CN103642727A - 一株抑制真菌的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB，保藏号为CGMCC No.8179。所述解淀粉芽孢杆菌KB对桃采后褐腐病菌、苹果采后灰霉病菌、西红柿采后灰霉病菌和苹果采后青霉病菌具有抑制作用；对桃采后褐腐病、苹果采后灰霉病、西红柿采后灰霉病、苹果采后青霉病具有抑制作用。对桃褐腐病菌和苹果灰霉病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为22mm和20mm，对桃褐腐病斑及苹果灰霉病病斑的抑制率达到100%。

Description

一株抑制真菌的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

一种抑制真菌的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物应用技术领域。 

背景技术

植物真菌病害给农业生产带来巨大损失，而果实采后真菌病害是一类重要的病害，造成了果实的大量减产，严重影响果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低。在发达国家，果实采摘后病害引起的损失量占果实总量的15%以上，在发展中国家由于缺少必要的防控技术和设备，果实采摘后病害引起的损失量占总量的30%以上。果实采摘后病害的发生已给现代农业生产尤其是高端果蔬产品的生产与加工造成了严重影响。 

由Monilinia spp.病原真菌引起的桃褐腐病目前在世界范围内都是桃子的第一大病害，也是影响桃产业发展的第一大问题。据统计，在发达国家如美国、以色列、意大利、法国等，采后褐腐病导致的损失量就占桃总产量的10%-30%；在发展中国家由于缺少必要的防治技术和相关设备，其损失量达30%-50%，甚至更高。有些地区，桃褐腐病的大面积严重发生，几乎导致桃果绝收。因此，对桃褐腐病的防治和控制显得更加迫切和重要。我国桃园面积超过900万亩，是世界上桃有效种植面积第一大国；年产桃超过40万吨，是世界上桃产量第一大国。北京桃产量位居国内前8名，仅北京平谷一地，桃种植面积就达22万亩（1.47万公顷）之多。桃产业已成为平谷县的经济支柱产业，一些桃子及相关加工产品已经出口到欧盟、日本等国家。2000年以来北京桃褐腐病大面积增加，且逐年加重；其中2005年发病较重的桃园，桃果受害，大量脱落，采摘时未见显症的果实，在采摘后2-3天，50%以上的果实因褐腐病侵染而腐烂，这给果农造成严重的经济损失。2012年北京市植保站桃褐腐病调查结果显示，北京各郊区县桃产区均有桃褐腐病发生，而且桃子在采后的运输和贮藏期间发病率都在30%以上。这大大降低了果实的食用价值和市场价值，严重影响了北京桃产业的发展。因此对桃采后褐腐病的有效防控与经济发展尤其是与果农的经济收入有着紧密联系。 

目前生产中对桃褐腐病的防治仍然以化防为主，但由此带来的“3R”负面影响非常严重。化学农药的大量使用严重破坏了生态环境，导致桃果实中大量的农药 残留，影响人们身体健康。在北方桃产区，在桃子的采摘之前及采摘之后，对桃褐腐病的防治手段同样也是以化学农药为主，这不仅影响人民的身体健康，也限制了桃产品的加工与出口。我国已将发展生物农药和绿色食品列入了《中国21世纪议程》，北京现代农业科技城的建设要求北京市及周边地区作物病害实现绿色防控、农业产品实行绿色生产。 

芽孢杆菌（Bacillus spp.）在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生态***中的优势微生物种群之一，由于产生内生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中因干燥、热和紫外辐射所造成的伤害，维持自身生存能力不受影响。这个生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量巨大，能够产生多种多样的生理活性物质和代谢产物，具有广泛的工业应用前景。 

解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布十分广阔，目前尚未有防治桃褐腐病的解淀粉芽孢杆菌的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株KB，保藏号为CGMCC No.8179。 

本发明的目的也在于提供一种病原菌抑制剂，其活性成分为上述解淀粉芽孢杆菌和/或其代谢物。 

本发明的目的也在于提供一种病害抑制剂，其活性成分为上述解淀粉芽孢杆菌和/或其代谢物。 

本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌株号为KB，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.8179。 

所述述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的16S rDNA序列SEQ ID No.1所示。 

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的形态学特征为：菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长， 菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的生理生化特征为革兰氏染色阳性，形成菌膜，甲基红、硝酸盐还原、乙酰甲基甲醇、吲哚反应、接触酶阳性，可水解明胶、尿素、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用***糖和山梨糖。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB于含有1%-7%（质量含量）氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10%（质量含量）氯化钠的培养基中不可生长，于pH4.5-9.0的培养基中均可正常生长，在pH4.0下生长势弱，pH9.5下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB产嗜铁素、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶,这些都是生防菌的关键性生防指标。 

本发明的目的还在于提供上述解淀粉芽孢杆菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。 

所述病原菌为下述至少一种： 

A、桃采后褐腐病菌； 

B、苹果采后灰霉病菌； 

C、西红柿采后灰霉病菌； 

D、苹果采后青霉病菌； 

所述病害为下述至少一种： 

A、桃采后褐腐病； 

B、苹果采后灰霉病； 

C、西红柿采后灰霉病； 

D、苹果采后青霉病。 

其中，所述桃采后褐腐病菌可为Monilinia fructicola或Monilinia laxa或Monilinia fructigena；所述苹果采后灰霉病菌为Botrytis cinerea；所述西红柿采后灰霉病菌为Botrytis cinerea；所述苹果采后青霉病菌为Penicillium expansum。 

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的代谢物可从所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的发酵液中获得。 

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的代谢物具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB，除去液体培养物（发酵液）中的所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB即得到所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。 

本发明中的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对桃采后褐腐病菌、苹果采后灰霉病菌、西红柿采后灰霉病菌和苹果采后青霉病菌具有抑制作用；对桃采后褐腐病、苹果采后灰霉病、西红柿采后灰霉病、苹果采后青霉病具有抑制作用。对所选择的植物病原真菌中，对桃褐腐病菌和苹果灰霉病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为22mm和20mm，对桃褐腐病斑及苹果灰霉病病斑的抑制率达到100%。说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。 

生物材料保藏说明 

分类命名：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） 

菌株编号：KB 

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

保藏机构简称：CGMCC 

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 

保藏日期：2013年9月12日 

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8179. 

附图说明

图1.a)所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB在PDA培养基上对桃褐腐病菌Monilinia fructicola的抑制效果;b)所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对苹果灰霉病Botrytis cinerea的抑制效果；c)所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对番茄灰霉病Botrytis cinerea的抑制效果； 

图2.a)所述解淀粉酶芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对桃褐腐病病斑大小的抑制效果;b)所述解淀粉酶芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） KB对苹果灰霉病病斑大小抑制效果;c)所述解淀粉酶芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对苹果青霉病病斑大小抑制效果;d)所述解淀粉酶芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对番茄灰霉病病斑大小抑制效果。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

下述实施例中用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验： 

番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)（李兴红等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测.植物保护.2012.38(4)：141-143） 

桃褐腐病菌——链核盘菌（Monilinia fructicola(wint.)Rehm）（王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58）。 

苹果采后灰霉病菌--灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)； 

苹果采后青霉病菌--展青霉酶菌（Penicillium expansum Link,1809） 

实施例1 

本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的分离与菌株鉴定 

1、样品采集 

从有中国北方有机果园中，采集桃子和猕猴桃。 

2、菌株的分离筛选及拮抗筛选 

从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用LB，NA，KB和CM0002共4种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在LB培养基上纯化保存，并以桃褐腐病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名其为KB。 

3、菌株的鉴定 

对菌株KB进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《土壤微生物研究原理与方法》（林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M]，高等教育出版 社，2010）中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。 

结果表明，菌株KB的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。菌株KB的生理生化特征为革兰氏染色阳性，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、接触酶、尿酶阳性，可水解明胶、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用***糖和山梨糖。解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）KB的环境耐受性表现为于含有1%-7%（质量含量）氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10%（质量含量）氯化钠的培养基中不可生长，于pH4.5-9.0的培养基中均可正常生长，在pH4.0下生长势弱，pH9.5下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长。菌株KB的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。 

实施例2 

本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB抑菌谱的测定 

供试病原菌： 

桃褐腐病菌——链核盘菌（Monilinia fructicola(wint.)Rehm）； 

番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)； 

苹果采后灰霉病菌--灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)； 

苹果采后青霉病菌--展青霉酶菌（Penicillium expansum Link,1809） 

选择桃采后褐腐病病菌、苹果采后灰霉病菌、苹果采后青霉病菌等为指示真菌，采用平板对峙培养法。 

具体操作如下：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB菌株在LB培养基上28℃恒温培养48h。植物病原真菌在PDA平板上25℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.7cm无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00 cm处用无菌接种环划线解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃恒温培养5-7天，测量病原真菌边缘与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。 

将果实体内人为打孔接种法具体操作（以防治苹果采后灰霉病为例进行说明）如下： 

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB菌株在LB液体培养基上28℃恒温培养48h，用蒸馏水调至菌液浓度为5×10⁷cfu/ml。苹果灰霉病菌B.cinerea在PDA平板上25℃恒温培养5-7天，收集灰霉菌孢子，用蒸馏水制成5×10⁴cfu/ml的孢子悬浮液；成熟的苹果，先用0.5%次氯酸钠消毒之后，用灭过菌的移液器枪头，沿着苹果腰部插孔，每个果子扎孔3个，每个孔为30mm×30mm。每孔接种30ul KB菌液，室温晾干，然后再接种30ul的病原菌孢子悬浮液。最后，处理的果子放置于25℃下，5-7天后，测定果实腐烂斑大小。腐烂斑小于10mm被视为不发病。根据腐烂病斑的占总接种孔数的多少，计算发病率，未发病的病斑数占总接种孔数的多少，计算病斑抑制率。 

实验结果见表1，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对所选择的植物病原真菌中，对桃褐腐病菌和苹果灰霉病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为22mm和20mm，对桃褐腐病斑及苹果灰霉病病斑的抑制率达到100%。说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。 

表1B.amyloliquefaciens KB对病原菌的抑制效果(PDA,28℃,72h) 

其中，所述桃采后褐腐病菌可为Monilinia fructicola或Monilinia laxa或Monilinia fructigena；所述苹果采后灰霉病菌为Botrytis cinerea；所述西红柿采后灰霉病菌为Botrytis cinerea； 

所述苹果采后青霉病菌为Penicillium expansum. 

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对供试的5种植物病原真菌引起的腐烂病斑皆有较好的抑制效果如表1和图2所示。 

实施例3 

贮藏条件下，所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KB对苹果、西红柿采后病害防治效果实验： 

1.苹果采摘后，经KB菌液（菌液浓度分别为106cfu/ml，107cfu/ml，108cfu/ml，109cfu/ml）浸泡处理30-60秒，室温条件下，风干，然后于温度为1-2℃，相对湿度为90-95%条件下，黑暗贮藏。贮藏10个月后，与对照组相比，当菌液浓度为106cfu/ml其防效为45%，当菌液浓度达到107cfu/ml时其防效达65%，当菌液浓度达到108cfu/ml和109cfu/ml时候，其防效分别为70%和75%。 

2.西红柿采摘后，经KB菌液（菌液浓度分别为106cfu/ml，107cfu/ml，108cfu/ml，109cfu/ml）浸泡处理30-60秒，室温条件下，风干，然后于温度为20℃，相对湿度为90-95%条件下，黑暗贮藏。贮藏5天后，与对照组相比，当菌液浓度为106cfu/ml其防效为40%，当菌液浓度达到107cfu/ml时其防效达55%，当菌液浓度达到108cfu/ml和109cfu/ml时候，其防效分别为60%和65%。 

Claims (7)

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株KB，保藏号为CGMCC No.8179。

2.一种病原菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。

3.根据权利要求2所述的病原菌抑制剂，其特征在于，所述病原菌抑制剂对下述至少一种病原菌具有抑制作用：

A、桃采后褐腐病菌；

B、苹果采后灰霉病菌；

C、西红柿采后灰霉病菌；

D、苹果采后青霉病菌。

4.一种病害抑制剂，其活性成分为权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。

5.根据权利要求4所述的病害抑制剂，其特征在于，所述病害为下述至少一种：

A、桃采后褐腐病；

B、苹果采后灰霉病；

C、西红柿采后灰霉病；

D、苹果采后青霉病。

6.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物的下述任一应用：

1）在抑制病原菌中的应用；

2）在制备病原菌抑制剂中的应用；

3）在抑制病害中的应用；

4）在制备病害抑制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病原菌为下述至少一种：

A、桃采后褐腐病菌；

B、苹果采后灰霉病菌；

C、西红柿采后灰霉病菌；

D、苹果采后青霉病菌；

所述病害为下述至少一种：

A、桃采后褐腐病；

B、苹果采后灰霉病；

C、西红柿采后灰霉病；

D、苹果采后青霉病。

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