CN103937725B - 一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，主要包括以下步骤：a)菌种活化与增殖培养；b)收集菌体；c)预冻及真空冷冻干燥。本发明通过将嗜热链球菌菌种接种于含白扁豆多糖等物质的增殖抗冻培养基中进行增殖，增殖的菌液经离心处理，再加入含薏苡仁和山药混合多糖提取物等的冻干保护剂，预冻及真空冷冻干燥处理，得到冻干菌粉，其冻干存活率和菌粉活菌数高，同时更好地开发利用了我国“药食同源”中的药物资源。

Description

一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法

技术领域

本发明属于嗜热链球菌制品生产技术领域，涉及一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法。

背景技术

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是发酵生产乳制品的重要乳酸菌之一，其在发酵过程中，除进行产酸代谢外，还产生2,3-丁二酮等酸奶特有的风味物质，还能促进保加利亚乳杆菌的生长，同时也是重要的益生菌之一，其具有调节人体胃肠道菌群平衡、抗突变、增强免疫力等能力。

在发酵剂制备过程中，常用的是真空冷冻干燥法，菌种在真空冷冻干燥后：酶的活性丧失少、冻干燥菌粉复水性好、脱水彻底、保存期长、储存运输和使用都很方便，为直投式发酵剂提供良好的基础。但是，在实际的使用时，冷冻干燥过程中水的结晶、细胞的失水、蛋白失活等情况使得菌体出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产使用非常不利。因此需要对菌粉制备方法进行改进。

对于嗜热链球菌冻干菌粉制备的改进方法有很多种，如进行增殖培养、抗冻因子添加、保护剂配方的制备等。如专利CN102952771B公开了一种嗜热链球菌冻干保护剂和制备方法，其冻干保护剂配方如下：脱脂乳粉10-20份、棉籽糖3-10份、大豆低聚糖4-10份、右旋糖酐D401.5-5.0份、三磷酸钠0.3-0.8份、没食子酸丙酯0.005-0.02份、蒸馏水100份。专利CN100429980C公开了一种直投式酸奶发酵剂的生产方法，其培养基配方为(质量百分比)：脱脂乳粉0.1-15％、乳清粉0.1-10％、酵母膏0.1-5％、番茄汁1-10％，其余为水；其保护剂配方为(质量百分比)：谷氨酸钠0.1-5.0％、乳糖0.1-8.0％、甘油0.1-5.0％、聚乙烯吡咯烷酮0.1-3.0％、Vc0.1-5％。专利CN101502287B也公开了一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，其所使用的培养基为(质量百分比)：1-2％葡萄糖、0.5-1％蛋白胨、0.1-10％乳清粉、1-5％酵母膏、0.1-0.5％柠檬酸二铵、0.01-0.2％磷酸氢二钾、0.1-0.5％无水乙酸钠；其所使用的保护剂为：重量百分比1-30％的奶粉及0.1-2％的抗氧化剂(异维生素C或谷氨酸或甘氨酸)。CN103404703A公开了一种稳定安全的嗜热链球菌活菌制剂及其制备方法，其培养基配方为：酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH₂PO₄2g、西红柿汁100mL、Tween800.5mL、蒸馏水900mL。专利CN102766590B公开了一种嗜热链球菌增菌培养基及制备方法，其配方如下：葡萄糖0.8-1.2g、酵母膏0.5-1.0g、大豆蛋白胨0.5-1.0g、番茄汁8-12mL、低聚木糖0.2-0.4g、水88-92mL、KH₂PO₄0.1-0.2g和吐温800.01-0.05mL。CN102978150A公开了一种嗜热链球菌复合抗冻因子，其配方如下(以质量份数计)：甜菜碱0.1-0.4份、氯化钠3-5份、甘露糖0.5-3份和碳酸钙0.1-0.4份。另外有许多研究文献也公开了嗜热链球菌的菌粉制备方法，如“嗜热链球菌的筛选及其高活性菌粉制备”中研究得到的增殖培养基配方为：酵母粉0.5％、番茄汁7.5％、麦芽汁7.5％、乳清粉7.5％；保护剂配方为：海藻糖20％、乳糖2.5％、谷氨酸钠5％、甘油0.5％。

冻干保护剂的使用极大地提高了菌体在真空冷冻干燥下的存活率和冻干菌粉的稳定性，而在培养基中添加一些可以促进细胞产生抗冻效果的分子物质也有利于其冻干菌粉的制备。这些物质的添加也可改变嗜热链球菌细胞膜脂肪酸组成，甚至诱导细胞产生大量的抗冻蛋白，从而有效提高嗜热链球菌菌体的抗冷冻能力，可以达到减少甚至避免菌体冻干损伤、提高活菌存活率和菌粉活菌数、减少复合冻干保护剂的添加量、延长冻干嗜热链球菌菌粉常温保存期的目的。

白扁豆、薏苡仁和山药作为***颁布的“药食同源”药物，其所含的多糖对人体具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、增强免疫力等作用，此外，这些多糖还可以有效刺激乳酸菌的菌体增殖，也可以作为抗冻因子，并且在冻干保护方面也具有良好效果。目前，使用这一类型多糖在冻干菌粉制备方面的报道和发明专利极少。

发明内容

本发明的目的是提供一种更好地开发利用我国中药资源作为冻干保护剂、提高菌体抗冻能力的嗜热链球菌冻干菌粉制备方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

a)菌种活化与增殖培养：将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖抗冻培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；

b)收集菌体：将上述增殖的菌液离心处理，弃去上清液，得到菌泥；

c)干燥：在所制备的菌泥中按每克菌泥添加0.14-0.2g蔗糖、0.12-0.18g可溶性淀粉、0.002-0.004g Vc、0.5-1.0mL的磷酸缓冲液、0.1-0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀后真空冷冻干燥，即得嗜热链球菌冻干菌粉；

所述増殖抗冻培养基配方组成为：10-20g葡萄糖、10-25g大豆蛋白胨、5-10g酪蛋白水解物、0.005-0.010mg谷氨酸、2-4g KH₂PO₄、0.5-1mL吐温80、白扁豆多糖0.2-0.5g、蒸馏水1000mL。

所述步骤a)中活化是指将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中于35-38℃培养22-26h，再按每100mL培养基中接种2-5mL菌种的比例，接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每100mL增殖抗冻培养基中接种2-5mL已活化的菌种。

所述步骤a)中增殖培养是于35-38℃下培养16-18h。

所述培养基均已灭菌，且所述增殖抗冻培养基经过118-121℃、15min灭菌处理并室温冷却。

所述白扁豆多糖的制备步骤包括：

首先将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8；

其次在40-55℃的水浴温度下加入白扁豆质量0.5-2％、活力为8000-10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1-2％、活力为20000-30000U/g的果胶酶，保温1.5-2.5h后加热至沸腾，再保温15-20min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣于45-55℃烘干，即得白扁豆粗多糖；

最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加热至50-70℃的蒸馏水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15-20mL蒸馏水的比例计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1-4％的木瓜蛋白酶，酶解0.5-1h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25％体积的Sevag试剂除蛋白20-30min；2000-4000rpm离心15-20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

所述步骤b)中离心处理为0-4℃、8000-10000rpm离心15-20min。

所述薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备步骤包括：

首先将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至6.0-7.0，在80-100℃水浴温度下提取1-2h，冷却至40-55℃；

接着在40-55℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1-2.5％的果胶酶和0.8-1％的α-淀粉酶，并保温1.5-2.0h后加热至沸腾，再保温10-15min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入3-4倍体积的95％乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖；

最后用80％乙醇溶液洗涤粗混合多糖，过滤后将所得沉淀于45-55℃烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。

所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行18-24h。

所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在-40℃预冻6-14h。

与现有技术相比，本发明中嗜热链球菌菌种是在含白扁豆多糖等物质的增殖抗冻培养基中进行增殖的，增殖的菌液经离心处理，再加入含薏苡仁和山药混合多糖提取物等的冻干保护剂，预冻及真空冷冻干燥处理，得到冻干菌粉，本发明中采用白扁豆多糖等作为抗冻因子，使嗜热链球菌具有更高的活菌数和更好的抗冻能力，同时使用薏苡仁和山药混合多糖提取物等为冻干保护剂，使菌粉有更高的存活率，根据本发明制备的嗜热链球菌冻干菌粉可使其冻干存活率最高可达80.19％，菌粉活菌数为2.32×10¹¹cfu/g；而以常用的商业M17培养基培养、使用磷酸缓冲液为冻干保护剂制备的嗜热链球菌菌粉冻干存活率最高仅为22.72％，活菌数最高仅为8.1×10⁹cfu/g。而上述中药多糖的保健功效也大大提高了该菌粉的使用价值，本发明更好地开发利用了我国“药食同源”中的药物资源、开拓乳酸菌保健功能、提高中药资源和乳酸菌的综合使用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

a)菌种活化与增殖培养：

将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的M17液体培养基中，于37℃培养22-26h，再按体积比(v/v)为3％的比例接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，即每100mL培养基中接种3mL菌种，并在相同条件下活化至第三代。

向增殖抗冻培养基中接入3％(v/v)已活化的嗜热链球菌，37℃恒温培养16h。

b)收集菌体：

然后在0℃、10000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。

c)预冻及真空冷冻干燥：

向每克菌泥加入0.14g蔗糖、0.14g可溶性淀粉、0.002gVc、0.5mL的磷酸缓冲液、0.1g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于-40℃预冻8h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行真空冷冻干燥24h，即得嗜热链球菌冻干菌粉。

其冻干存活率可为78.25％(对照培养基为21.21％)，菌粉活菌数达1.62×10¹¹CFU/g(对照培养基为7.2×10⁹CFU/g)。

其中，嗜热链球菌增殖抗冻培养基的配置包括：准确称取20g葡萄糖、10g大豆蛋白胨、5g酪蛋白水解物、0.005mg谷氨酸、3g KH₂PO₄、1mL吐温80、0.4g白扁豆多糖，并溶解于1000mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量80％盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插1mL注射器针头，于118℃灭菌15min后拔下针头，冷却至室温，即得嗜热链球菌增殖抗冻培养基。

白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤：将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于150份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在45℃的水浴温度下加入白扁豆质量1.5％、活力为8000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1％、活力为30000U/g的果胶酶，保温2h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温20min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置10h后抽滤，所得滤渣于50℃烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴至55℃的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1％的木瓜蛋白酶，酶解0.6h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15％体积的Sevag试剂除蛋白20min，其中Sevag试剂中氯仿：正丁醇＝4：1，2000rpm离心15min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备：将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后混合浸泡于150份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至6.0-7.0，在80℃水浴温度下提取2h，冷却至40℃后，在40℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1％的果胶酶和0.8％的α-淀粉酶，并保温2.0h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温10min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，在冰箱中静置10h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80％乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于45℃烘干，即得薏苡仁和山药粗多糖混合提取物。

实施例2

a)菌种活化与增殖培养：

将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的M17液体培养基中，于35℃培养22-26h，再按4％(v/v)比例接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

向增殖抗冻培养基中接入4％(v/v)已活化的嗜热链球菌，36℃恒温培养16h。

b)收集菌体：

然后在0℃、9000rpm下离心18min，弃去上清液，获得菌泥。

c)预冻及真空冷冻干燥：

向每克菌泥加入0.18g蔗糖、0.17g可溶性淀粉、0.003gVc、0.8mL的磷酸缓冲液、0.2g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于-40℃预冻10h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行真空冷冻干燥20h，即得嗜热链球菌冻干菌粉。

其冻干存活率可为77.82％(对照培养基为22.72％)，菌粉活菌数达1.21×10¹¹CFU/g(对照培养基为8.1×10⁹CFU/g)。

其中，嗜热链球菌增殖抗冻培养基的配置包括：准确称取18g葡萄糖、24g大豆蛋白胨、8g酪蛋白水解物、0.008mg谷氨酸、2gKH₂PO₄、0.5mL吐温80、0.3g白扁豆多糖，并溶解于1000mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量80％盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插1mL注射器针头，于118℃灭菌15min后拔下针头，冷却至室温。即得嗜热链球菌增殖抗冻培养基。

白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤：将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于125份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在40℃的水浴温度下加入白扁豆质量1％、活力为9000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1.5％、活力为20000U/g的果胶酶，保温2.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温18min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置10h后抽滤，所得滤渣于55℃烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于15mL、水浴至50℃的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量3％的木瓜蛋白酶，酶解0.5h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液18％体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)除蛋白25min，3000rpm离心20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备：将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后混合浸泡于200份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在100℃水浴温度下提取1h，冷却至45℃后，在45℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量2％的果胶酶和1％的α-淀粉酶，并保温1.5h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温13min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，在冰箱中静置12h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80％乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于50℃烘干，即得薏苡仁和山药粗多糖混合提取物。

实施例3

a)菌种活化与增殖培养：

将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的M17液体培养基中，于38℃培养22-26h，再按2％(v/v)比例接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

向增殖抗冻培养基中接入5％(v/v)已活化的嗜热链球菌，35℃恒温培养17h。

b)收集菌体：

然后在4℃、10000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。

c)预冻及真空冷冻干燥：

向每克菌泥中加入0.2g蔗糖、0.12g可溶性淀粉、0.004gVc、1.0mL的磷酸缓冲液、0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于-40℃预冻14h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行真空冷冻干燥22h，即得嗜热链球菌冻干菌粉。

其冻干存活率可为79.60％(对照培养基为20.42％)，菌粉活菌数达2.02×10¹¹CFU/g(对照培养基为7.8×10⁹CFU/g)。

其中，嗜热链球菌增殖抗冻培养基的配置包括：准确称取15g葡萄糖、18g大豆蛋白胨、10g酪蛋白水解物、0.010mg谷氨酸、4gKH₂PO₄、0.8mL吐温80、0.5g白扁豆多糖，并溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量80％盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插1mL注射器针头，于119℃灭菌15min后拔下针头，冷却至室温，即得嗜热链球菌增殖抗冻培养基。

白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤：将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在55℃的水浴温度下加入白扁豆质量2％、活力为10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量2％、活力为20000U/g的果胶酶，保温1.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温20min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置14h后抽滤，所得滤渣于50℃烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴至70℃的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量4％的木瓜蛋白酶，酶解1h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液25％体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)除蛋白30min，4000rpm离心20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后混合浸泡于200份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在90℃水浴温度下提取1.5h，冷却至50℃后，在50℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1.5％的果胶酶和1％的α-淀粉酶，并保温2.0h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温15min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇，在冰箱中静置14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80％乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于55℃烘干，即得薏苡仁和山药粗多糖混合提取物。

实施例4

a)菌种活化与增殖培养：

将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的M17液体培养基中，于36℃培养22-26h，再按5％(v/v)比例接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

向增殖抗冻培养基中接入2％(v/v)已活化的嗜热链球菌，38℃恒温培养18h。

b)收集菌体：

然后在2℃、8000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。

c)预冻及真空冷冻干燥：

向每克菌泥中加入0.16g蔗糖、0.18g可溶性淀粉、0.003gVc、0.9mL的磷酸缓冲液、0.2g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀，于-40℃预冻6h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行真空冷冻干燥18h，即得嗜热链球菌冻干菌粉。

其冻干存活率可为80.19％(对照培养基为21.65％)，菌粉活菌数达2.32×10¹¹CFU/g(对照培养基为7.9×10⁹CFU/g)。

其中，嗜热链球菌增殖抗冻培养基的配置包括：准确称取10g葡萄糖、25g大豆蛋白胨、7g酪蛋白水解物、0.0007mg谷氨酸、3gKH₂PO₄、0.7mL吐温80、0.2g白扁豆多糖，并溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解、搅拌均匀，再调pH值至6.4-6.6，按照装量80％盛放于厌氧瓶中，并在瓶盖的橡胶塞上向内插1mL注射器针头，于121℃灭菌15min后拔下针头，冷却至室温，即得嗜热链球菌增殖抗冻培养基。

白扁豆多糖的制备方法包括以下步骤：将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于140份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8，在50℃的水浴温度下加入白扁豆质量0.5％、活力为10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量2％、活力为30000U/g的果胶酶，保温2.5h后于电磁炉上加热至沸腾，其后调节电磁率功率为1000W保温15min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，在冰箱中静置12h后抽滤，所得滤渣于45℃烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于18mL、水浴至60℃的蒸馏水中计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量2％的木瓜蛋白酶，酶解0.8h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液20％体积的Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)除蛋白28min，3000rpm离心18min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备:将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药(1:1混合)粉碎后混合浸泡于180份蒸馏水中，调节pH值至6.0-7.0，在90℃水浴温度下提取1h，冷却至55℃后，在55℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量2.5％的果胶酶和0.9％的α-淀粉酶，并保温1.8h，其后于电磁炉上加热至沸腾，保温12min，然后使用布氏漏斗抽滤，将滤液于旋转蒸发仪上浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇，在冰箱中静置13h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖，用80％乙醇溶液洗涤粗多糖，过滤后将所得沉淀于52℃烘干，即得薏苡仁和山药粗多糖混合提取物。

Claims (8)

1.一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)菌种活化与增殖培养：将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖抗冻培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；

b)收集菌体：将上述增殖的菌液离心处理，弃去上清液，得到菌泥；

c)干燥：在所制备的菌泥中按每克菌泥添加0.14-0.2g蔗糖、0.12-0.18g可溶性淀粉、0.002-0.004g Vc、0.5-1.0mL的磷酸缓冲液、0.1-0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀后真空冷冻干燥，即得嗜热链球菌冻干菌粉；

所述増殖抗冻培养基配方组成为：10-20g葡萄糖、10-25g大豆蛋白胨、5-10g酪蛋白水解物、0.005-0.010mg谷氨酸、2-4g KH₂PO₄、0.5-1mL吐温80、白扁豆多糖0.2-0.5g、蒸馏水1000mL；

所述白扁豆多糖的制备步骤包括：

首先将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8；

其次在40-55℃的水浴温度下加入白扁豆质量0.5-2％、活力为8000-10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1-2％、活力为20000-30000U/g的果胶酶，保温1.5-2.5h后加热至沸腾，再保温15-20min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣于45-55℃烘干，即得白扁豆粗多糖；

最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加热至50-70℃的蒸馏水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15-20mL蒸馏水的比例计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1-4％的木瓜蛋白酶，酶解0.5-1h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25％体积的Sevag试剂除蛋白20-30min；2000-4000rpm离心15-20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖；

所述薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备步骤包括：

首先将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至6.0-7.0，在80-100℃水浴温度下提取1-2h，冷却至40-55℃；

接着在40-55℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1-2.5％的果胶酶和0.8-1％的α-淀粉酶，并保温1.5-2.0h后加热至沸腾，再保温10-15min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入3-4倍体积的95％乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖；

最后用80％乙醇溶液洗涤粗混合多糖，过滤后将所得沉淀于45-55℃烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中活化是指将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中于35-38℃培养22-26h，再按每100mL培养基中接种2-5mL菌种的比例，接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

3.根据权利要求2所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每100mL增殖抗冻培养基中接种2-5mL已活化的菌种。

4.根据权利要求3所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中增殖培养是于35-38℃下培养16-18h。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述培养基均已灭菌，且所述增殖抗冻培养基经过118-121℃、15min灭菌处理并室温冷却。

6.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤b)中离心处理为0-4℃、8000-10000rpm离心15-20min。

7.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行18-24h。

8.根据权利要求1或7所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在-40℃预冻6-14h。