CN103931965A

CN103931965A - 利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法

Info

Publication number: CN103931965A
Application number: CN201410058749.1A
Authority: CN
Inventors: 郑晓冬; 朱瑞瑜; 余挺; 郭峻; 郭双欢
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-02-20
Also published as: CN103931965B

Abstract

本发明公开了一种利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌悬液放入被棒曲霉素污染的液态物中，直至Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的终浓度为0.9～1.1×10⁵CFU/mL，在150～250rpm的摇床中于24～26℃降解处理2～4天；从而实现棒曲霉素的降解。采用该方法降解棒曲霉素，具有成本低、降解效果好、安全性好、无二次污染的特点。

Description

利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法

技术领域

本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种利用安全的海洋酵母降解真菌毒素棒曲霉素的方法。

背景技术

棒曲霉素（patulin，4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2(6H)-one）是一种水溶性的大环内酯，存在于一些腐烂的水果（如苹果、柑橘、石榴、梨等）及其制品中。棒曲霉素可由不少真菌产生，主要包括曲霉属真菌（Aspergillus），青霉属真菌（Penicillium）以及拟青霉属真菌（Paecilomyces），其中青霉属真菌是自然界中棒曲霉素的主要生产者。

棒曲霉素是一种对人畜有毒性的真菌毒素。目前报道中已知的急性毒性包括恶心、溃疡；慢性毒性包括神经毒性、免疫毒性、基因毒性、抑制免疫***、致癌致畸致突变等。另外，在分子生物学层面，棒曲霉素可抑制DNA合成、蛋白质的交联、与谷胱甘肽发生反应等。各国科学家对本国所产的苹果制品和柑橘类制品（主要是苹果汁）中的棒曲霉素进行检测，发现欧洲部分国家、韩国和日本，对食品中棒曲霉素的控制较好，而一些地方如西班牙、意大利、南非、印度和中国等，食品中棒曲霉素的检出率较高，而且部分样品超标很严重。比如研究人员最近从中国东北的超市里抽取苹果制品进行棒曲霉素的检测，发现16%的产品棒曲霉素含量超标（最高可达97.7ppb，而国标规定是低于50ppb），只有12.6%的样本其棒曲霉素含量低于检测限。

棒曲霉素是扩展青霉产生的二次代谢产物。虽然现在人们已拥有很多果蔬保鲜剂、杀菌剂以及保鲜手段（如低温储运、气调等），但抑制真菌生长和降低真菌毒素的分泌两者之间并不一定相关。现行的不少用于果蔬保鲜的物质或者手段（如低温、气调等）虽然能有效降低果蔬病害的发生，但它们对相应的真菌毒素的控制并无效果，相反，有一些保鲜产品或者保鲜手段反而促使真菌产生更多的毒素。这是因为不少真菌在不利于生长的逆境中，会分泌更多的真菌毒素等二次代谢产物，来增强自身的竞争能力。实例来说，据报道，体外实验中，在培养扩展青霉的培养基中加入克菌丹（Captan）、多菌灵（Carbendazim）、乙嘧酚磺酸酯（Bupirimate）等杀菌剂时，可以诱导扩展青霉产生更多的棒曲霉素。另有研究表明，经过生物制剂处理的有机苹果中的棒曲霉素含量高于经过传统农业（采用杀菌剂）栽培的苹果，对这个现象的解释还未形成定论。课题组对气调储藏的苹果进行研究，发现经过不同的气调处理的苹果虽然在发病率上有显著差异，但在棒曲霉素的含量上却无差异，说明在此处理下，病斑的大小和棒曲霉素的含量并不相关。总而言之，保鲜剂和保鲜手段虽然能控制真菌的生长，但并不能减少真菌分泌棒曲霉素的量。

由于棒曲霉素在酸性环境下很稳定，因此一旦存在（被棒曲霉素污染的水果及其制品多为酸性环境），便很难通过常规方法去除。目前有报道利用臭氧、放射性元素、热处理、大孔树脂吸附等物理化学方法，对棒曲霉素进行去除。但这些方法有的成本较高，有的对环境或人体有负面影响，有的降解效果欠佳，因此并不很理想。相比较而言，生物方法更加安全、低成本。不少文献报道表明，利用微生物对棒曲霉素进行降解，不仅非常的有效，而且成本低廉，安全性高，其降解产物的毒性也比棒曲霉素本身要小。目前已报道的可降解棒曲霉素的微生物包括氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，需要在无氧环境下）、瘤胃中的微生物群、红酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）以及毕赤酵母（Pichia membranifaciens及Pichiacaribbica）等。

红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）是一株从海洋中分离出来的安全的生防酵母。据研究，该酵母能适应高渗透压的环境，并且对小番茄、冬枣以及柑橘的采后病害控制非常有效。但目前并没有研究表明，红冬孢对棒曲霉素本身有降解作用。

该红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）亦名该海洋酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心（International Mycological Institute，CABI Genetic ResourceCollection），保藏地址：英国TW209TY萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期：2006.4.19，保藏编号：IMI394084。

上述海洋酵母细胞悬浮液已被用于生产生物保鲜剂，该专利的申请号为200610155209.0。

上文中涉及的参考文献具体如下：

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、降解效果好、安全性好、无二次污染的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌悬液放入被棒曲霉素污染的液态物中，直至Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的终浓度为0.9～1.1×10⁵CFU/mL（例如为1×10⁵CFU/mL），在150～250rpm（较佳为180rpm）的摇床中于24～26℃（较佳25℃）降解处理2～4天；从而实现棒曲霉素的降解。

作为本发明的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法的改进：

被棒曲霉素污染的液态物的pH＜7（较佳为pH≤6）。

作为本发明的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法的进一步改进：

Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌悬液的制备方法为：

从NYDA培养基斜面中挑取Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种于NYDB培养液中，于24～26℃（较佳25℃）、150～250rpm（较佳为180rpm）的条件下进行活化；然后调节至每ml的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液中含有4～6×10⁶CFU（例如为5×10⁶CFU）的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体；

NYDA培养基的配方为：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+20g琼脂+1L蒸馏水；

NYDB培养液的配方为：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+10g氯化钠+1L蒸馏水；调节pH值至6.0。

活化包括在NYDB培养液中第一代培养24h，第二代培养36h。

备注说明：本发明中的NYDA培养基的配方均属于常规技术，而NYDB培养液属于改进后的配方。

NYDA：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+20g琼脂+1L蒸馏水；然后高温灭菌（为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

NYDB：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+10g氯化钠+1L蒸馏水；调节pH值至6.0（采用常规方式调节）；然后高温灭菌（为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

采用经过两代液体培养的红冬孢酵母，是为了获得具有较佳活性的菌体。

本发明是以菌株Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的悬浮液为有效成份，将其放入到被棒曲霉素污染的液态物中，从而达到生物降解棒曲霉素的效果。

在本发明中，酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman，即为红冬孢酵母，分类命名为Rhodosporidium paludigenum，菌株编号为Fell&Tallman，被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心（International Mycological Institute，CABIGenetic Resource Collection），保藏编号：IMI394084，详见www.cabi.org。棒曲霉素，为标品，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

在本发明中，通过血球计数板计数的方法，控制调节Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液的菌体的量。

研究表明Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液能有效降解棒曲霉素，经过进一步试验证实，其主要机理为生物降解（酶反应）。随着人们对食品安全的高度重视，利用安全、有效的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman降解棒曲霉素的方法有着广阔的实际应用前景和研究价值。

本发明具有如下优点：

1）、降解效率高，应用效果好：

本发明采用Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman生物降解棒曲霉素，能在较短时间内有效降解被棒曲霉素污染的液态物（例如果汁），降解效率高；而棒曲霉素被降解后产物的毒性远远低于棒曲霉素本身的毒性，不造成二次污染。同时，利用红冬孢酵母降解棒曲霉素的生物方法相比起一些物理、化学方法，具有安全、无污染、高效等优势。因此，本发明的方法可大范围推广使用。

2）、成本低廉，易获得：

Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman是从海洋分离得到的天然、安全酵母菌株，存在于大自然中，来源广泛，易于获取。Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman对生长环境要求不苛刻，且耐高渗透压，易于培养，成本低廉，因此可大量培养，应用于实际。

3）、使用方便，操作简单。

本发明采用的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌株易于培养，只需通过最基础的微生物接种、培养操作，即可获得具有高降解活性的菌体悬浮液。

本发明的实际用法和用量如下：

在被污染了棒曲霉素的液态物（棒曲霉素的浓度≤200ppm即可，较佳为棒曲霉素的浓度≤30ppm）中加入已活化的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体制成的菌悬液，直至菌体的最终浓度为0.9～1.1×10⁵CFU/mL（最佳为1×10⁵CFU/mL）。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液在NYDB中降解棒曲霉素的效果图。

图2为本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液在苹果汁中降解棒曲霉素的应用效果图。

图3为棒曲霉素对大肠杆菌的毒性图。

图4为本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液在NYDB中降解棒曲霉素后，降解产物对大肠杆菌的毒性图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1、红冬孢酵母生物降解NYDB中的棒曲霉素，依次进行如下步骤：

1）、菌悬液的制备：

从NYDA培养基斜面中挑取Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的单菌落接种于装有50mL的NYDB的250mL锥形瓶中，于25℃，180rpm的条件下进行活化，活化过程包括在NYDB中第一代培养24h，第二代培养36h；即，在25℃、180rpm转速的摇床中培养24小时；然后在无菌条件下吸取1mL菌体悬浮液于新鲜灭菌的装有50mL的NYDB的250mL锥形瓶中，于25℃、180rpm的摇床中培养36小时。

然后调节至每ml的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液中含有5×10⁶CFU的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体。

NYDA：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+20g琼脂+1L蒸馏水，然后进行常规的高压灭菌。

NYDB：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+10g氯化钠+1L蒸馏水，调节pH值至6.0，然后进行常规的高压灭菌。

2）、NYDB中棒曲霉素的降解：

往无菌的50mL离心管中加入NYDB以及棒曲霉素溶液，再加入Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman菌悬液；使菌体的最终浓度达到1×10⁵CFU/mL，用灭菌的8层纱布包裹管口，放置于25℃摇床中培养，转速为180rpm。

具体如下：

将5mg的棒曲霉素标品溶解于20mL乙酸乙酯中，吸取5mL于氮吹仪中吹干，溶解于2.5mLNYDB中，制成棒曲霉素溶液。向4.8mL的NYDB中加入100μL棒曲霉素溶液（即50μg棒曲霉素，其最终浓度为10ppm）以及100μL浓度为5×10⁶CFU/mL的Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman菌悬液，混合均匀，从而使菌体的最终浓度达到1×10⁵CFU/mL。以不加Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液的处理为空白对照。每个处理及空白对照各设三个平行。检测的时间点分别为1天、2天、3天、4天。

棒曲霉素的检测方法如下：

1）样品处理：吸取5mL培养后所得物入50mL离心管中，向每管中加入5mL乙酸乙酯，盖上匹配的管盖，于250rpm小摇床中振荡10分钟，再于3000rpm的离心机中离心3分钟。吸取3mL上清液，氮气吹干，溶于1mL去离子水中（用乙酸调节pH值至4.0），用2.5μm的滤膜过滤后放置，进行HPLC检测。

2）HPLC检测：检测方法如下，

流动相为10%乙腈+90%水（为体积%），流速为0.75mL/min，检测波长为276nm，柱温35℃，进样量50μL。所选取的柱子为250mm×4.6mm（内径），粒径5μm的C18柱。实验中棒曲霉素的出峰时间为11min。

以上实验重复3次。

实验结果如图1。经过4天的降解实验，处理组中棒曲霉素的含量随着时间不断下降。经过1天的培养，有29.79%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为35.1μg）；到了第二天，棒曲霉素几乎完全被降解（降解率达到98.55%，即，经检测棒曲霉素含量仅为0.725μg）；第4天已经检测不到棒曲霉素的存在。同时，棒曲霉素在空白对照中的含量保持相对稳定。

通过上述实验，我们可以得到以下结论：本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液能够有效的降解NYDB中的棒曲霉素。

实施例2、Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液降解苹果汁（pH为2.9～3.3）中的棒曲霉素，依次进行如下步骤：

1）、菌悬液的制备：

同实施例1。

2）、苹果汁中棒曲霉素的降解：

往无菌的50mL离心管中加入市购的苹果汁（pH为2.9～3.3）4.9ml，已事先测得该苹果汁内含有120μg/L的棒曲霉素；再加入Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液0.1ml；使菌体的最终浓度达到1×10⁵CFU/mL，用灭菌的8层纱布包裹管口，放置于25℃摇床中培养，转速为180rpm。

其余内容等同于实施例1的步骤2）。

实验结果如图2所示。经过三天的降解，苹果汁中棒曲霉素的含量随着时间不断下降。经过一天的培养，有31.08%的棒曲霉素被降解；到了第二天，一半以上的棒曲霉素被降解（降解率达到65.49%）；第三天已经检测不到棒曲霉素的存在。同时，棒曲霉素在空白对照中的含量保持相对稳定。

通过上述实验，我们可以得到以下结论：本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液能够有效的降解苹果汁中的棒曲霉素。

说明：本发明的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液能够有效应用于被棒曲霉素污染的苹果汁中，从而可进行实际推广应用。

对比例1、调整实施例1中的降解温度，降解温度由25℃下降为15℃，检测时间点为24h，其余等同于实施例1。

对比例2、调整实施例1中的降解温度，降解温度由25℃上升为35℃，检测时间点为24h，其余等同于实施例1。

对比例3、仅将实施例1步骤2）中所用的NYDB培养基的pH值由6.0上升为8.0，检测时间点为24h，其余等同于实施例1。

备注说明：步骤1）中的NYDB培养基不作更改，其pH值仍为6.0。

对比例4、调整实施例1中的棒曲霉素初始浓度，由10ppm上升为30ppm，检测时间点为24h，其余等同于实施例1。

对比例5、调整实施例1中的棒曲霉素初始浓度，由10ppm下降为1ppm，检测时间点为24h，其余等同于实施例1。

对比例6、将实施例1中的用于降解的菌体由Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman改成背景技术中告知的红酵母，菌体的最终浓度不变，即仍为1×10⁵CFU/mL；其余等同于实施例1。

对比例7、将实施例1中的用于降解的菌体由Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman改成背景技术中告知的毕赤酵母，菌体的最终浓度不变，即仍为1×10⁵CFU/mL；其余等同于实施例1。

对比例8、

仅仅将实施例1的步骤1）菌悬液的制备过程中所用的NYDB改成常规的NYDB培养基，即，

常规NYDB：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+1L蒸馏水，然后进行常规的高压灭菌。

所得的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液称为菌悬液Ⅰ，每ml该菌悬液Ⅰ中含有5×10⁶CFU的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体。

以该菌悬液Ⅰ进行步骤2）所述的NYDB中棒曲霉素的降解，同样使菌体的最终浓度达到1×10⁵CFU/mL。备注说明：步骤2）中所用的NYDB同实施例1的步骤2）。

其余内容同实施例1。

将上述所有对比例按照实施例1中所述的方法进行棒曲霉素降解率的检测试验，所得结果如下表1所示。

表1、不同处理的棒曲霉素降解率

实施例1	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
					棒曲霉素降解率	29.79%	10.18%	7.08%	9.55%	29.52%
对比例5	对比例6	对比例7	对比例8
					棒曲霉素降解率	28.41%	20.3%	18.55	21.2%

由上述对比例可看出，无论被污染物中棒曲霉素的初始浓度如何，相同终浓度的红冬孢酵母对其降解的效率并无显著差异。

安全性实验：

为检测实施例1所得的最终降解产物的安全性，进行了如下实验：

1）、棒曲霉素降解产物的获取

将一定量的棒曲霉素加入装有6mL NYDB的50mL离心管里，使棒曲霉素的最终浓度分别达到200ppm、100ppm、20ppm、2ppm、1ppm、0ppm，每个处理有两个平行。加入Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman，使其最终浓度达到10⁵CFU/mL，于25℃180rpm的摇床中培养3天。将培养液离心，收获上清，将同一个处理组的平行样品混合在一起，即得到由红冬孢酵母降解棒曲霉素的产物（其棒曲霉素的初始量分别为200ppm、100ppm、20ppm、2ppm、1ppm、0）。从不同处理组分别吸取400μL上清液，用HPLC检测，确保棒曲霉素已完全降解。

同时，配制棒曲霉素溶液溶于NYDB中，使其浓度分别达到200ppm、100ppm、20ppm、2ppm、1ppm、0ppm。

2）、棒曲霉素降解产物的毒性检测

将活化了两代的大肠杆菌（E.coli）离心，获取菌体将其分散于新鲜的LB培养基中（调节其浓度，将其用NYDB稀释一倍后，使其在OD₆₀₀处的吸光值为0.3左右），取120μL的酵母降解棒曲霉素的上清液和120μL的E.coli菌悬液于无菌的96孔板中（即实际上棒曲霉素的含量为100ppm、50ppm、10ppm、1ppm、0.5ppm、0），放于37℃的恒温培养箱中。每个处理设置6个平行（即6个孔），以NYDB培养基加120μL的E.coli菌悬液为对照。同时，取120μL不同浓度的棒曲霉素溶液和120μL的E.coli菌悬液，检测棒曲霉素本身对大肠杆菌的毒性。再用酶标仪检测其在600nm处的吸收波长。检测时间点为0、1h、2h、4h、6h、8h、10h。

实验结果如图3和图4所述。由实验结果可知：

棒曲霉素抑制了大肠杆菌的生长，且棒曲霉素浓度越高，其对大肠杆菌的抑制作用越强；而棒曲霉素的降解产物对大肠杆菌的生长无抑制作用。由图得知，降解产物可以被大肠杆菌当作营养物质利用，所以大肠杆菌在高浓度的降解产物下，反而生长更好。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，其特征是：将Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman的菌悬液放入被棒曲霉素污染的液态物中，直至Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman的终浓度为0.9～1.1×10⁵CFU/mL，在150～250rpm的摇床中于24～26℃降解处理2～4天；从而实现棒曲霉素的降解。

2.根据权利要求1所述的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，其特征是：

所述被棒曲霉素污染的液态物的pH＜7。

3.根据权利要求2所述的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，其特征是：

所述Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌悬液的制备方法为：

从NYDA培养基斜面中挑取Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种于NYDB培养液中，于24～26℃、150～250rpm的条件下进行活化；然后调节至每ml的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌悬液中含有4～6×10⁶CFU的Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman菌体；

4.根据权利要求3所述的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法，其特征是：

所述活化包括在NYDB培养液中第一代培养24h，第二代培养36h。