置的晶体(402mg,89％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.77(2H,d,J＝8.0)；7.45(2H,d,J＝8.0)；5.11(1H,m),3.90(1H,dd,J＝8.8,15.2),3.79(1H,dd,J＝1.8,15.2),3.28(2H,t,J＝6.8),2.81(4H,s),2.41(3H,s),1.68(2H,m),1.47(2H,m),1.27(4H,m)；
O-[1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:来自60:40乙酸乙酯/己烷的晶体(320mg,68％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.81(2H,d,J＝8.8)；7.15(2H,d,J＝8.8)；5.11(1H,m),3.87(1H,dd,J＝8.8,15.2),3.86(3H,s),3.76(1H,dd,J＝2.8,15.2),3.29(2H,t,J＝6.8),2.80(4H,s),1.68(2H,m),1.47(2H,m),1.27(4H,m)；
O-[1-(2,4,6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:无色油状物(458mg,95％):1H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.09(2H,s),5.20(1H,m),3.82(1H,dd,J＝8.4,15.2-Hz),3.67(1H,dd,J＝3.2,15.2-Hz),3.30(2H,t,J＝6.8-Hz),2.79(4H,s),2.58(6H,s),2.28(3H,s),1.75(2H,m),1.49(2H,m),1.30(4H,m)；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:色谱法后经静置的晶体(430mg,95％):(400MHz,CDCl3):δ5.23(1H,m),3.77(4H,dd,J＝4.0,5,6-Hz),3.39(1H,dd,J＝6.4,14.4-Hz),3.31(6H,重叠),3.17(1H,dd,J＝4.8,14.4-Hz),2.85(4H,s),1.88(2H,m),1.61(2H,m),1.45(4H,m)；和
O-[1-甲磺酰基-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯:色谱法后经静置的晶体(360mg,95％):(400MHz,CDCl3):δ5.32(1H,m),3.50(1H,dd,J＝7.2,14.8-Hz),3.29(2H,t,J＝6.8-Hz),3.21(1H,dd,J＝0.8,4.0,14.8-Hz),3.02(3H,s),2.85(4H,s),1.90(2H,m),1.62(2H,m),1.46(4H,m).
其它琥珀酰亚胺基碳酸酯可按照该通用方法制备。
实施例8
叠氮基-接头琥珀酰亚胺基碳酸酯的制备
向搅拌下的内含实施例6的氯甲酸酯(1.0mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(350mg)的15mL无水THF溶液逐滴添加吡啶(300μL)。所得悬浮液搅拌10分钟，然后过滤并浓缩以提供粗制琥珀酰亚胺基碳酸酯。通过硅胶色谱的纯化提供纯化产物。
实施例9
叠氮基-接头磺基琥珀酰亚胺基碳酸酯的制备
用吡啶(3mmol)和实施例7的氯甲酸酯处理搅拌下的内含N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(1mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)悬浮液。在该悬浮液澄清后，用乙酸乙酯稀释该混合物。
实施例10
氨基-接头醇的制备
用1.0M内含三甲基-磷化氢的THF溶液(1.2mL)在常温下处理搅拌下的内含实施例3的叠氮-接头醇(R＝苯基；1mmol)的1mL四氢呋喃(THF)溶液1小时。添加水(0.1mL)，并使该混合物另搅拌1小时，然后采用旋转蒸发器使该混合物蒸发至干。使残留物溶解于乙酸乙酯，用水和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发以提供产物。其它氨基-接头醇可按该通用方法制备。
实施例11
t BOC-氨基-接头醇的制备
内含实施例10的氨基-接头醇(R＝苯基；1.0mmol)的2mL THF溶液用二叔丁基碳酸氢钠(1.5mmol)处理1小时，然后蒸发至干。使残留物溶解于乙酸乙酯，用水和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发以提供产物。采用乙酸乙酯/己烷梯度的硅胶色谱提供纯化产物。
其它tBOC-氨基-接头醇可按相同通用方法制备。
实施例12
4-(N,N-二乙基羰酰胺)苯胺的制备
(1)N,N-二乙基4-硝基苯甲酰胺：向内含4-硝基苯甲酰氯(5.0g)的100mLDCM冰***液添加二乙胺(5.6mL)。1小时后，该混合物依次用水、NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发以提供无色液体，其静置结晶。从乙酸乙酯/己烷重结晶，得到浅黄色晶体状产物(4.6g)。
(2)4-(N,N-二乙基羰酰胺)苯胺：N,N-二乙基4-硝基苯甲酰胺(4.44g)和10％钯碳(0.2g)在100mL甲醇中的混合物在常温下用甲酸铵(4.0g)处理2小时。该混合物通过赛力特硅藻土过滤并浓缩。使残留物重新溶解于DCM，接着用0.5M Na2CO3、水和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发以提供结晶物质。从乙酸乙酯/己烷的重结晶，得到产物苯胺。
还按照相同方法，用吗啉替代二乙胺，制备4-(吗啉代羰基)苯胺。
实施例13
叠氮氨基甲酸酯的制备
使按照实施例5的方法从2.5mmol叠氮醇制备的粗制氯甲酸酯溶解于20mL THF，并添加苯胺(2.5mmol)和三乙胺(0.7mL,5.0mmol)。1小时后，该混合物用乙酸乙酯稀释，依次用1N HCl、水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发。剩余物采用乙酸乙酯/己烷在硅胶色谱上纯化，以提供产物氨基甲酸酯。
按照该方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(吗啉代羰酰胺基)苯基氨基甲酸酯；和
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(吗啉代磺酰基)苯基氨基甲酸酯。
实施例14
N-氯甲基氨基甲酸酯的制备
使内含实施例13的叠氮氨基甲酸酯(1.0mmol)、低聚甲醛(45mg)、三甲基氯硅烷(1mL)和THF(1mL)的混合物的密封20mL小瓶在55℃浴加热17小时。冷却至室温后，打开该小瓶并使该混合物在旋转蒸发器上浓缩成稠厚油状物，将其收集在乙酸乙酯中再浓缩。使剩余物溶解于2:1乙酸乙酯/己烷，过滤，并浓缩以提供N-氯甲基氨基甲酸酯，其无需进一步纯化即可使用。按照该方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯；和
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯。
实施例15
N-烷氧基甲基氨基甲酸酯的制备
使实施例14的N-氯甲基氨基甲酸酯(0.4mmol)溶解于5mL无水甲醇。1小时后，使该混合物蒸发至干燥，并将残留物施加至硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷)以提供产物。按照该方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯；和
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基羰酰胺基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯。
实施例16
7-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(R 1 -磺酰基)-1-庚醇
向内含6-叠氮基-1-己醇(实施例1，1mmol)的吡啶(2mL)(冰上冷却)溶液添加对甲苯磺酰氯(1mmol)。30分钟后，使该混合物升温至常温并用R1-SH(1mmol)另处理1小时。该混合物用乙酸乙酯稀释，依次用水、1N HCl、水、NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发。使该粗制硫醚溶解于乙酸乙酯并用过量过乙酸处理以制备所述砜。标准水性处理后，该砜通过硅胶色谱纯化。使砜、甲酸乙酯和2当量氢化钠在DMF中的混合物升温至50℃，以提供中间体醛，其用内含硼氢化钠的甲醇处理以得到产物醇。实施例17
内含氨基-硫醇异双功能PEG的THF溶液用过量二碳酸二叔丁酯处理直至该反应进行完全，然后通过色谱分离二-BOC产物。通过采用内含一当量NaOMe的甲醇处理来切割硫代碳酸酯，并且添加2-溴乙醇来形成羟乙基硫醚，其用过乙酸氧化以形成产物。实施例18
这些化合物可通过与针对甲氧基-PEG-羟乙基砜描述的方法类似的方法制备(Morpurgo等,Bioconjugate Chemistry(1996)7:363-368,通过引用纳入本文)。例如，内含11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-醇(x＝3)(3mmol)的甲苯溶液通过共沸蒸馏干燥。在CH2Cl2中溶解后，添加甲磺酰氯，然后添加三乙胺以形成甲磺酸酯。甲磺酸酯的水溶液用2-巯基乙醇和2N NaOH处理以形成羟乙基硫化物。随后将该硫化物氧化成砜，例如在钨酸催化剂的存在下采用过氧化氢或替代性地采用过乙酸来进行所述氧化。然后，按照上述实施例中描述的方法将该羟乙基砜活化为琥珀酰亚胺基碳酸酯。
实施例19
实施例20
式(1)交联剂的制备
内含7-叠氮基-1-(苯磺酰基)-2-庚基琥珀酰亚胺基碳酸酯(119mg,0.27mmol)的2mL乙腈溶液在常温下用11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(65mg,0.30mmol)处理10分钟。溶剂蒸发后，使残留物溶解于1mL CH2Cl2并在4-g硅胶柱上采用如下分步梯度进行色谱分析：己烷，3:1己烷/乙酸乙酯，1:1己烷/乙酸乙酯和1:2己烷/乙酸乙酯。汇集含产物部分，并蒸发以提供该产物。
实施例21
4臂PEG-[DBCO] 4 的制备
使内含40-kDa4臂聚乙二醇(具有氨丙基端基，具有季戊四醇核心)(NOF美国公司，PTE400PA)(500mg,12.5μmol)、三乙胺(20μL)和6-氮杂-5,9-二氧代-9-(1,2-双脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)壬酸琥珀酰亚胺基酯(“DBCO-NHS”，佐治亚州梅肯的克里克化学工具公司(Click Chemistry Tools))(36mg,75μmol)的5mL THF溶液在常温下搅拌24小时。通过向50mL甲基叔丁基醚(MTBE)添加该反应混合物来使产物沉淀。沉淀物通过真空过滤收集，并在真空下干燥以获得510mg产物。
实施例22
水凝胶的形成
内含4.5mg的4臂PEG-[DBCO]4(实施例21)的100μL10mM乙酸盐缓冲液溶液(pH5)用5.0μL40mg/mL的实施例20的二叠氮化物交联剂处理。使该溶液快速凝固以提供弹性的水凝胶。
类似地，内含4.5mg的4臂PEG-[DBCO]4(实施例21)的100μL10mM乙酸盐缓冲液溶液(pH5)用2.5μL40mg/mL的实施例20的二叠氮化物交联剂处理。使该溶液凝胶化以获得粘性的水凝胶。
实施例23
式(2)的多价PEG-(接头-叠氮化物)x交联剂的制备
通过制备式(2)化合物(其中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R1＝PhSO2，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3)来示范多价PEG-(接头-叠氮化物)x交联剂的制备。其它式(2)化合物通过采用相同方法，通过换用实施例7的合适叠氮化物-接头-琥珀酰亚胺基碳酸酯来制备。必要时，也可采用其它实施例的类似的叠氮化物-接头-琥珀酰亚胺基碳酸。
因此，向5μmol(100mg)的20-kDa4臂PEG-胺盐酸盐(季戊四醇核心，键凯科技有限公司(JenKem Technologies))在1mL水和40μL1.0M NaHCO3(40μmol)中的混合物添加内含25μmol叠氮基-接头-琥珀酰亚胺基碳酸酯(实施例7)的1mL ACN溶液。常温下1小时后，使该溶液对1L50％甲醇随后1L甲醇透析(12～14kMWCO)。蒸发后，使残留物(109mg)溶解于2.12mL无菌过滤的10mM NaOAc(pH5.0)，并在-20℃冷冻。该叠氮化物的浓度通过与DBCO-酸反应测定为9.5mM。
实施例24
多价PEG-(环辛炔) x 的制备
PEG 20kDa -(DBCO) 4 ：向内含20kDa4臂PEG-胺盐酸盐(季戊四醇核心，键凯科技有限公司(JenKem Technologies)；100mg,5μmol)和二异丙基乙胺(0.010mL,57μmol)的乙腈(1mL)溶液添加内含刚经色谱分析过的DBCO-NHS(克里克化学工具公司(Click Chemistry Tools))的60mM乙腈溶液(0.5mL,30μmol,1.5当量)。室温下搅拌2小时后，使该混合物在减压下蒸发至干。使残留物溶解于50％水性甲醇(4mL)，并对50％水性甲醇随后甲醇透析。蒸发后，使剩余物(100mg)溶解于水以获得50mg/mL储液(通过分光光度法测定为10mM DBCO)，将其冷冻储存于-20℃。
PEG 40kDa -(DBCO) 8 :向内含168mg(4.2μmol)的40-kDa8臂PEG-胺盐酸盐(三季戊四醇核心，键凯科技有限公司(JenKem Technologies))和12.9μL二异丙基乙胺(74μmol)的0.6mLACN溶液添加1mL的内含DBCO-NHS的THF溶液(40mM(40μmol))，然后使该混合物保持在常温过夜。使该反应混合物对2L50％甲醇透析，然后对1L甲醇透析。蒸发后，使残留物(149mg)溶解于1.49mL水并冷冻储存于-20℃。DBCO浓度经分光光度法测定为16mM。
PEG40kDa(BCN)8:使内含200mg40kDa8臂PEG-胺·HCl(健凯科技股份有限公司(JenKem Technologies)；40μmol NH2)、20mg BCN对硝基苯基碳酸酯(辛纳菲克斯公司(SynAffix)；63μmol)和20μL N,N-二异丙基乙胺(115μmol)的2mLDMF溶液在常温搅拌16小时。用内含0.5mL100mM牛磺酸的0.1M KPi(pH7.5)淬灭1小时后，随后采用12kDa的膜使该混合物对水、1:1甲醇/水和甲醇透析。蒸发后，使残留物溶解于2mL THF并用10mL甲基叔丁基醚沉淀。产物收集并干燥(190mg)。
实施例25
BODIPY-叠氮化物腐蚀探针的制备
向内含BODIPY TMR-X SE(英杰公司(Invitrogen))的DMSO(100μL,1.28μmol)的12.8mM溶液添加内含11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺的乙腈(13μL,13μmol)的100mM溶液。室温下30分钟后，该混合物用0.1M KPi(pH7.4)稀释至2mL，并加载至500mg C18BondElutTM提取柱(瓦里安公司(Varian))上。接着，该柱依次用5mL一份的水和20％ACN/水洗涤，然后用50％ACN/水洗脱并浓缩至干。使残留物溶解于1.0mL ACN，并用ε544nm＝60,000M-1cm-1测定浓度(1.0mM)。
实施例26
荧光素-叠氮化物腐蚀探针的制备
使内含10mg/mL的5-(氨基乙酰胺基)荧光素(英杰公司)的DMF(100μL)溶液与25mM的6-叠氮己氧基琥珀酰亚胺基碳酸酯(100μL)混合1小时以提供12.5mM的荧光素-叠氮化物腐蚀探针溶液。
实施例27
采用式(2)的多价交联剂制备水凝胶
为制备4x4水凝胶，使内含50mg/mL PEG20kDa(DBCO)4(实施例24；250μL,2.5μmol DBCO端基)的水溶液与25μL内含10mM荧光素-叠氮化物腐蚀探针的DMF(实施例26；0.25μmol叠氮化物)溶液混合并在常温下放置30分钟。使50μL等分物(0.42μmol DBCO)与28μL10mM NaOAc(pH5.0)混合，然后与42μL50mg/mL PEG20kDa(接头-叠氮化物)4(实施例23；0.42μmol叠氮化物)混合。通过涡旋混合成分，短暂离心以去除任何气泡，然后快速吸移至硅烷化显微载玻片上配备的64μL(9x1mm)圆形橡胶灌注腔(格雷斯生物实验室公司(GraceBio-Labs))中，使其固化过夜。
按相同方法制备4x8水凝胶，该制备中，采用PEG40kDa(DBCO)8或PEG40kDa(BCN)8(实施例24)溶液替代PEG20kDa(DBCO)4，并调节8臂环辛炔和4臂接头-叠氮化物单体的比例，从而提供具有所需总PEG重量％和交联度的水凝胶。
实施例28
反向凝胶时间的测定
使胶盘(实施例27)悬浮在37℃的缓冲液中，并定时测量该溶液中的OD493以监测荧光素溶解。反向凝胶时间(tRGEL)是凝胶完全溶解时的那些时间。脱胶时间的pH依赖性采用4x4凝胶(5重量％的总PEG)，该4x4凝胶从采用式(2)化合物交联的PEG20kDa(DBCO)4制备，其中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R1＝(4-氯苯基)SO2，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3。使该胶盘悬浮于pH7.8～9.0的缓冲液中。脱胶曲线示于图5，其中检测的时间在pH7.8＝20.9h，pH8.1＝10.9h,pH8.4＝5.6h,pH8.7＝2.8h且pH9.0＝1.5h。如图6中所示，脱胶时间随pH线性变化，每降低1pH单位即增加10倍。
接头调节物R1对脱胶时间的作用通过制备水凝胶盘来测定，所述水凝胶盘采用式(2)化合物从PEG20kDa(DBCO)4制备，其中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3，且其中R1是(4-氯苯基)SO2、苯基-SO2、吗啉代-SO2或CN。制备没有调节物的对照凝胶(无R1R2CH)。悬浮在KPi(pH7.4,37℃)中的凝胶盘的脱胶曲线示于图3。如4中所示，由5-(氨基乙酰胺基)荧光素的释放测定的接头切割半衰期(参见Santi等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2012)109:6211-6216，其通过引用纳入本文)与对应水凝胶的脱胶时间之间成线性相关关系。
实施例29
水凝胶的控制释药
从PEG40kDa-(DBCO)8制备水凝胶，其中使一部分环辛炔首先与少量叠氮化物腐蚀探针反应，然后与式(3)的叠氮化物-接头-药物反应(其中所述接头包含调节基团R1)，然后与式(2)化合物交联(其中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，
W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3)，并且其中R1是(4-氯苯基)SO2、苯基-SO2、吗啉代-SO2或CN。选择式(3)的叠氮化物-接头-药物的调节基团和式(2)的化合物，使得药物释放将以比所述凝胶的腐蚀和后续降解更快的速度释放。
在一个实施例中，凝胶采用5-(乙酰胺基)荧光素(AAF)作为药物替代物来制备。式(3)中的调节R1基团不同，如下所述。因此，包含50μL100mg/mLPEG40kDa-(DBCO)8(1.0μmol DBCO端基)的水溶液(99.6μL)与内含6.2μL12.5mM叠氮化物-接头-AAF(0.078μmol)的1:1DMF:乙腈(其中所述接头包含不同修饰物之一)、作为腐蚀探针的15μL内含1.0mM BODIPY-叠氮化物(0.015μmol)的乙腈、20μL内含20mM O-(2-叠氮乙基)七甘醇(0.40μmol)的水(用于对过量环辛炔加帽)和8.4μL水混合。常温下10分钟后，包含0.5μmol自由DBCO基团的溶液与50μL内含50mg/mL式(2)化合物(其中，R1＝CH3-SO2(0.5μmol叠氮基基团))的10mM NaOAc(pH5.0)溶液混合。
将重复模制凝胶悬浮在0.1M HEPES(pH7.4，37℃)，然后定时检测溶液中的OD493(针对荧光素)和OD546(针对BODIPY)。检测的式(3)中R1为不同基团的荧光素释放时间，示于图7。通过BODIPY腐蚀探针完全溶解测定的反向凝胶时间是630±39(S.D.)小时(n＝8)。荧光素溶解遵循如下一级速率方程：[F]t/Ftot＝exp(-kobsdt)，并且给出表观总释放荧光素kobsd±S.E.：R1＝4-ClPh-SO2-是0.021±0.00014小时-1，R1＝Ph-SO2-是0.011±0.00031小时-1，R1＝4-MeO-Ph-SO2-是0.0053±0.00022小时-1，且R1＝MeSO2-是0.0033±0.00010小时-1。采用等式S6(实施例30)将速率数据转化成荧光素直接从所述凝胶释放的图线。
通过观察AAF从上述凝胶的释放来测定药物释放的pH依赖性(pH7.4～9.0)，所述凝胶采用R1＝(4-氯苯基)SO2制备。如图8和9所示，药物释放速率随pH的增加而增加。
实施例30
药物释放和凝胶腐蚀模型
药物释放和凝胶降解发生过程如下，终产物是游离药物和凝胶单体：
(凝胶)-(药物)n→药物+EP-凝胶片段-药物→药物+EP-单体
释放进入溶液的药物或药物替代物可直接由L1切割从所述凝胶释放，或从通过L2切割的凝胶腐蚀产生的溶解片段释放。为了区分从完整凝胶释放的药物和从溶解凝胶片段释放的药物，有必要确定在时间t时完整凝胶和溶液中承载药物的结点的分布。在本研究中，我们采用已报道的方法的修改形式来监测模型凝胶降解(2)。与凝胶结点永久连接的腐蚀探针EP的出现允许计算溶液中结点的分数为EP(t)/E∞；原始存在于这些溶解结点上的药物浓度，Ds(t)，由此由等式S1给出。
Ds(t)＝D∞*EP(t)/EP∞或(D∞/EP∞)*EP(t)[S1]
在时间t时从完整凝胶释放的药物Dg(t)是总释放药物D(t)和包含在溶解凝胶中或从溶解凝胶释放的药物Ds(t)之间的差值，如等式S2。
Dg(t)＝D(t)-Ds(t)＝D(t)–(D∞/EP∞)*EP(t)[S2]
从完整凝胶结点释放药物的一级速率的计算并不直接来自对D(t)的测量，因为腐蚀改变凝胶的量，但可基于留在完整凝胶上的药物分数来计算。基于释放的腐蚀探针EP(t)，凝胶余留分数是1-EP(t)/EP∞。因此，由该量的凝胶原始携带的药物的量由D∞*(1–EP(t)/EP∞)给出。由于余留在完整凝胶上的药物是D∞-D(t)，完整凝胶上余留的药物分数Df,凝胶(t)如等式S3-S4给出。
Df,凝胶(t)＝[D∞-D(t)]/[D∞*(1–EP(t)/EP∞)][S3]
＝[1–D(t)/D∞]/[1–EP(t)/EP∞][S4]
就药物从该凝胶的一级释放而言，Df,凝胶(t)将显示指数性下降，其具有速率常数kL1，该常数描述药物从完整凝胶释放的速率，等式S5。合并等式S4和S5给出S6，其可用于实验性评价药物直接从完整凝胶释放的速率。
Df,凝胶(t)＝e-kL1t[S5]
Df,凝胶(t)＝[1–D(t)/D∞]/[1–EP(t)/EP∞]＝e-kL1t[S6]
一段时间中凝胶释放的药物的量取决于释放速率，kL1，以及该凝胶的腐蚀速率。若腐蚀探针的溶解可以近似为时间t＝0和t1间的一级过程(具有速率ksol)，那这段时间中药物从凝胶释放的量可大致按等式S7计算。
Dg(t1)＝D∞*(kL1/(ksol))*[1-e-(ksol)t1][S7]
若t1时药物在完整凝胶上余留的量可忽略不计，那么药物直接从凝胶释放的总分数在等式S8中给出。
Dg(t1)/D∞＝kL1/ksol＝t1/2,sol/t1/2.L1[S8]
实施例31
交联密度对脱胶时间的影响
如表1中详列，使内含100mg/mL PEG40kDa-(BCN)8(20mM BCN端基)的水与内含合适量的10mM荧光素-叠氮化物和式(2)化合物(其中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3，且R1＝(4-氯苯基)SO2(10mM叠氮化物))的水，以及内含50mM O-叠氮基乙基-七甘醇的水合并，以制备4％PEG水凝胶，该水凝胶具有4、5、6、7或7.8个交联/8臂PEG单体。将模制凝胶置于1mL0.1M硼酸盐(pH9.2)中，并保持在37℃。该凝胶的分解通过上清液中的OD493来监测。
表1具有不同交联密度的凝胶的制备与脱胶时间。
凝胶在pH9.2下溶解，脱胶时间如表1所示，pH7.4下的脱胶时间按(pH9.2下的脱胶时间)*10(9.2-7.4)来计算，如实施例28所测定。如同预期，脱胶时间随各8臂单体的交联数量的增加而增加。
实施例32
艾塞那肽释放型可降解水凝胶的制备
在α-末端连接至叠氮化物-接头(具有R1＝MeSO2-作为调节物)的艾塞那肽通过固相肽合成法在AnaSpec公司合成(美国加州弗里蒙特)，如先前所述(Santi等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2012)109:6211-6216)，获得式(3)化合物，其中R1＝MeSO2，R2＝H，m＝0，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3，Y＝NH且D＝通过N末端氨基基团连接的艾塞那肽。使内含叠氮化物-接头-艾塞那肽(1.2mg,270nmol)的30μL的1.0M磷酸盐(pH7.8)，和内含8臂PEG40kD-(BCN)8(实施例24；5mg；50μL,1000nmol BCN基团)的50μL的水在常温下放置1小时，然后添加作为腐蚀探针的20μL内含1mM BODIPY-叠氮化物(20nmol)的ACN和式(2)的交联剂的71mL水，式(2)交联剂中m＝0，n＝约100，s＝0，t＝4，W＝O(C＝O)NH，Q＝C(CH2)4，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3，且R1＝CN(3.55mg；710nmol N3基团；实施例23)。使该凝胶固化过夜，然后在4°C储存于1mL的PBS(pH7.4)中。
实施例33
艾塞那肽释放型可降解水凝胶的艾塞那肽释放
将胶盘(实施例32)置于1.0mL的0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.8)中，并保持在37℃。通过定期从上清液取样，分别在280nm和544nm监测艾塞那肽的溶解(作为游离肽或作为溶解的凝胶-艾塞那肽片段)和凝胶腐蚀。结果见图10。按针对凝胶腐蚀调节的溶解计算释放。艾塞那肽的溶解是一级过程，pH8.8时t1/2＝20.7h，若假设该反应是氢氧根离子一级反应，则它对应于pH7.4时的半衰期520h(21天)；针对直接从该水凝胶释放的药物计算(实施例30)，pH8.8时t1/2＝23.6h，对应于pH7.4时的593h(24.7天)，该药物占约87.8％的总艾塞那肽。pH8.8下在172h观察到反向凝胶，对应于pH7.4下的约180天。
实施例34
包封蛋白质从凝胶的扩散
在0.1M KPi(pH7.4)中制备约90OD280/mL肌红蛋白(17.7kDa)、碳酸酐酶(29.0kDa)和BSA(66.4kDa)的储液。PEG水凝胶(4％)通过向100mg/mL20kDaPEG-(DBCO)4(50μL)、蛋白质储液(50μL)和10x-PBS(100μL)的混合物添加100mg/mL PEG20kDa-(NHCO2(CH2)6N3)4(50uL)来制备。使模制凝胶悬浮在2mL0.1M KPi(pH7.4,37℃)，并定时监测溶液中的OD280。释放进入溶液的t1/2值是：肌红蛋白约20分钟，碳酸酐酶24分钟，和BSA150分钟。
实施例35
衍生化的透明质酸的制备
分子量＝1.6x106的透明质酸钠(生命核心生物医药公司(LifecoreBiomedical)；10.4mg，0.0275mmol羧化物)用内含4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐(DMTMM；30.4mg,0.110mmol,4当量)的1.05mL0.1M MES缓冲液(pH5.5)溶液处理。所得混合物剧烈振荡15分钟以溶解。添加内含DBCO-PEG4-NH2(克里克化学工具公司；0.113mL，24.3mM，在2:1ACN:MeOH中，0.00275mmol，0.1当量)的0.3mL的MES缓冲液溶液。所得混合物静置24小时，然后按照以下步骤通过TNBS检验法分析在3.5小时和24小时游离胺的消耗：使0.05mL反应混合物在0.075M硼酸盐缓冲液(pH9.34)中稀释至1mL，该硼酸盐缓冲液包含0.004％w/v2,4,6-三硝基苯磺酸和25％甲醇。观测反应在420nm的吸光度直至稳定(约1h)。采用包含DMTMM、透明质酸或DBCO-PEG4-NH2的反应作为对照。完成后，反应混合物用8mL水稀释，并对水透析5次(12000-14000MWCO)，然后对甲醇透析一次。透析的产物在减压下浓缩至干，并在高真空下用P2O5干燥以获得澄清干燥玻璃状固态的DBCO-透明质酸(11mg,约0.029mmol二糖)。使该物质溶解于3mL水以获得略油极粘的溶液，该溶液包含0.276mM DBCO(基于ε309＝13,448M-1cm-1)。这对应于2.9％的取代率(5.3％基于TNBS测定中消耗的胺)。按照该方法，不同分子量的透明质酸可用环辛炔试剂(如DIFO或BCN)衍生化。
根据如下方法制备胺-衍生化的透明质酸。向内含分子量＝76,000的透明质酸钠(生命核心生物医药公司；154mg,0.385mmol二糖/羧化物)的水(4mL)溶液添加1,3-二氨基丙烷(0.973mL,856mg,11.6mmol,30当量)。用6N HCl将所得溶液的pH调节至7.0(终体积约7mL)，然后添加固体N-羟基琥珀酰亚胺(177mg,1.54mmol,4当量)，然后添加固体1-(3-二甲基氨基)丙基-3-乙基碳二亚胺HCl盐(294mg,1.54mmol,4当量)。反应在进行中变成酸性(10分钟后pH5.3)。每10分钟将pH调节回7.2直至稳定(约1h)。搅拌18小时后，该混合物对PBS、5％NaCl、水(两次)、然后对甲醇透析(12-14k MWCO)。该混合物浓缩至干，获得85mg白色固态的丙基氨基-透明质酸。将一份该物质(7.4mg,约0.019mmol二糖)溶解于水(0.5mL)以获得约38mM二糖溶液。通过TNBS检验法测定该溶液(0.025mL)的游离胺含量，所述TNBS检验通过在pH9.36硼酸盐缓冲液(1mL)(含0.02％w/v TNBS)中孵育来进行。监测在420nm的吸光度直至稳定(约1h)。该测定指示取代度为7％。
向内含分子量＝1.6x106的7％DS丙基氨基HA(0.5mL的0.64mM NH2,320nmol NH2)的水溶液添加0.1mL的100mM PBS，然后添加内含DBCO-PEG4-NHS酯(克里克化学工具公司；0.0308mL，25mM，由ε309＝13,449M-1cm-1,770nmol,2.4当量检测)的甲醇溶液。使所得混合物静置4小时。TNBS检验法指示所述衍生化透明质酸上损失81％的可用胺。采用1.2当量的DBCO-PEG4-NHS酯的平行反应导致消耗64％的可用胺。就纯化而言，合并该两个反应并对PBS，然后5％w/v NaCl，然后水(两次)，然后甲醇(一次)透析(12-14k MWCO)。使该透析混合物浓缩至干以获得2.6mg白色玻璃状固体。使该物质溶解于1mL的水以获得6.5mM二糖和0.31mM DBCO的溶液(基于ε309＝13,448M-1cm-1)，对应于DBCO取代率4.8％，和酰化产率71％。
实施例36
透明质酸水凝胶的制备
透明质酸水凝胶通过使环辛炔-衍生化透明质酸(实施例35)和式(1)的二叠氮化物交联剂交联来制备，其中式(1)中m＝0，X＝O-CO-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3，R1＝PhSO2，R2＝H，一个R5＝H且另一个R5＝(CH2)5N3。凝胶形成一般在水或缓冲水中采用2:1摩尔比的环辛炔/二叠氮化物交联剂，任选在待包封的蛋白质或小分子的存在下进行。
为研究蛋白质从透明质酸水凝胶基体的扩散，通过混合内含DBCO-HA(实施例35)、6.6％DS DBCO、3.9mM DBCO)的水的溶液(0.065mL)和分子量＝2000或5000的二叠氮化物-PEG溶液(0.005mL，25mM，0.5当量/DBCO)制备稳定的水凝胶。该水凝胶主混物0.07mL立即与蛋白质或小分子基质溶液(0.01mL)混合，以供在2.5mL标准塑料池底部包封。从凝胶扩散的半衰期示于下表2：
表2
或者，药物可在凝胶形成之前通过可用的环辛炔亚组与叠氮化物-接头-药物的反应(如上述实施例29和实施例32所述)可释放地连接至透明质酸。在这种情况中，用于凝胶形成的二叠氮化物交联剂的量基于药物连接后剩余的可用环辛炔的量而计算。5-(氨基乙酰胺基)荧光素通过接头与RD＝(4-氯苯基)SO2的连接提供的透明质酸水凝胶在pH7.4，37℃下释放AAF的t1/2＝49h。
实施例37
用控制的化学计算量制备水凝胶的方法
如图11所示，市售可得的S-叔丁基硫-半胱氨酸(H Cys(tBuS))用环辛炔琥珀酰亚胺基酯(例如，DBCO-HSE或BCN-HSE)酰化以获得CO-Cys(tBuS)OH(A’＝COOH；B＝环辛炔；C＝tBuS)。4臂氨基PEG(A＝NH2)用该CO-Cys(tBuS)OH(例如，用碳二亚胺)酰化以获得CO/tBuS-官能化的PEG。使叠氮化物-接头(R11)-药物与环辛炔残基偶联，然后去除tBuS基团(例如，采用硫醇，如二硫苏糖或采用膦如TCEP)，然后经硫醇衍生化的PEG纯化去除小硫醇(例如，采用透析或凝胶过滤色谱)，然后与环辛炔-马来酰亚胺、环辛炔-卤代乙酰胺或环辛炔-乙烯磺酰胺反应以准确引入4个环辛炔凝胶化位点/分子。然后，采用式(1)或(2)化合物使该中间体交联以形成水凝胶，其中反应性官能团是叠氮化物。或者，所述硫醇-衍生化的PEG(在与环辛炔-马来酰亚胺反应之前)还可与式(1)或(2)的化合物聚合，其中反应性官能团是迈克尔受体或烷基化试剂，例如马来酰亚胺、乙烯基砜、乙烯基磺酰胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、卤代乙酸酯或卤代乙酰胺。可类似地使用除S-叔丁基硫醇-半胱氨酸以外的正交保护的衔接物，例如，合适保护的赖氨酸盐/酯、天冬氨酸盐/酯或谷氨酸盐/酯，或非氨基酸型的合成的衔接物。

Claims (39)

1.一种制备生物可降解水凝胶的方法，所述方法包括使至少第一反应性聚合物与可切割的交联剂化合物反应，
其中，所述可切割的交联剂化合物包含与所述反应性聚合物反应的第一官能团和在生理条件下通过消去反应被切割的部分，其中所述部分包含与反应性聚合物反应的第二官能团。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可切割的交联剂化合物具有式(1)
其中
m是0或1；
X包含能够连接至反应性聚合物的官能团和所述第二官能团Z2，所述反应性聚合物在生理条件下能够发生消去反应；
其中，R1、R2和R5中至少一个包含能够连接至聚合物的所述第一官能团Z1；
其中，R1和R2中有且仅有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
R1和R2中至少一个或两个均独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
其中R1和R2可接合形成3～8元环；和
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)p O-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中p＝1～1000。
3.如权利要求2所述的方法，其中
X是琥珀酰亚胺基碳酸酯、磺基琥珀酰亚胺基碳酸酯、硝基苯基碳酸酯、氯甲酸酯、氟甲酸酯，或
其中T*是O、S或NR6，其中R6是H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基，或任选被取代的杂芳烷基；z是1～6；且Y不存在或是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000，且Z2是能够连接至反应性聚合物的官能团。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，Z1和Z2各自独立地包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺；并且其中当一个Z包含N3时，另一个不包含炔或环辛炔；当一个Z包含SH时，另一个不包含马来酰亚胺、丙烯酸酯或丙烯酰胺；当一个Z包含NH2时，另一个不包含CO2H；当一个Z包含1,3-二烯或环戊二烯时，另一个不包含呋喃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可切割的接头化合物具有下式
其中
m是0或1；
n是1～1000；
s是0～2；
t是2、4、8、16或32；
W是O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)S、或
Q是是化合价＝t的核心基团；
其中R1、R2和R5中至少一个包含能够连接至聚合物的官能团Z1，且
R1和R2中至少一个或两个均独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
其中R1和R2可接合形成3～8元环；且
其中R1和R2中有且仅有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，其各自任选被取代；且
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)p O-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中p＝1～1000。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Z1包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，Z1包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，Z1和Z2各自独立地包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和任何第二聚合物选自下组物质的均聚物或共聚物：聚乙二醇、聚丙二醇、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸酯、聚磷腈、聚交酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乙烯亚胺、琼脂糖、右旋糖苷、明胶、胶原、聚赖氨酸、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、果胶或角叉聚糖，其在天然状态下包含合适的反应性官能团或已经衍生化从而包含合适的反应性官能团，或具有式[Z3-(CH2)s(CH2CH2O)n]tQ，其中Z3是反应性官能团，n是10～1000且s、Q和t如权利要求5中所定义。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二反应性聚合物与所述可切割的交联剂化合物依次或同时反应。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一和第二官能团是相同的。
12.一种由权利要求1～11所述的方法制备的水凝胶。
13.如权利要求13所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶还包含药物。
14.如权利要求13所述的水凝胶，其特征在于，所述药物包含在式(3)的残基中
其中R1、R2、R5中至少一个包含第一官能团以供连接至聚合物，并且其中R1、R2、R5和m如权利要求2中所定义；
D是药物残基；且
Y是NH或NBCH2，其中B是H、烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代。
15.一种在生理条件下生物可降解的水凝胶，其中所述水凝胶包含通过接头交联的一种或多种聚合物，所述接头通过消去反应被分解。
16.如权利要求13所述水凝胶，其特征在于，所述接头在置于所述聚合物中时是式(1)的残基，
其中，R1、R2、R5中至少一个如X一样偶联至所述一种或多种聚合物，并且其中R1、R2、R5、m和X如权利要求2中所定义。
17.如权利要求15所述的水凝胶，其特征在于，所述接头是具有式(2)的残基
其中所述R1、R2、R5中至少两个偶联至所述一种或多种聚合物，并且其中R1、R2、R5、m如权利要求2中所定义，并且
n是1～1000；
s是0～2；
t是2、4、8、16或32；
W是O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)S、或；
18.如权利要求15～17中任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶还包含药物。
19.如权利要求18所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括式(3)的残基
其中，R1、R2、R5中至少一个包含第一官能团以供连接至聚合物，并且其中R1、R2、R5和m如权利要求2中所定义；
D是药物残基；并且
Y是NH或NBCH2，其中B是H、烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代。
20.如权利要求16或17所述的水凝胶，其特征在于，所述聚合物具有式[Z3-(CH2)s(CH2CH2O)n]tQ，其中Z3是反应性官能团，n是10～1000且s、Q和t如权利要求5中所定义。
21.一种式(4)的交联化合物
其中，R1、R2和R5中至少一个还包含能够连接至聚合物的第一官能团Z1；
其中
m是0或1；
R6是H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基或任选被取代的杂芳烷基；
v是1～6；
Y不存在或是OR7或SR7，其中R7是任选被取代的亚烷基、任选被取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p＝1～1000；
Z2是能够连接至反应性聚合物的官能团；
R1和R2中至少一个或两个均独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
其中R1和R2可接合以形成3～8元环；且
其中R1和R2中有且仅有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，其各自任选被取代；且
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)p O-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中p＝1～1000。
22.如权利要求21所述的化合物，其特征在于，Z1和Z2各自包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯、乙烯基砜、乙烯基磺酰胺或丙烯酰胺，并且其中当一个Z包含N3时，另一个Z不包含炔或环辛炔；当一个Z包含SH时，另一个Z不包含马来酰亚胺、丙烯酸酯或丙烯酰胺；当一个Z包含NH2时，另一个Z不包含CO2H；当一个Z包含1,3-二烯或环戊二烯时，另一个Z不包含呋喃。
23.一种式(2)的交联化合物
其中
其中在至少两种情况下R1、R2和/或R5还包含能够连接至聚合物的官能团Z；
m是0或1；
n是1～1000；
s是0～2；
t是2、4、89、16或32；
W是O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)S、或
Q是化合价＝t的核心基团；
R1和R2中至少一个或两个均独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
其中R1和R2可接合以形成3～8元环；且
其中R1和R2中有且仅有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，其各自任选被取代；且
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)p O-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中p＝1～1000。
24.如权利要求23所述的化合物，其特征在于，Z1包含N3、NH2、NH-CO2 tBu、SH、StBu、马来酰亚胺、CO2H、CO2 tBu、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基砜或乙烯基磺酰胺。
25.如权利要求23所述的化合物，其特征在于，Q是季戊四醇、三季戊四醇或六甘油。
26.一种制备释药型可降解水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含反应性官能团的第一多价聚合物与低于化学计算量的式(3)接头-药物反应，从而形成载药第一聚合物
其中R1、R2和R5之一被能与所述第一聚合物上存在的反应性官能团反应的基团取代，
其中
m是0或1；
D是药物残基；
Y是O、NH或NBCH2，其中B是H、烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
或R1和R2中至少一个或两个均独立地是CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮共同形成杂环；
SR4其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；
其中R1和R2可接合以形成3～8元环；和
其中R1和R2中有且仅有一个可以是H或可以是烷基、芳烷基或杂芳烷基，其各自任选被取代；且
R5各自独立地是H或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)p O-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代，其中p＝1～1000；
(b)任选地分离所述载药第一聚合物；和
(c)使所述载药第一聚合物上剩余的反应性官能团与可切割的式(1)或式(2)的交联化合物交联，从而形成水凝胶。
27.一种通过权利要求26所述的方法制备的释药型可降解水凝胶。
28.如权利要求27所述的释药型可降解水凝胶，其特征在于，所述第一聚合物上的反应性官能团是环辛炔，并且式(1)、(2)和(3)的化合物上的反应性官能团是叠氮化物。
29.如权利要求27所述的释药型可降解水凝胶，其特征在于，D是艾塞那肽。
30.如权利要求27所述的释药型可降解水凝胶，其特征在于，
所述第一聚合物是在各臂末端包含环辛炔基团的8臂聚乙二醇；并且
式(3)的接头-药物具有下式
其中，R1＝CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R9独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环；或
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代。
31.如权利要求30所述的水凝胶，其特征在于，所述可切割的交联化合物具有式(2)。
32.如权利要求31所述的水凝胶，其特征在于，在所述式(2)中，m是0，n是90～110，s是0，t是4，W是O(C＝O)NH，Q是C(CH2)4，R1是CN，R2和一个R5是H，且另一个R5是(CH2)5N3。
33.如权利要求32所述的水凝胶，其特征在于，式(3)中的R1是SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其
连接的氮一同形成杂环。
34.如权利要求33所述的水凝胶，其特征在于，式(3)中的R1是MeSO2。
35.一种释药型可降解的水凝胶，其中式[Z3-(CH2)s(CH2CH2O)n]tQ的多臂聚
合物通过式(1)或式(2)的可切割的交联化合物交联，其中Z3是反应性官能团，n是510～1000且s、Q和t如权利要求5中所定义，所述水凝胶偶联有式(3)的接头-药物
其中R1＝CN；NO2；
任选被取代的芳基；
任选被取代的杂芳基；
任选被取代的烯基；
任选被取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团
与其连接的氮一同形成杂环；或
SR4，其中
R4是任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；或
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代。
36.如权利要求35所述的水凝胶，其特征在于，所述可切割的交联化合物具有式(2)。
37.如权利要求36所述的水凝胶，其特征在于，所述式(2)中，m是0，n是90～110，s是0，t是4，W是O(C＝O)NH，Q是C(CH2)4，R1是CN，R2和一个R5是H，且另一个R5是(CH2)5N3。
38.如权利要求35～37中任一项所述的水凝胶，其特征在于，式(3)中的R1是SO2R3，其中
R3是H或任选被取代的烷基；
芳基或芳烷基，其各自任选被取代；
杂芳基或杂芳烷基，其各自任选被取代；或
OR9或NR9 2，其中R9各自独立地是H或任选被取代的烷基，或两个R9基团与其连接的氮一同形成杂环。
39.如权利要求38所述的水凝胶，其特征在于，式(3)中的R1是MeSO2。
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