CN103930415A - 泛素特异性蛋白酶7的选择性和可逆性抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I’)的喹唑啉-4-酮化合物，其制备过程和其用途。此类化合物作为泛素特异性蛋白酶，特别是USP7的选择性和可逆性抑制剂是有效的而用于治疗如癌症、神经退行性疾病、炎性病症和病毒感染。

Description

泛素特异性蛋白酶7的选择性和可逆性抑制剂
本发明涉及泛素特异性蛋白酶的新的选择性和可逆的抑制剂的发现，其制备过程和其治疗用途。 
泛素特异性蛋白酶(USP)是属于去泛素化酶(DUB)家族的半胱氨酸蛋白酶。 
泛素-蛋白酶体***的失调已经牵涉于多种人类疾病的发病机理，包括癌症(Hoeller等人Nat Rev Cancer2006，6(10)，776-788)，神经退行性疾病(Rubinsztein，Nature2006，443(7113)，780-786)和病毒感染(Gao&Luo Can J Physiol Pharmacol2006，84(1)，5-14)。在多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗上蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)的市场成功，已经建立起该***作为癌症治疗的有效靶标(Adams，Nat Rev Cancer2004，4(5)，349-360)。有前途的替代物靶向蛋白酶体本身将会干扰上游泛素共轭/去共轭机制，以产生更特异性的，低毒性抗癌剂。 
单和多泛素化可以通过特异性切割泛素的羧基端的异肽键的去泛素化酶被逆转。泛素特异性蛋白酶和泛素羧基端水解酶(UCH)酶是DUB家族的最佳表征成员(Komander等人Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2009，10(8)，550-63；Nijman等人Cell2005，123(5)，773-786)。UCH被认为是优先切割小蛋白质底物及主要是参与泛素的加工和回收利用，但其具体功能仍然知之甚少。USP构成DUB的最大亚家族，有超过60个成员。其从特定的蛋白质底物中去除泛素，因此防止了其靶向蛋白酶体或调节其亚细胞定位和激活(Daviet&Colland，Biochimie2008，90(2)，270-83)。基于其蛋白酶活性及参与多种人类疾病，USP正在成为泛素调节机制的药理干预的潜在靶标(Colland，BiochemSoc Trans2010，38，137-43)。 
USP7(泛素特异性蛋白酶7)/HAUSP(疱疹相关泛素特异性蛋白酶)是USP家族的135kDa蛋白。USP7已被证明与病毒蛋白质相互作用，所 述病毒蛋白质如ICP0(VMW110)、刺激病毒裂解周期的起始的单纯疱疹病毒立即早期基因(Everett等人，J Virol73，1999，417-426)、和EBNAl(EB核抗原-1，Epstein-Barr Nuclear Antigen-1)(Holowaty等人，J Biol Chem2003，278，29987-29994和47753-47761)。人类蛋白质，如p53和p53的主要E3连接酶，MDM2，也被鉴定为USP7的伴侣和底物(Cummins等人Nature2004，486，Cummins&Vogelstein，Cell Cycle，2004，3，689-692；Li等人Mol Cell2004，13，879-886；Li等人Nature2002，416，648-653)。更广泛地，USP7可以使不同的靶标去泛素化，所述靶标包括Mdm2和p53，且此类后期靶标的网络去泛素化(net deubiquitination)最终决定了功能性p53的水平。与最近的报道一致的是USP7沉默也已显示出通过促进Mdm2降解以增加稳态p53的水平。最近显示出TSPYL5调节USP7和p53的结合，所述TSPYL5是通过与p53竞争结合至USP7上的相同区域而潜在参与乳腺癌形成的蛋白质(Epping等人，Nat Cell Biol.2011，13(I)：102-8)。最近，通过产生组成性的高p53水平，USP7的上调和下调均被证明抑制体外结肠癌细胞的增殖和体内肿瘤的生长(Becker等人Cell Cycle2008，7(9)，1205-13)。 
USP7还通过Bmil/Mel18的稳定以改变p16INK4a肿瘤抑制因子的水平(Maertens等人，Embo J.201029,2553-2565)。USP7还稳定其它参与基因组完整性/调节的蛋白质，如DNMT1DNA甲基化酶和Claspin衔接子(Du等人，Science Signaling2010，3(146)：ra80；Faustrup等人，J. Cell Biol.2009,184(1)：13-9)。重要地是，USP7和DNMT1的丰度在人结肠癌中相互关联，所述DNMT1为参与维持涉及发育和癌症的基因沉默所需的表观基因甲基化的蛋白质(Du等人，Science Signaling，2010，3(146)：ra80)。USP7还被证明在人细胞中使著名的肿瘤抑制因子基因PTEN去泛素化，从而引起PTEN的核输出及其之后的失活(Song等人，Nature2008,455(7214)，813-7)。更重要的是，已首次报道了在***癌中的USP7的过表达，且该过表达与肿瘤的侵袭性直接相关(Song等人，Nature2008，455(7214)，813-7)。 
USP7还被证明在人细胞中使FOXO4去泛素化，从而引起FOXO4的 核输出及其之后的失活；因此激活了致癌的PI3K/PKB信号转导通路(vander Horst等人，NatCellBiol.2006，8，1064-1073)。最后，USP7在p53介导的细胞应答中对多种类型的应激，如DNA损伤和氧化应激，起到重要作用(Marchenko等人,Embo J.200726，923-934，Meulmeester等人MolCell2005，18，565-576.，van der Horst等人，Nat CellBiol.2006，8，1064-1073)。 
已报道了包含多肽部分P1-Gly-p3-Ser的USP7蛋白质结合的合成抑制剂，其中P1是谷氨酸残基或带有非极性侧链的氨基酸，且P3是甘氨酸残基或带有非极性侧链的氨基酸(WO2006072048)。 
与USP7沉默相关的表型以及USP7和必须病毒蛋白质和致癌通路(诸如p53/Mdm2和PI3K/PKB通路)之间的已知关系强烈暗示了以小分子抑制剂靶向USP7可能有助于癌症和病毒性疾病的治疗(Sippl等人，Future Oncology2011，7，619-32)。针对USP7的抑制剂最近被报道(Colland等人Molecular Cancer Therapeutics2009，8，2286-95和EP1749822和PCT/EP2011/050523.2)。 
然而，迄今，似乎还未有特异性和可逆性的USP7小分子抑制剂的报道。 
根据第一个目的，本发明涉及一种式(I)化合物： 
其中 
·每一个R1是相同的或不同的，每一个R1选自由卤素、R、OR、NRR、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、NO2、(C1-C6)亚烷基-OR、(C1-C6)亚烷基-NRR’、(C1-C6)亚烷基-CO2R、(C1-C6)亚烷基-CONRR’、-O-(C1-C6)亚烷基-CO2R、-O-(C1-C6)亚烷基-CONRR’、CO2-(C1-C6)亚烷基-OR、CO2-(C1-C6)亚烷基-NRR’、C(O)NH-(C1-C6)亚烷基-OR、C(O)NH-(C1-C6)亚烷基-NRR’、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR’、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C＝C(R11)2、 (C1-C6)亚烷基-COR、NHCOR或被至少一个杂原子间断的(C1-C6)烷基组成的组，杂原子优选地选自O、N或S，优选O； 
·L1是任选地被＝O、CN、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’中的一种或多种取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基、或直链或支链CH2(C1-C6)亚烷基，其中后一种(C1-C6)亚烷基任选地被卤素、OR、NRR’或CF3中的一种或多种取代； 
·X是CR2R7、NR2、芳基、杂芳基、环烷基、杂环，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环任选地被直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’中的一种或多种取代； 
·R2是直链或支链(C1-C6)亚烷基，且与R5＝直链或支链(C1-C6)亚烷基联接在一起以与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-形成杂环，优选具有5到7元的杂环，所述杂环任选地被OR、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’或＝O中的一种或多种取代； 
·R5选自H及直链或支链(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基； 
·R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’或＝O组成的组； 
·q是0、1、2、3或4 
·n是0、1、2或3； 
·R7是OR、H、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR； 
·i是0或1； 
·A是选自由下列组成的组： 
-直链或支链-[C1-C6(烷基)]0-1-C(O)-； 
-直链或支链-[C1-C6(烷基)]0-1-C(O)NH-； 
-直链或支链-[C1-C6(烷基)]0-1SO2-；或 
-直链或支链-[C1-C6(烷基)]0-1SO2N-； 
·L2是直链或支链(C1-C6)亚烷基-O或任选地被选自O、NR或S的至少一个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基，和/或任选地被下述取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR； 
·R6选自由芳基、杂芳基、环烷基、杂环、H组成的组，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环是单环的或多环的，且任选地被直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、OR、＝O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直链或支链(C2-C6)亚烯基或C(O)NRR’中的一种或多种取代； 
·R9选自由-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR’、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2或它们的离子化形式组成的组； 
·R10独立地是相同的或不同的且选自键、直链或支链(C1-C6)烷基； 
·R11独立地是相同的或不同的且选自氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基，所述烷基或芳基任选地被OH、NH2、C(O)OH或C(O)NH2取代； 
·R和R’各自是相同的或不同的，R和R’各自独立地选自H、直链或支链(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳族或非芳族杂环、直链或支链-(C1-C6)烷基-芳基或直链或支链-(C1-C6)烷基-杂环，其中所述杂环是芳族或非芳族；任选地被或不被OH、CO2H、C(O)NH2、NH2取代 
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。 
本发明的式(I)是指以下任何的实施方案或其任何组合。 
优选地，在式(I)化合物中，每-个R1是相同的或不同的，R1选自 由直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、NO2；(C1-C6)亚烷基-OR、(C1-C6)亚烷基-NRR’、(C1-C6)亚烷基-CO2R、(C1-C6)亚烷基-C(O)NRR’、-O-(C1-C6)亚烷基-CO2R、-O-(C1-C6)亚烷基-C(O)NRR’、CO2-(C1-C6)亚烷基-OR、CO2-(C1-C6)亚烷基-NRR’、C(O)NH-(C1-C6)亚烷基-OR、C(O)NH-(C1-C6)亚烷基-NRR’或NHC(O)R组成的组。 
优选地，在式(I)化合物中，L1是任选地被＝O、CN、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’中的一种或多种取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基；或直链或支链CH2(C1-C6)亚烷基，其中后一种(C1-C6)亚烷基任选地被卤素、OR、NRR’或CF3中的一种或多种取代。 
优选地，在式(I)化合物中，R2是直链或支链(C1-C6)亚烷基，且与R5＝直链或支链(C1-C6)亚烷基联接在一起以与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-形成5或6元的杂环，该杂环任选地被OR、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、或＝O中的一种或多种取代。 
优选在式(I)化合物中，R7是OR、OR9、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’或CN。更优选R7是OR、OR9。更优选R7是OH、OR9，优选OH。 
R6选自由芳基、杂芳基、环烷基、杂环、H组成的组，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环是单环的或多环的，且任选地被直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R或C(O)NRR’中的一种或多种取代。 
优选在式(I)化合物中，A选自由以下组成的组： 
--C(O)-； 
--C(O)NH-； 
-SO2-；或 
-SO2N-。 
优选在式(I)化合物中，L2是任选地被选自O、NR或S的至少一个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基，和/或任选地被：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基。 
优选地，应理解，L2不代表O-(C1-C6)亚烷基。 
优选在式(I)化合物中： 
-NR5直接结合到C(O)、C(O)N、SO2或SO2N基团中的至少一种；和/或 
-i＝0，n是1、2或3且联接至NR5的CR3R4是C(O)；或i＝1，A是-C(O)-、C(O)NH、SO2或SO2N；和/或 
-i＝0，n是1、2或3且联接至NR5的CR3R4是C(O)；或i＝1，A是-C(O)-、C(O)NH、SO2或SO2N，X是CR2R7或NR2，且R2和R5是相同的或不同的，R2和R5是直链或支链(C1-C6)亚烷基且与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-一起形成5至7元的杂环，该杂环任选地被OR、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’中的一种或多种取代，并且R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’组成的组；和/或 
-i＝1，且A是-C(O)-，X是CR2R7或NR2，且R2和R5是相同的或不同的，R2和R5是直链或支链(C1-C6)亚烷基且与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-一起形成5至7元的杂环，该杂环任选地被OR、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’中的一种或多种取代，并且R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’组成的组；和/或 
-每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’或NHC(O)R组成的组；和/或 
-每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OH或直链或支链-O-(C1-C6)烷基组成的组；和/或 
-每一个R1是相同的或不同的，R1选自由卤素或直链或支链-O-(C1-C6)烷基组成的组；和/或 
-q是0、1或2；和/或 
-X是CR2R7或NR2，且R2和R5是相同的或不同的，R2和R5是直链或支链(C1-C6)亚烷基且与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-一起形成5至7元的杂环，该杂环任选地被一种或多种OR、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’所取代。优选地，由-XR2-(CR3R4)n-NR5-形成的杂环是非芳族杂环；和/或 
-R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、＝O、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组；和/或 
-R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4各自选自由H、-O-(C1-C6)烷基、OH和＝O组成的组。优选R3、R4各自是相同的或不同的，R3、R4选自由H和OH组成的组；和/或 
-X是CR2R7、或芳基且R7是OR、OR9、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、卤素、C(O)OH、NRR’、C(O)NH2或SR。优选X是CR2R7、或芳基且R7是OR、OR9、NRR’或SR。更优选，R7是OH或OR9，优选OH。如上定义R9；和/或 
-X是芳基，优选苯基；和/或 
-L1是任选地被一种或多种＝O取代的直链或支链C1-C6(亚烷基)，或是直链或支链CH2-C1-C6-(亚烷基)，其中后一种亚烷基任选地被一种或多种-OH取代；和/或 
-L2是直链或支链C1-C6(亚烷基)-O或任选地被选自O或S的至少一个杂原子间断的直链或支链C1-C6(亚烷基)，和/或任选地被下述中的一种或多种取代的直链或支链C1-C6(亚烷基)：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR。 更优选L2是直链或支链C1-C6(亚烷基)或直链或支链-[C1-C6(亚烷基)]-O-；和/或 
-R6选自由芳基、杂芳基、环烷基或H组成的组，其中所述芳基、杂芳基或环烷基任选地被卤素、直链或支链O-(C1-C6)烷基取代；和/或 
-R6选自由苯基、苯硫基、环戊基和H组成的组，其中所述苯基任选地被卤素、直链或支链O-(C1-C6)烷基取代。 
在一种实施方案中，在式(I)的化合物中，X是CR2R7或NR2，且R2和R5与它们所连接的-X-(CR3R4)n-N-一起形成5至7元的杂环，该杂环任选地被一种或多种OH取代。优选地，在本具体的实施方案中，n是0、1或2，和/或X是CR2R7，其中R7是OR、OR9、直链或支链(C1-C6)甲基-OR、卤素、C(O)OH、C(O)NH2、NRR’或SR，和/或L1是(CH2)k、其中k是1或2，优选k是1、-C(O)-、-CH2-CH(OH)-或-CH2-C(O)-。优选R7是OR、OR9、NRR’或SR。更优选，R7是OH或OR9，优选OH。如上定义R9。 
在另一种实施方案中，在式(I)的化合物中，X是芳基、杂芳基、环烷基或杂环，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环任选地被直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’中的一种或多种取代，优选X是芳基且R5是H或直链或支链C1-C6(烷基)，优选H。优选地，在本具体实施方案中，n是0，和/或X是芳基，和/或L1是-CH2-CH(OH)-。 
根据具体的实施方案，本发明的化合物可能为下列式(Ia) 
其中 
·R1、q、L1、L2、R6和R7如式(I)中定义； 
·X’是CR7或N； 
·n是0、1或2； 
·p是1、2或3； 
·R3、R4和R8各自是相同的或不同的，R3、R4和R8各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组。 
优选在式(Ia)化合物中，R3、R4和R8各自是相同的或不同的，R3、R4和R8各自选自由H或OH组成的组；和/或p是1或2。 
优选在式(Ia)化合物中 
是t是0、1或2，优选
其中，R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR，更优选OR、OR9、NRR’或SR，优选OH或OR9，p是1或2且R8是选自由H或OH组成的组。 
根据具体的实施方案，本发明的化合物可能为下列式(Ia) 
其中 
·如式(I)中定义R1、q、L1、L2、R6和R7； 
·X’是CR7或N； 
·n是0、1或2； 
·p是1、2或3； 
·R3、R4、R8和R8'各自是相同的或不同的，R3、R4、R8和R8’各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6) 烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组。 
优选在式(Ia)化合物中，R3、R4、R8和R8'各自是相同的或不同的，R3、R4、R8和R8'各自选自由H或OH组成的组；和/或p是1或2。 
优选在式(Ia)化合物中 
是t是0、1或2，优选
其中，R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR，更优选OR、OR9、NRR’或SR，优选OH或OR9，p是1或2且R8是选自由H或OH组成的组。 
根据具体的实施方案，本发明的化合物可能为下列式(Ib) 
其中 
·R1、q、L2、和R6如式(I)中定义； 
·X是芳基、杂芳基、环烷基或杂环，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环任选地被直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OH、直链或支链-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’中的一种或多种取代； 
·R5是H或直链或支链(C1-C6)烷基； 
·L1是直链或支链(C1-C6)烷基被一种或多种OH所取代。 
优选在式(Ib)化合物中，X是苯基。 
优选在式(Ib)化合物中，R5是H。 
根据具体的实施方案，本发明的化合物可能为下列式(I’) 
其中 
·R1、q、L1、A、L2、R、R’和R6如式(I)中定义； 
·X’是CR7； 
·R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR，更优选OR、OR9、NRR’或SR； 
·n是0、1或2； 
·p是1、2或3； 
·R3、R4、R8和R8'各自是相同的或不同的，R3、R4、R8和R8’各自选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组。 
优选在式(I)化合物中，A选自由以下组成的组： 
--C(O)-； 
--C(O)NH-； 
-SO2-；或 
-SO2N-。 
优选在式(I’)化合物中R3、R4、R8和R8’各自是相同的或不同的，R3、R4、R8和R8’各自选自由H或OH组成的组，和/或p是1或2。 
优选在式(I’)化合物中R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN，更优选OH。 
优选在式(I’)化合物中R7是OR、OR9、NRR’或SR，更优选R7是OR、OR9，优选OH或OR9，例如OH。 
优选在式(I’)化合物中p+n＝4；更优选p是2且n是2。 
优选在式(I’)化合物中是
优选在式(I’)化合物中L1是CH2。 
优选在式(I’)化合物中p是2且n是2，R7是OR、OR9、NRR’或SR，更优选R7是OR、OR9，优选OH或OR9，例如OH。 
优选在式(I’)中p是2且n是2，及L1是CH2。 
优选在式(I’)的化合物中L1是CH2，且R7是OR、OR9、NRR’或SR，更优选R7是OR、OR9，优选OH或OR9，例如OH。 
优选在式(I’)的化合物中p是2且n是2，L1是CH2，R7是OR、OR9、NRR’或SR，更优选R7是OR、OR9，优选OH或OR9，例如OH。 
根据具体的实施方案，在式(I’)的化合物中A是C＝O，因此，所述化合物是以下式(Ia′) 
其中，R1、q、L1、n、p、X’、R3、R4、R8、R8'、L2、R6和R7如式(I’)定义。 
优选在式(Ia’)的化合物中是
根据具体实施方式，本发明涉及如上定义的式(I)的化合物，除了下列化合物： 
-q是0，L1是CH2，X-(CR3R4)n-NR5形成哌啶，X是CR2R7且R7是 OH，i是1，A是C＝O，L2是C2H4且R6是
-q是1，R1是7位的Cl，L1是CH2，X-(CR3R4)n-NR5形成哌啶，X是CR2R7且R7是OH，i是1，A是C＝O，L2R6是CH(CH2CH3)2。 
根据具体实施方式，式(I)化合物选自： 
3-({4-羟基-1-[3-(2-甲氧基苯基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
7-氯-3-{[1-(2-乙基丁酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-({1-[2-(3-氟苯氧基)乙酰基]-4-羟基哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-6,7-二甲氧基-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
7-氯-3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
7-氯-3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-({4-羟基-1-[3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-7-氯-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
或其药学上可接受的盐或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
如上文或下文所用： 
“烷基”指可以是直链或支链脂肪烃基团，碳链中具有1到6个碳原 子。“支链”是指一种或多种低级烷基，如甲基、乙基或丙基连接到直链烷基链。示例性的烷基集团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基。 
如本文使用的，术语“环烷基”指非芳族单环或多环烃环，所述烃环是由除去一个氢原子形成的3至10个碳原子的烃环。命名例如“C5-C7环烷基”是指含有从5到7个碳原子的环烷基。实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基等，以及由其缩合或通过与苯基缩合形成的***。 
“Alken”或烯基是指含有碳-碳双键的脂肪烃基团，其可以是直链或支链的碳链中具有2至6个碳原子。优选烯基在碳链中具有2至6个碳原子，且更优选在碳链中约有2至4个碳原子。示例性的烯基集团包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2烯基、正戊烯基。 
“卤素原子”指的是氟、氯、溴或碘原子；优选氟和氯原子。 
“芳基”是指6至14个碳原子的芳族单环或多环烃环系，优选6至10个碳原子，取代的或没有取代的。示例性的芳基基团包括苯基或萘基。 
如本文使用的，术语“杂环”或“杂环的”指的是饱和、部分不饱和或不饱和的，非芳族稳定的3至14，优选5至10元的单、双或多环，其中环中的至少一种成员是杂原子，取代的或没有取代的。典型地，杂原子包括，但不限于，氧、氮、硫、硒和磷原子。优选的杂原子是氧、氮和硫。合适的杂环在The Handbook of Chemistry and Physics，第76版，CRC Press，Inc.，1995-1996，第2-25至2-26页内公开，该公开通过引用在此并入。芳香杂环的示例是苯硫基。 
优选的非芳香族杂环包括，但不限于吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二恶烷基、二氧戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢噻喃基、氮杂环庚烷基、以及从与苯基缩合得到的稠合系，各自是取代或未取 代的。 
如本文使用的，术语“杂芳基”或芳族杂环指的是5至14元，优选5至10元的芳族杂单环、双环或多环。实例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、***基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异恶唑基、吡啶基-N-氧化物，以及与苯基缩合产生的稠合系。 
“烷基”、“环烷基”、“芳基”、“杂环”等还涉及相应的通过除去两个氢原子形成的“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚芳基”、“亚杂芳基(heteroarylene)”、“亚杂环(heterocyclene)”等。烷基和亚烷基在本文可交换使用。 
如本文使用的，术语“患者”指的是动物，例如为育种、陪伴或保护目的的有价值的动物；或者优选地指人类或人类儿童，其患有或有可能患有本文描述的一种或多种疾病与病症。 
如本文使用的，“治疗有效量”指的是本发明的化合物有效预防、减少、消除、治疗或控制本文描述的疾病和病症的症状的量。术语“控制”意指有可能减慢、间断、阻止或停止本文描述的疾病和病症的进程的所有方法，但未必是指示所有疾病和病症的完全消除，且意在包括预防疗法。 
如本文使用的，术语“药学上可接受的”指的是那些化合物、物质、赋形剂、组合物或剂型，其在可靠的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它难处理的并发症，与合理的利益/风险比相称。 
如本文使用的，“药学上可接受的盐”指的是所公开的化合物的衍生物，其中通过制得其酸式盐或碱式盐来修饰母体化合物。所述药学上可接受的盐包括所述母体化合物形成的常规的无毒的盐或季铵盐，例如，从无毒的无机酸或有机酸。例如，此类常规的无毒的盐包括由无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的盐，包括其单、二或三盐；以及从有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、 葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等制备的盐。更多加成盐包括铵盐如缓血酸胺、葡甲胺、依伯胺等，金属盐如钠、钾、钙、锌或镁。 
本发明的药学上可接受的盐，可通过常规的化学方法，从含有碱性或酸性部分的母体化合物被合成。通常，可通过将此类化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中，或在两者的混合物中反应来制备此类盐。通常，非水介质如***、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈为优选的。Remington′s Pharmaceutical Sciences,第20版，Mack Publishing Company,Easton，PA，2000中提供了合适的盐的列表，其公开在此引用作为参考。 
具有几何异构体和立体异构体的通式(I)化合物也是本发明的一部分。 
根据进一步的目的，本发明还涉及式(I)化合物的制备方法。 
可按本领域技术人员熟知的许多方法制备本发明的化合物及方法。所述化合物可，例如通过应用或改进下文描述的方法，或者熟练的技术人员了解的其变体来合成。对本领域技术人员而言，适当的修饰和替代会是显而易见的且为熟知的或易于从学术文献得到的。 
特别地，在R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，Wiley-VCHPublishers，1999中提供了这样的方法。 
要理解，本发明的化合物可含有一种或多种不对称取代的碳原子，且可按光学活性形式或外消旋形式被分离。因此，除非明确指明特定的立体化学或异构形式，否则意指结构的所有的手性形式、立体异构形式、外消旋形式、异构形式。怎样制备和分离此类光学形式是本领域熟知的。例如，可通过标准技术分离立体异构体的混合物，所述标准技术包括但不限于：外消旋形式的拆分，正相、反相和手性色谱，优先成盐，重结晶等；或者通过从手性原料或由目标手性中心的精确合成进行手性合成。 
可通过许多合成路线制备本发明的化合物。试剂和原料为可商购的，或易于通过本领域普通技术人员熟知的技术合成。所有取代基如先前所定义，另有说明的除外。 
在下文描述的反应中，可能有必要保护期望在最终产物中的反应官能团例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基基团，以避免其不必要地参与反应。可根据标准实践使用常规的保护基，例如参见T.ff.Greene和P.G.M.Wuts的Protective Groups in Organic Chemistry,第4版(2007)，John Wiley&Sons Inc.，1999；J.F.W.McOmie的Protective Groups in Organic Chemistry，PlenumPress,1973。 
一些反应可在碱存在下进行。对于在该反应中使用的碱的性质没有特定限制，且任何常规用于此反应中的碱可同样用于本文，条件是对于该分子的其它部分没有不良影响。合适的碱的实例包括：氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺、碱金属氢化物如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物如甲基锂和丁基锂；以及碱金属醇盐如甲醇钠和乙醇钠。 
通常，在合适的溶剂中进行反应。可使用多种溶剂，条件是对所述反应或参与试剂没有不良影响。合适的溶剂的实例包括：烃类，其可为芳族的、脂肪族的或脂环族的烃类，例如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺类，例如二甲基甲酰胺；醇类，例如乙醇和甲醇；以及醚类，例如二***和四氢呋喃。 
所述反应可在宽的温度范围内发生。通常，发现在从0℃至150℃的温度进行所述反应是方便的(更优选从约室温至100℃)。所述反应需要的时间也可根据许多因素，特别是反应温度和试剂的性质，在很大程度变化。然而，假如所述反应在上文概述的优选的条件下完成，通常3小时至20小时的时间是足够的。 
这样制备的化合物可通过传统方式从反应混合物中回收。例如，可通过从所述反应混合物中馏出溶剂，或者如果必要，在从所述反应混合物中馏出所述溶剂后，将残余物倾至水中，接着用与水不混溶的有机溶剂萃取并从萃取液中馏出所述溶剂来回收所述化合物。另外，如果需要，还可通过各种熟知的技术进一步纯化所述产物，例如，重结晶、再沉淀或各种色谱技术，特别是柱色谱或制备薄层色谱。 
本发明的式(I)化合物的制备方法是本发明的进一步目标。 
根据第一方面，本发明的式(I)化合物可通过式(II)化合物与式(III)化合物反应以形成仲胺或叔胺、羧酰胺、脲、磺酰胺或硫脲被获得， 
其中R1、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、A、q、n和i如上文式(I)定义，Y是离去基团。 
离去基团是使得化合物(II)和(III)的反应官能团导致如式(I)中的-NR5-(A)i-基团。 
优选离去基团Y选自卤素、OH、活化OH如R-S(O)2O-基团，其中R是芳基或直链或支链C1-C6(烷基)。优选地，R-S(O)2O-是Ts-或Ms-基团其中Ts是并且Ms是
更具体地，当在化合物(I)中该基团包含-NR5-(A)i-是： 
·仲胺或叔胺：Y离去基团，选自卤素、OH、活化OH如R-S(O)2O-基团，其中R是芳基或直链或支链C1-C6(烷基)。优选地，R-S(O)2O-是Ts-或Ms-基团其中Ts是并且Ms是 且i＝0。通常，此类反应是烷基化反应，光延反应，并按照本领域众所周知的方法进行；或 
·羧酰胺：Y和A形成酰基氯或羧酸。一般地，当Y是OH，i是1且A是C(O)，肽偶联反应条件被使用； 
一般地，当Y是OH，i是1和A是C(O)此反应在存在偶联试剂，如EDCI(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐)与HOBt(N-羟基苯并***)，有或没有碱(如Et3N)在非质子溶剂如二氯甲烷或二甲基甲酰胺下进行； 
·脲：Y和A形成异氰酸盐；或 
·磺酰胺：Y和A形成磺酰氯；或 
·硫脲：Y和A形成硫代异氰酸盐。 
优选式(II)化合物是式(IIa)化合物 
其中如上文式(I’)和(Ia’)定义R1、q、L1、X’、R8、R8’、p、R3、R4和n。 
根据第二方面，本发明的式(I)化合物可通过式(IV)化合物与式(V)化合物反应以形成 
其中R1、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n和I是如上文定义，且Y是离去基团。 
优选Y是选自如上定义的环氧基、卤素、活化OH。 
更优选式(V)化合物是式(Va)化合物 
其中X、R8、R8’、p、R3、R4、n、A、L2和R6如上文式(I’)和(Ia’)定义。 
此反应通常在优选无机碱的碱和优选极性非质子溶剂的溶剂的存在下进行。 
式(III)与式(IV)的化合物为可商购的，或可由本领域技术人员基于其有机化学的常识制备。 
式(II)与式(V)化合物如下文一般程序所述而获得。 
根据第三方面，本发明的式(I)化合物可由相应的式(Ic)化合物反应而获得 
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、L1、L2、q、n和i如式(I)定义，且Xa是X的前体基团。式(Ic)化合物可分别由式(IIc)和(IIIc)或(IVc)和(Vc)的相应的化合物获得，用类似于上述式(I)化合物。 
本文使用的术语“前体”指的是与所指示的或所期望的化合物的不同之处在于存在和/或不存在基团或官能团的化合物。本领域技术人员已知的，此类基团或官能团可通过常见的官能化反应以被引入、转化和/或省略。 
官能化反应可以通过应用或改进已知的方法来进行。 
优选地，前体基团是使得能够通过一种或多种步骤从Xa开始，例如通过还原，酰胺化，氧化，水解，酯化以获得X。 
上述反应中，可以由本领域技术人员通过应用或调整在下文的例子中说明的方法进行。 
而且，本发明的方法还可以包括分离式(I)、(I′)、(Ia)、(Ib)或(I′a)化合物的附加步骤。这可以通过本领域技术人员以任何已知的常规方法，如上文描述的回收方法来进行。 
通常，起始产品是可商购的，主要由Aldrich或Acros或其它典型的化学品供应商，或者可以通过应用或调整任何已知的方法，或实施例中所述的那些来获得。 
根据进一步的目标，本发明还涉及包括如上定义的式(I)、(I′)、(Ia)、(Ib)或(I′a)的化合物的药物组合物与药学上可接受的赋形剂。 
如上定义的式(I)、(I′)、(Ia)、(Ib)或(I′a)的优选实施方案，涉及到本发明的化合物，及根据任何一种优选的特征或实施方案。 
根据再进一步的目的，本发明涉及本发明的式(I)的化合物，用于抑制半胱氨酸蛋白酶。 
有利的是，式(I)、(I′)、(Ia)、(Ib)或(I′a)的化合物，能够选择性和可逆性抑制半胱氨酸蛋白酶。 
本发明的化合物和药物组合物对抑制半胱氨酸蛋白酶是有用的，特别是特异性去泛素化酶如USP，尤其是在需要其的患者中的USP-7。 
本发明的化合物和药物组合物可用于治疗和/或预防癌症及代谢，尤其***和/或结肠癌、神经退行性疾病、如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、免疫疾病、骨和关节疾病、骨质疏松症、关节炎的炎性病症、心血管疾病、病毒感染(viral infection)和疾病、和/或病毒传染(viral infectivity)和/或潜伏、细菌感染和疾病是特别有用的。 
本发明的化合物和药物组合物可用于不具有作用于老年性痴呆症特别是，阿尔茨海默氏病的β-淀粉样蛋白斑的患者。 
特别地，所述病毒感染和疾病是选自单纯疱疹-1或-2病毒感染、甲型肝炎、丙型肝炎、SARS冠状病毒感染和疾病、EB病毒(Epstein-Barr virus)、鼻病毒感染和疾病、腺病毒感染和疾病、脊髓灰质炎。 
根据一种方面，所述化合物抑制一种或多种病毒半胱氨酸蛋白酶。 
细菌半胱氨酸蛋白酶可选自链球菌蛋白酶(streptopain)、梭菌蛋白酶、葡萄球菌半胱氨酸蛋白酶，牙龈菌蛋白酶(gingipain)。 
本发明还涉及包括如上定义的式(I)的化合物与一种或多种活性剂选自抗癌剂、神经学剂、血栓溶解剂、抗氧化剂、抗感染剂、抗高血压剂、利尿剂、血栓溶解剂、免疫抑制剂、心血管剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗菌剂的组合。 
本发明还涉及相应的治疗方法，其包括向需要其的患者与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用本发明的化合物。 
根据本发明，术语“患者”或“需要其的患者”，指的是动物或人受到或可能受到在其发病机制中涉及活性半胱氨酸蛋白酶的病理状态的影 响。优选地，该患者是人。 
需要治疗本文描述的疾病和病症的那些受试者的鉴定是在本领域的一种技术人员的能力和知识范围之内。本领域的熟练的兽医或医生，通过使用临床测试、体检、医疗/家族史或生物学和诊断测试，可以容易地鉴定这些受试者谁需要此类治疗。 
根据本发明有效地预防或治疗病理状态，要求活性半胱氨酸蛋白酶的抑制参与其发病机理，“治疗有效量”是指化合物/药剂的量。 
正如本领域技术人员，治疗有效量可以由主治诊断医生容易地确定，通过使用常规技术和通过观察类似情况下获得的结果。为确定治疗有效量，许多因素被主治诊断医生考虑，包括但不限于：受试者的物种；其大小、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病；损害或疾病的严重程度；个体受试者的反应；施用的特定化合物；施用模式；所施用的制剂的生物利用率特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；以及其它相关情况。 
式(I)、(I′)、(Ia)、(Ib)或(I′a)的化合物的需要实现所需生物效应的量将根据多种因素变化，包括所使用的化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物的效力、疾病的类型、患者所属的物种、患者的患病状态、施用途径、化合物通过选择的施用途径的生物利用率，所有因素决定了所需剂量、将要施用的递送和方案。 
“药学上”或“药学上可接受的”是指，当适当的施用于动物或人时，不产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。 
如本文所使用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何载体、稀释剂、佐剂、或运载剂(vehicle)，如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂或抗真菌剂、等张剂(isotonic agent)或吸收延迟试剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用在本领域是公知的。除了任何传统介质或试剂与活性成分不相容之外，也要考虑它在治疗组合物中的应用。补充的活性成分也可并入组合物中成为合适的治疗组合物。 
在本发明的上下文中，本文所使用的术语“治疗(treating或treatment)” 指对该术语所应用的失调或病况、或该失调或病况的一种或多种症状的发展的反转、减轻、抑制，或预防。 
在普通术语中，对于肠胃外给药，可以以含0.1到10％w/v化合物的含水生理缓冲溶液来提供本发明的化合物。典型的剂量范围为每天从1μg/kg乘以体重数至0.1g/kg乘以体重数；优选的剂量范围为每天从0.01mg/kg乘以体重数到100mg/kg乘以体重数或人类儿童中的等同剂量。要施用的药物的优选剂量很可能依赖于如下的可变因素：疾病或失调的类型和发展的程度、具体患者的总体健康状况、所选化合物的相对生物学效应、化合物的配方、施用途径(静脉内、肌肉内、或其它)、通过所选递送途径的化合物药代动力学特性、以及施用的速度(丸剂或连续输注)和施用方案(在给定时间段内的重复次数)。 
还能够以单位剂量的形式施用本发明的化合物，其中表述“单位剂量”指能够施用至患者、且容易处理和包装的单一剂量，该单一剂量保持为包括活性化合物自身或作为药学上可接受的组合物的物理和化学稳定的单位剂量，如下文所述。就此，典型的总日剂量范围从0.01至100mg/kg乘以体重数。经由通用指南，人的单位剂量范围从每天1mg至3000mg。优选地，单位剂量范围从1至500mg，每天施用1至6次；且甚至更优选地，从10mg至500mg，每天施用1次。通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合可将本文提供的化合物配制成药物组合物。所述单位剂量的组合物可被制备成用于口服给药，尤其为片剂、简单的胶囊或软凝胶胶囊形式；或用于鼻内给药，尤其为粉剂、滴鼻剂或气雾剂形式；或用于皮肤给药，例如局部给药的药膏、乳膏、洗剂、凝胶或喷雾剂，或经皮的贴片。 
可以单位剂量的形式方便地施用上述组合物，且可通过制药领域公知的任何方法制备该组合物，例如如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第20版；Gennaro，A.R.，编辑；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia,PA，2000中所述的。 
优选的剂型包括其中本发明的化合物配制成用于口服或胃肠外给药的药物组合物。 
用于口服施用的片剂、丸剂、粉剂、胶囊、锭剂(troche)等可包含任 何以下成分的一种或多种、或具有相似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，或黄蓍胶；稀释剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶态二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或增味剂，如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊可为硬胶囊或软胶囊，其通常由可任选地混有增塑剂的明胶混合物制得，以及淀粉胶囊的形式。此外，剂量单位形式可包含多种改变剂量单位物理形式的其它材料，例如糖的包衣、虫胶(shellac)或肠内吸收剂。其它口服药物剂型糖浆或酏剂可包含甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和增味剂。此外，可将所述活性化合物并入快速溶解、控释或缓释的制剂和剂型中，且其中所述缓释剂型优选为双峰释放。优选的片剂包含乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、硬脂酸镁或滑石粉的任何组合。 
用于肠胃外施用的液体制剂包括无菌的水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。液体组合物还可包括粘合剂、缓冲液、防腐剂、螯合剂、甜味剂、增味剂和着色剂等。非水溶剂包括：醇类，丙二醇、聚乙二醇；植物油，如橄榄油；以及有机酯类，如油酸乙酯。水性载体包括醇类和水的混合物、缓冲的介质及盐水。尤其是，生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制活性化合物释放的赋形剂。静脉内的运载剂可包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)的那些)等。其它用于这些活性化合物的潜在有用的肠胃外递送***包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注***及脂质体。 
可选择的施用方式包括吸入剂型，其包括如干粉末、气雾剂或滴剂的方式。它们可以是包含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水性溶液，或用于以滴鼻剂形式施用的油性溶液，或作为鼻内应用的凝胶。用于含服的剂型包括，例如糖锭(lozenge)或糖果锭剂(pastille)，且还可包括增味基，如蔗糖或***胶，以及其它赋形剂诸如甘胆酸盐。适用于直肠施用的剂型优选呈现为单位剂量的栓剂，且具有固体基载体，且可包括水杨酸盐。用于局部应用至皮肤的剂型优选采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可使用的载体包括凡士林、 羊毛脂、聚乙二醇、醇类及其组合。适用于经皮肤施用的剂型可表现为独立的贴片，且可为溶解在和/或分散在聚合物或胶粘剂中的亲脂性乳剂或缓冲的水溶液。 
通过下面实施例和附图中的描述对本发明进行进一步但不受限制的解释，其中实施例和附图非限制性地阐释了在生理条件下在一组活性DUB中选择性抑制USP7的去泛素化活性。 
图1显示了使用HEK293蛋白质组的实施例2和实施例5的(12.5-25-50-100-200μM)竞争性HAUbVS凝胶。 
图2显示了使用HEK293蛋白质组的比较实施例2和实施例5的对USP7和额外的去泛素化酶(USP8、USP5、USP10、CYLD、UCH-L3)的活性的竞争性HAUbVS凝胶。 
图3显示了以USP7和实施例2的时间依赖实验。 
图4显示了在实施例2和实施例3的存在下以USP7的凝胶过滤实验后获得的可逆性结果。 
图5显示了在实施例2和实施例3的存在下以USP7的快速且大量稀释后获得的可逆性结果。 
图6代表了在天然条件下通过ESI-MS评估的涉及USP7和实施例1及实施例2的络合物的表征。 
实验 
本发明的代表性化合物概述于下表： 
本发明的代表性化合物可根据下列步骤合成。 
常规分析步骤
在使用CDCl3或DMSO-d6(二甲亚砜)作为溶剂的Bruker或Varian光谱仪上，记录用于1H的300或400MHz下或用于13C的75或100MHz下的NMR光谱。得到以ppm表示的参照内部TMS(三甲基甲硅烷基)或氘化溶剂信号的化学位移。 
使用LC-MS分析来分析和纯化目标化合物。使用Waters Micromass、Bruker Esquire3000(ESI-IT)或Agilent Iontrap XCT-Plus质谱仪和具有UV和/或DAD检测的Waters Alliance2790或Agilent1100系列LC***进行LC-MS分析。色谱柱：Waters XTerra MS C18，30x2.1mm(3.5μm)，AtlantisT3C18，3μm，50mm x2.1mm或Inertsil C8，250mm，4.6mm，5μm。流速：0.8-1.2ml/min，梯度：a)水10％MeOH(甲醇)，甲酸铵10mM，至100％MeOH或b)95％水-乙腈，0.1％HCOOH至95％乙腈。)。UV检测：190至400nm。所有化合物均>95％纯度。 
代表性的步骤1：
实施例1-14的制备 
反应方案1 
式(c)化合物是由化合物(b)通过如J.Amer.Chem.Soc.1965，87，1353-1364和WO2005054249所述的Corey-Chaycovsky反应得到，或者通过衍生物(b′)的双键的环氧化作用得到。化合物(b)是市售的或从在本领域中众所周知的保护反应后的化合物(a)获得。保护基团(PG)是例如苄基(Bn)、苯甲酰基(BZ)、叔丁氧基羰基(BOC)或苄氧羰基(CBZ)。 
当在二甲基甲酰胺、丙酮等中加热到50至100℃之间时，在类似NaH、KF、K2CO3、Cs2CO3的碱的存在下环氧乙烷(c)与喹唑啉酮(IV)进行开环。 
哌啶氮的脱保护是根据已知的方法进行的，得到化合物(II)。 
肽偶联反应是根据本领域众所周知的方法在化合物(II)和酸衍生物HO-C(O)-CH2(Z1)-CH2-D(化合物III)之间进行的。对于一些实施例条件，类似EDCI(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐)、HOBt(N-羟基苯并***)和Et3N在二氯甲烷(CHCl2)是优选的。当与酰氯衍生物进行反应时，也可能形成酰胺键。 
化合物(IV)是商购的或根据文献步骤制备。 
下列化合物是通过代表性步骤1的实施获得的： 
-q是0，n是1，Z1是H和D1是苯基(实施例1，描述于实验部分) 
-q是1，n是1，R1是Cl，Z1是H和D1是苯基(实施例2) 
-q是0，n是1，Z1是H和D1是环戊基(实施例3) 
-q是1，n是1，R1是Cl，Z1是H和D1是环戊基(实施例4) 
-q是0，n是1，Z1是CH3和D1是苯硫基(实施例5) 
-q是0，n是1，Z1是CH3和D1是H2(实施例6) 
-q是2，R1是OMe，n是1，Z1是CH3和D1是H2(实施例7) 
-q是1，R1是Cl，n是1，Z1是CH2CH3和D1是CH3(实施例9) 
-q是0，n是1，Z1是H，D1是2-Ome-苯基(实施例10) 
-q是1，R1是Cl，n是1，Z1是CH3，D1是苯硫基(实施例11) 
-q是0，n是1，Z1是H，D1是苯硫基(实施例12) 
-q是0，n是1，Z1是CH3，D1是苯基(实施例13) 
-q是1，R1是Cl，n是1，Z1是CH3和D1是苯基(实施例14) 
通过应用或调整了上文公开的方法而制备的一些化合物的所选取的数据如下所示： 
实验
实施例1：3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
步骤1：叔-丁基1-氧杂-6-氮杂螺[2.5]辛烷-6-羧酸酯的制备 
向含1-叔丁氧基羰基-4-哌啶酮(6.1g，30.6mmol，1eq)的四氢呋喃(200ml)的搅拌溶液中添加三甲基碘化亚砜(6.8g，30.6mmol，1eq)和叔丁醇钾(4.0g，30.6mmol，1eq)。将混合物回流18h并真空浓缩。将粗产物溶解在AcOEt(100ml)中，并用水(100ml)洗涤。分离各层，并且将水层用AcOEt萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。该固体通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9/1)，得到白色固体的化合物叔-丁基1-氧杂-6-氮杂螺[2.5]辛烷-6-羧酸酯(3.3g，52％)。 
步骤2：叔-丁基4-羟基-4-[(4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-3-基)甲基]哌啶-1-羧酸酯的制备 
向含4-羟基喹唑啉(1.65g，11.3mmol，1.1eq)的DMF(20mL)溶液中添加来自步骤1的化合物(2.35g，1eq)和碳酸铯(10.34g，3eq)。将混合物在80℃加热过夜。将混合物用NH4Cl的饱和溶液洗涤，将水层用AcOEt萃取。将有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。该粗产物通过快速色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯3/7)，得到无色油状的叔-丁基-4-羟基-4-[(4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-3-基)甲基]哌啶-1-羧酸酯(1.6g，40％)。 
MS(ES+，m/z)：360.2[M+H]+，719.6[2M+H]+ 
步骤3：3-[(4-羟基哌啶-4-基)甲基]-3，4-二氢喹唑啉-4-酮的三氟乙酸盐的制备 
来自步骤2的化合物(1.0g，2.8mmol)溶解于TFA(三氟乙酸)(80ml)，将反应混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩。粗3-[(4-羟基哌啶-4-基)甲基]-3,4-二氢喹唑啉-4-酮的三氟乙酸盐，不经纯化直接用于下一步骤。 
MS(ES+，m/z)：260.1[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.53(宽m，1H)，8.25(s，1H)，8.27(宽m，1H)，8.17(dd，1H)，7.85(dd，1H)，7.70(dd，1H)，7.57(dd，1H)，4.07(s，2H)，3.18(m，2H)，3.02(m，2H)，1.60(m，2H)，1.50(m，2H) 
步骤4：3-{[4-羟基-l-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
向含来自步骤3的TFA盐(0.8mmol，1eq)的CH2Cl2(10ml)的溶液中依次加入DIEA(N,N二异丙基乙胺)(0.4mL，2.4mmol，3eq)、氢化肉桂酸(150mg，0.96mmol，1.2eq)、EDCI(306mg，1.6mmol，2eq)和HOBt(216mg，1.6mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)，得到白色 固体的实施例1(256mg，82％)。 
MS(ES+，m/z)：392.2[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.25(s，1H)，8.17(dd，1H)，7.84(dd，1H)，7.69(dd，1H)，7.55(dd，1H)，7.21(m，5H)，4.96(s，1H)，4.04(m，3H)，3.64(m，1H)，3.21(m，1H)，2.93(m，1H)，2.80(m，2H)，2.62(m，2H)，1.41(m，4H) 
实施例5：3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
向来自实施例1的步骤3中的TFA盐(0.42mmol，1eq)的CH2Cl2(10mL)溶液中依次加入DIEA(0.37mL，2.12mmol，5eq)、2-甲基-3-(2-噻吩基)丙酸(71mg，0.42mmol，1eq，Organometallics，2002，21，2842)、EDCI(161mg，0.84mmol，2eq)和HOBt(114mg，0.84mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)。使用相同的条件通过柱色谱进行第二次纯化，在高度真空下溶剂蒸发和干燥后，实施例5(117mg，68％)，为白色固体。 
MS(ES+，m/z)：412.2[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.24(s，1H)，8.17(m，1H)，7.84(m，1H)，7.70(m，1H)，7.56(m，1H)，7.27(m，1H)，6.88(m，1H)，6.82(s，1H)，4.96(s，1H)，4.06(m，1H)，3.90(m，2H)，3.68(m，1H)，3.20(m，5H)，1.34(m，4H)，1.02(m，3H) 
实施例11：7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮 
步骤1：叔-丁基4-[(7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-3-基)甲基]-4-羟基哌啶-1-羧酸酯的制备 
向7-氯-3,4-二氢喹唑啉-4-酮(0.40g，2.2mmol，1eq)的DMF(5mL)的溶液中加入来自实施例1的步骤1的化合物(0.47g，1eq)和碳酸铯(2.17g，3eq)。将反应混合物在80℃加热过夜，然后使其达到室温。将 混合物用饱和NH4Cl溶液洗涤，然后用AcOEt萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过快速色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯3/7)。通过快速色谱在硅胶上进行第二次纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯6/4到0/10)，得到无色油状的叔-丁基4-[(7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-3-基)甲基]-4-羟基哌啶-1-羧酸酯(0.6g，68％)。 
步骤2：7-氯-3-[(4-羟基哌啶-4-基)甲基]-3，4-二氢喹唑啉-4-酮的三氟乙酸盐的制备 
由上文步骤1的化合物(0.6g，1.5mmol溶解于TFA(5ml)中且反应混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩。粗的7-氯-3-[(4-羟基哌啶-4-基)甲基]-3，4-二氢喹唑啉-4-酮的三氟乙酸盐，不经纯化直接用于下一步骤。 
步骤3：7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
向来自上文步骤2的TFA盐(0.51mmol，1eq)的CH2Cl2溶液(18ml)中依次加入DIEA(0.45mL，2.5mmol，5eq)、2-甲基-3-(2-噻吩基)丙酸(86mg，0.51mmol，1eq，Organometallics，2002，21，2842)、EDCI(196mg，1.02mmol，2eq)和HOBt(138mg，1.02mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)。通过快速柱色谱在硅胶上进行第二次纯化，以除去残留的试剂。将产物溶解于EtOH/H2O1/1中，将溶液冷冻干燥，得到白色蛋白霜状(meringe)的实施例11(85mg，经两个步骤40％)。 
MS(ES+，m/z)：446.2[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.27(m，1H)，8.17(m，1H)，7.77(m，1H)，7.59(m，1H)，7.25(m，1H)，6.90(m，1H)，6.82(m，1H)，4.96(s，1H)，4.09(m，3H)，3.68(m，1H)，3.20(m，5H)，1.50(m，4H)，1.03(m，3H) 
实施例12：3-({4-羟基-1-[3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二 氢喹唑啉-4-酮 
向来自实施例1的步骤3的TFA盐(0.42mmol，1eq)的CH2Cl2溶液(10ml)中依次加入DIEA(0.37mL，2.1mmol，5eq)、3-(噻吩-2-基)丙酸(80mg，0.51mmol，1.2eq)、EDCI(161mg，0.84mmol，2eq)和HOBt(114mg，0.84mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌持续4天，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)。将产物溶解于EtOH/H2O，且将溶液冷冻干燥，得到白色蛋白霜状的实施例12(125mg，75％)。 
MS(ES+，m/z)：398.2[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.24(s，1H)，8.16(dd，J＝8Hz，1H)，7.84(dd，J＝8Hz，J＝8Hz，1H)，7.68(d，J＝8Hz，1H)，7.55(dd，J＝8Hz，J＝8Hz，1H)，7.27(m，1H)，6.90(m，3H)，4.98(s，1H)，4.09(m，1H)，3.99(m，2H)，3.64(m，1H)，3.23(m，1H)，3.00(m，2H)，2.92(m，1H)，2.66(m，2H)，1.45(m，4H) 
实施例13：3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮 
向来自实施例1的步骤3的TFA盐(2.37mmol，1eq)的CH2Cl2溶液(30ml)中依次加入DIEA(1.24mL，7.11mmol，7eq)、2-甲基-3-苯基丙酸(466mg，2.84mmol，1.2eq)、EDCI(909mg，4.74mmol，2eq)和HOBt(640mg，4.74mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)，得到白色固体的实施例13(640mg，经两个步骤66％)。 
MS(ES+，m/z)：406.3[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.20(m，2H)，7.84(m，1H)，7.68(m，1H)，7.56(m，1H)，7.20(m，5H)，4.90(m，1H)，3.85(m，4H)，3.11(m，2H)，2.82(m，2H)，2.52(m，1H)，1.48(m，4H)，1.00(m，3H). 
实施例14：3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-7-氯-3，4-二氢 喹唑啉-4-酮 
向来自实施例11的步骤2的TFA盐(0.34mmol，1eq)的CH2Cl2溶液(10ml)中依次加入DIEA(0.18mL，1.02mmol，3eq)、2-甲基-3-苯基丙酸(67mg，0.41mmol，1.2eq)、EDCI(130mg，0.68mmol，2eq)和HOBt(104mg，0.68mmol，2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将粗产物通过快速柱色谱在硅胶上纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯从2/8至0/10，然后用乙酸乙酯/MeOH9/1)，得到白色固体的实施例14(56mg，经两个步骤37％)。 
MS(ES+，m/z)：440.3[M+H]+ 
1H NMR(DMSO-d6)δ：8.29(d，J＝8Hz，1H)，7.20(t，J＝8Hz，1H)，7.79(宽s，1H)，7.64-7.61(m，1H)，7.32-7.26(m，2H)，7.22-7.16(m，3H)，4.94(d，J＝6Hz，1H)，4.15-3.79(m，3H)，3.68(t，J＝14Hz，1H)，3.24-3.09(m，2H)，2.89-2.82(m，2H)，1.59-1.21(m，4H)，1.03(d，J＝6Hz，3H)，0.78-0.75(m，1H) 
代表性的半胱氨酸蛋白酶
USP7蛋白生产&纯化
通过PCR扩增从胎盘mRNA获得了编码USP7的cDNA。USP7的cDNA通过PCR亚克隆到杆状病毒表达载体(pFastBac-HT；Invitrogen)中。根据制造商的说明书，使用来自Invitrogen的Bac-至-Bac杆状病毒***将全长野生型人源USP7及其催化突变体(半胱氨酸223被丙氨酸取代，C223A)制成草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(Sf9，Invitrogen)中的N-末端带His-标签融合。使用pFastBac-HT-B-USP7转化DH10bac细胞(Invitrogen)，在X-gal/IPTG琼脂板上进行蓝/白筛选。通过碱裂解法制备杆状病毒质粒DNA。通过使用通用或特异性引物的PCR检验杆状病毒质粒小量制备的完整性及其取向。在27℃下InsectXpress培养基(Cambrex)中培养Sf9昆虫细胞，且使用GeneShuttle40(Q-BIOgen)以对应的杆状病毒质粒转染Sf9昆虫细胞。转染72h后在上清液中回收病毒。通过使用500μl来自转染的Sf9细胞的上清液感染在150cm2细胞培养瓶内的50mlInsectXpress培养基中的昆虫细胞(Sf9或High Five细胞；Invitrogen)来 扩增病毒。在第二轮扩增后，通过快速SDS裂解回收感染的细胞，回收的细胞在100℃沸腾5min，进行短暂的超声处理并以14,000g离心20min。将被感染的Sf9细胞中的表达水平与未感染的细胞中的表达水平进行对比。然后在缓慢摇动下，允许融合蛋白在4℃与TALON珠(BDBiosciences，TALON金属亲和树脂)结合30min。彻底洗涤珠(50mM磷酸钠缓冲液pH7.0，500mM NaCl，10mM咪唑，0.5％Triton X-100和10％甘油)，且在补充有250mM咪唑(Sigma)的洗涤缓冲液中将结合蛋白洗脱下来。在4-12％的NuPAGE凝胶(Novex，Invitrogen)上分析洗脱的级分。将包含高浓度纯化蛋白(纯度>95％)的级分透析(20mM Tris HCl pH7.6，200mM NaCl、l mM DTT、1mM EDTA和10％甘油)，进行等分，且在储存于-80℃之前在液氮中迅速冷冻。 
USP7活性测定
将USP7稀释于USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸)；5mM DTT；0.01％TritonX-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1pH7.6)中。在-20℃将化合物储存液(10mM)储存于DMSO中。在不同浓度检测化合物：从200μM至91nM。 
在Black384孔板(小体积的微孔板；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。USP7的底物浓度为300nM Ub-AMC(Chem.Biol.，2003，10，第837-846页)(BostonBiochem)。在特异性测定中酶(USP7)的浓度为100pM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型(sigmoidal)模型(可变斜率)。 
USP5活性测试
将USP5稀释于USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％TritonX-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1pH7.6)中。在-20℃将化合物储存液(100mM)储存在DMSO中。测试不同浓度的化合物：从200μM至91nM。 
在Black384孔板(小体积的微孔；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。USP5的底物浓度为300nM的Ub-AMC(Boston Biochem)。在特异性测定中酶(USP5)的浓度为300pM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，其中酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)。 
USP8的克隆&纯化
通过PCR扩增从胎盘mRNA中获得编码USP8的cDNA。通过PCR将USP8的cDNA亚克隆至杆状病毒表达载体(pFastBac-HT，Invitrogen)中。通过诱变PCR产生编码突变的USP8的cDNA。对应的蛋白在786位残基上的半胱氨酸编码至丙氨酸的取代。通过对整个开放阅读框的测序来确定序列。在DHlObac转座之后产生编码USP8的杆状病毒质粒。将对应的杆状病毒质粒转染至昆虫细胞(Sf9)中。从培养上清液中回收病毒，且将病毒扩增两次。感染昆虫细胞(Sf9或High Five，Invitrogen)72h。收集总细胞裂解液，且在裂解缓冲液(Tris HCl50mM pH7.6，0.75％NP40；500mM NaCl；10％甘油；1mM DTT；10mM咪唑；蛋白酶抑制剂混合物；AEBSF20μg.ml-1；抑肽酶(Aprotinin)10μg.ml-1)中裂解。在金属亲和树脂(Talon金属亲和树脂，BD Biosciences)上对蛋白进行亲和纯化。结合的材料在洗涤缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；300mM NaCl；10mM咪唑；0.5％Triton X-100；10％甘油)中被彻底洗涤，且以含250mM咪唑的洗涤缓冲液被从树脂上洗脱。在透析缓冲液(Tris HCl pH7.620mM；NaCl200mM；DTT1mM；EDTA1mM；10％甘油)中透析蛋白。在4-12％的 NuPAGE(Invitrogen)上分析蛋白纯化。 
USP8活性测试
将USP8稀释于USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mMDTT；0.01％TritonX-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1pH8.8)中。在-20℃将化合物储存液(100mM)储存在DMSO中。检测不同浓度的化合物：从200μM至91nM。 
在Black 384孔板(小体积的微孔；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。USP8的底物浓度为300nM的Ub-AMC (Boston Biochem)。在特异性测定中酶(USP8)的浓度为1.36nM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，其中酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)。 
UCH-L1活性测试
将UCH-L1稀释于USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％TritonX-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1pH7.6)中。在-20℃将化合物储存液(100mM)储存在DMSO中。检测不同浓度的化合物：从200μM至91nM。 
在Black384孔板(小体积的微孔；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。UCH-L1的底物浓度为300nM的Ub-AMC(Boston Biochem)。在特异性测定中酶(UCH-L1)的浓度为2.5nM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，其中酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射 光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)。 
UCH-L3活性测试
将UCH-L3稀释于USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mMDTT；0.01％TritonX-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1pH7.6)中。在-20℃将化合物储存液(100mM)储存在DMSO中。检测不同浓度的化合物：从200μM至91nM。 
在Black384孔板(小体积的微孔；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。UCH-L3的底物浓度为300nM的Ub-AMC(Boston Biochem)。在特异性测试中酶(UCH-L3)的浓度为13pM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，其中酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)。 
胱天蛋白酶3活性测试
将胱天蛋白酶3稀释于胱天蛋白酶3缓冲液(100mM Hepes pH7.5；10％蔗糖；0.1％CHAPS)中。在-20℃将化合物储存液(100mM)储存在DMSO中。检测不同浓度的化合物：从200μM至91nM。 
在Black384孔板(小体积的微孔；Greiner；10μl最终反应体积)中重复进行反应。胱天蛋白酶3的底物浓度为250nM的(Ac-DEVD-AMC；Promega)。在特异性测定中酶(胱天蛋白酶3)的浓度为1.6nM。为了在初速度下以固定底物浓度进行特异性测定而确定浓度。化合物在25℃下与酶预温育30分钟。通过向包含酶(+/-化合物)的板中加入底物来引发反应，其中酶稀释在测定缓冲液中。反应在37℃温育60分钟。通过加入乙酸(100 mM终浓度)终止反应。在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。λ发射光＝380nm；λ激发光＝460nm。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)。 
细胞活力和增殖方法
HCT116细胞活力和增殖测定
HCT116结肠癌细胞获得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)，且在含10％FBS、3mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Mc Coy’s5A培养基中培养。将细胞在37℃，含5％CO2的湿润气氛中温育。 
根据制造商的说明书使用MTS技术在96孔培养板(CelITiter含水非放射性细胞增殖测定，Promega)中测定细胞活力。MTS(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)是MTT衍生的四唑，其可在新陈代谢活性细胞中被还原成可溶的、细胞渗透性的甲腊(formazan)。由在492nm处的其吸光度检测到的甲腊的量与存活的、新陈代谢活性细胞的数目成比例。 
每孔接种103个HCTl16细胞。24小时后更换培养基，使用100μM至50nM的浓度的每种化合物一式三份处理上述细胞。将化合物稀释于100％的DMSO中，细胞上的化合物的终浓度保持为0.5％。 
细胞与化合物一起温育72小时，然后通过加入MTS持续2小时来测定细胞活性。自96孔培养板直接测量在492nm处的吸光度。使用S型可变斜率拟合(sigmoidal variableslope fit)(Prism4.0，Graphpad软件)计算每种化合物的GI50(生长抑制50)浓度。数值以三个独立实验的平均值呈现。 用于从一组在细胞裂解液中有活性的去泛素化酶来评估化合物选择性的方法
泛素的C-末端修饰的乙烯砜衍生物UbVS显然有助于使在细胞中的活性DUB直接可视化。共价结合至去泛素化酶的半胱氨酸活性位点的该工具被成功应用于发现和表征新的泛素/泛素样蛋白酶，且应用于描述正常细胞、病毒感染细胞和恶性细胞中的活性去泛素化酶(Borodovsky等人，Chem  Biol2002,9,1149-1159,Hemelaar等人，Mol CellBiol2004,24，84-95，Ovaa等人，Proc NatlAcad Sci USA2004101,2253-2258)。 
本研究中使用HA-Ub-VS探针(血凝素标签-泛素-乙烯砜(Hemagglutintag-Ubiquitin-Vinyl Sulfone))以从天然蛋白质组中直接可视所有去泛素化酶的活性。该工具用于相对于在生理条件下有活性的所有去泛素化酶来评估我们的小分子化合物对USP7的活性/特异性。 
HEK293细胞被收集，并使用含有Tris pH7.4，50mM；NaCl，150mM；MgCl2，5mM；EDTA，0.5mM；DTT，2mM；ATP(腺苷三磷酸)，2mM；NP40(壬基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇)，0.5％和甘油(10％)的非变性缓冲液在冰上裂解细胞。将样品在4℃温育1小时，且澄清。然后通过Bradford方法(Bio-Rad ProteinAssay)为蛋白质定量。在室温下以实施例1和2的化合物(从12.5μM至200μM)或以非特异性DUB抑制剂作为对照，处理来自天然细胞裂解液的50μg蛋白质达2小时。泛素标记反应通过在标记缓冲液(Tris pH7.6，50mM；MgCl2，5mM；EDTA，0.5mM；DTT，2mM；ATP，2mM；蔗糖，250mM)中加入HA-Ub-VS(8μg/ml)引发，并在室温下温育15分钟。随后样品在100℃加热10分钟，并进行短暂的超声处理。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析它们，转移至硝酸纤维素膜，并用抗USP7、HA、UCH-L3、CYLD、USP8、USP5、USP10和Stat3的抗体进行探测。使用辣根过氧化物酶(HRP)-共轭的抗小鼠(Jackson Laboratories，115-035-003)或HRP--共轭的抗兔(Cell Signaling，7074)的抗体作为二抗。根据试剂制造商的说明书使用增强的化学发光试剂(ECL；Amersham)检测信号。 
结果
1.Ub52用作USP7和USP8底物来评估USP调节物 
对于根据本发明的组合物，根据以下步骤对USP7和USP8进行体外测定。 
泛素-核糖体蛋白的融合蛋白的制备 
使用专有的人类胎盘文库从人类RNA扩增编码泛素和核糖体蛋白 L40(ub52或uba52或泛素-L40)之间的融合蛋白的cDNA。将cDNA亚克隆至细菌表达载体(pGEX-2T，GE Healthcare)中，该载体在编码蛋白的羧基末端包含额外的flag标签。使用以下引物以与GST标签在同一阅读框的方式将泛素-L40亚克隆至pGEX-2T的BamHI和EcoRI限制性酶切位点之间：pGEX-2T：5’-cgtggatccatgcagatctttgtgaagaccctc-3’(SEQ ID NO：1)和5’-gcgaattctttatcgtcatcgtctttgtagtctttgaccttcttcttgggacg-3’(SEQ ID NO：2)。 
为了生产和纯化重组蛋白，将质粒pGEX-2T-Ub52-flag转化至大肠杆菌BL21(Stratagene)中，经转化的大肠杆菌BL21在添加有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基(LB ampi)中，在37℃生长过夜，然后以1/100稀释于LB ampi中。这些细胞在37℃温育至达到A600＝0.6-0.8。使用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，将培养物在30℃温育180min。 
通过在4℃，7000xg离心15min收集细胞。将细菌小球在NETN(Tris HCl pH8.0；EDTA1mM；NP400.5％；蛋白酶抑制剂混合物，PMSF1mM)中裂解，并进行短暂的超声处理。通过以14000xg离心30min去除不溶材质。根据Everett RD等人，EMBO J.(1997)16，1519-1530纯化GST-Ub52-flag蛋白质。简单说，于4℃将可溶解的级分在谷胱甘肽珠上温育120min，该谷胱甘肽珠经NETN缓冲液+0.5％牛奶预平衡。回收经过的流体。彻底洗涤珠：最后的洗涤在Tris HCl pH7.620mM；NaCl100mM；MgCl212mM中进行。洗脱使用在50mM Tris HCl pH8.0、NaCl120mM中的20mM还原型谷胱甘肽进行。经0.1M DTT处理及变性，以考马斯亮蓝染色后，在4-12％的NuPAGE上分辨所有级分。洗脱液在4℃Tris HCl pH7.620mM；NaCl50mM；DTT0.5mM中透析过夜。 
使用均相时间分辨荧光(homogenous time-resolved fluorescence， )测量方法测定融合蛋白(GST-Ub52-标记) 
GST-Ub52-flag的使用是基于在均相介质中荧光发射迁移的时间分辨测量。 
使用的试剂如下： 
-称为抗-Flag-K(CIS bio international)的抗-flag抗体-铕穴状化合物 (europium cryptate)共轭物，在0.8M KF、0.1％牛血清白蛋白、Tris HCl25mM pH7.6中的0.2μM的溶液。 
-抗-GST抗体-XL665共轭物(CIS bio international)，在0.8M KF、0.1％牛血清白蛋白、Tris HCl25mM pH7.6中的2.6μM溶液。 
-在50mM Tris HCl pH7.6、EDTA0.5mM、牛血清白蛋白0.05％、DTT5mM中的制备自上文描述的储存溶液的14.75μM的GST-Ub52-Flag溶液和37.7μM的MBP_Ub52。 
在多孔测试板上进行测定。在4℃温育过夜后，在PHERAstar荧光计(BMG)上分析这些板(激发光337nm，发射光620和665nm)。 
使用泛素-核糖体蛋白的融合蛋白测定去泛素化类型的酶的活性 
使用的试剂如下： 
-在50mM Tris HCl pH7.6、牛血清白蛋白0.05％、DTT5mM中的200pM的USP7溶液及400pM的USP8。 
-在0.8M KF、0.1％牛血清白蛋白、Tris HCl25mM pH7.6中的0.2μM抗-Flag-K(CIS bio international)溶液。 
-在0.8M KF、0.1％牛血清白蛋白、Tris HCl25mM pH7.6中的2.6μM抗-GST抗体-XL665共轭(CIS bio intemational)溶液。 
-在50mM Tris HCl pH7.6、EDTA0.5mM、牛血清白蛋白0.05％、DTT5mM中通过稀释自上文描述的储存溶液制备的14.75μM的GST-Ub52-flag溶液和37.7μM的MBP_Ub52。 
酶反应是通过将GST-Ub52-flag溶液与5μl的USP7溶液(终浓度200PM)或5μl USP8(终浓度400PM)混合被进行的。该混合物在多孔测定板上室温温育1小时。向多孔测定板的每个孔添加5μl的抗-Flag-K溶液(0.2μM)加5μl的抗-GST-XL665抗体(2.6μM)的10μl混合物。4℃温育过夜后，板在Pherastar荧光读数仪(BMG)上进行读数。 
信号的减少与酶活性的增加相关联，即GST-Ub52-Flag底物的裂解。因此，所使用的形式完全适合用于测定去泛素化类型酶的方法，如泛素特 异性蛋白酶，且还适用于测定此类酶的活性的调节物。 
去泛素化类型的酶活性的调节物的测定 
进行如上述的相同的方法用于测定去泛素化类型的酶的活性，但在化合物1至14的存在或不存在下，不同的反应混合物以相同的酶浓度被温育。数据(平均值+/-标准偏差)被分析为对照(没有化合物)的％，且使用GraphPad(Prism)将数据绘制成百分数对化合物浓度的对数值的图。数据拟合S型模型(可变斜率)且IC50(μm)被测定并在下表中呈现。 
2.使用UbAMC底物的USP7去泛素化活性的选择性抑制 
结果总结于下表(μM)： 
nd：由于在460nm的自发荧光未测定 
3.细胞活力/增殖的抑制 
结果总结于下表(μM)： 
4.在生理条件下USP7去泛素化活性对一组活性DUB的选择性抑制： 
为了证实来自重组酶的体外特异性观察，我们使用共价结合到去泛素化酶的半胱氨酸活性位点的HAUbVS基于活性的探针(ABP)，进行竞争性试验(Borodovsky等人，Chem Biol2002，9，1149-1159，Hemelaar等人，MolCellBiol2004，24，84-95，Ovaa等人，Proc NatlAcad Sci U SA2004101，2253-2258)。与重组酶相比，该测定法的优点是通过蛋白质印迹分析使用抗-HA抗体直接在天然蛋白质组中并行地评估抑制剂对众多去泛素化酶的效用。在该测定中，向总细胞裂解物添加抑制剂，且抑制性通过标记残留活性的使用HAUbVS的去泛素化酶来确定。该标记随后用抗HA抗体免疫印迹允许从HEK293细胞裂解物中识别所有活性去泛素化酶(图1，泳道2)。此标记，对DUB的活性形式是特异性的，是通过非选择性的方式的非特异性DUB抑制剂被抑制(图1，泳道14)。当在缺乏和存在不同剂量的实施例2和实施例5下以HAUbVS处理裂解的HEK293细胞，没有发现免疫印迹图案的改变，除了与HA-Ub-VS-USP7大小相对应的一条带几乎完全消失(图1)。如通过处理的和未处理的样品间观察到的迁移率变化所标示的，由抗USP7抗体证实了对USP7活性的此影响(图2)。 
通过单独监测几个去泛素化酶，我们接下来评估了USP7抑制剂对 HAUbVS标记效率的影响。为此，首先使用特异性抗体检查了对来自HEK293细胞裂解物的USP7、USP8、USP5、USP10、CYLD和UCH-L3的HAUbVS标记效率。如通过HAUbVS处理的和未处理的样品间观察到的迁移率变化所标示的，由所有测试的DUB证实了此标记，尽管有不同的效率比(图2，泳道1和2)。这些DUB的潜在抑制在实施例2和实施例5的存在下，以及非特异性DUB抑制剂作为对照下被评估。正如预期，我们发现非特异性DUB抑制剂抑制了所有测试的DUB(图2，泳道14)。令人感兴趣的是，我们发现，实施例2和实施例5有效地阻断了USP7的标记，但对USP8、USP5、USP10、CYLD或UCH-L3的标记则没有，显示了在生理条件下该USP7对一组活性DUB有特异性(图2)。这些数据一起表明，实施例2和实施例5在生理条件下天然蛋白质组中直接靶定USP7，且以剂量依赖的方式，与所有测试的去泛素化酶没有任何交叉反应。 
5.USP7特异性化合物是可逆性抑制剂 
为了更好地理解通过我们的USP7特异性化合物抑制USP7的机理，进行了几个实验。我们首先通过在不同时间点(30min、1h、2h、4h、6h)预温育实施例2(100μM)与USP7(100pM)表征了实施例2的抑制机制。然后如上文所描述的，以Ub-AMC底物评估去泛素化活性，并与用DMSO处理的样品相比较。令人感兴趣的是，通过实施例2(～75％)的USP7抑制被认为不依赖预温育时间(图3)。这些数据清楚地表明，实施例2不是USP7的时间依赖性抑制剂。 
接下来通过测量凝胶过滤后酶活性的恢复来确定抑制的可逆性。我们在实施例2和实施例3(100μM)存在下或作为不可逆的USP7抑制剂(25μM)对照化合物，在室温下温育USP7(100pM)4h。我们将每种样品的一些通过G50凝胶过滤***(Sephadex，G50superfine，Sigma Aldricht)。如上所述，以Ub-AMC底物评估了G50洗脱液的去泛素化活性，并与未进行G50过滤的样品相比较。反应使用PHERAstar(BMG Labtech)被监测。在没有过滤时，USP7活性被实施例2和实施例3以及由用作不可逆化合物的对照抑制剂所抑制(图4A，-G50)。使用仅含有这些化合物的样品，我们证实了通过G50柱过滤的所有化合物被完全保留在柱上(图4B)。通 过G50柱的包含USP7和实施例2和实施例3的样品的过滤导致USP7活性的完全恢复，而通过不可逆对照化合物的USP7抑制不能经由过滤被逆转(图4A，+G50)。因为预期不可逆的络合物洗涤后保持被抑制，我们的研究结果证明，实施例2和实施例3是可逆的USP7抑制剂。 
为了证实这些结果，我们测量了快速和大量稀释酶化合物络合物后酶活性的恢复。我们以超过活性测定所需浓度的100倍(10nM)的浓度，以相当于IC5010倍的抑制剂的浓度温育USP7(图5A)。合理平衡时间(1h)之后，将该混合物稀释100倍于含有UbAMC(300nM)的反应缓冲液中以引发反应(图5A)。含有USP7和实施例2和实施例3的样品的稀释导致USP7活性几乎完全恢复，而通过不可逆对照化合物的USP7抑制不能经由稀释被恢复(图5B)。快速和大量稀释后，实施例2和实施例3从USP7的解离导致大于约90％酶活性的恢复，清楚地表明实施例2和实施例3是快速可逆抑制剂。 
为了表征涉及USP7和实施例1、2、3和5的络合物，我们通过ESI-MS评估了在天然条件(7mM醋酸铵pH7.5)中的直接结合，如先前描述的(Vivat Hannah等人，Future Med Chem.20102(1)：35-50)。我们首先通过在3-5-10摩尔当量的实施例1、2、3和5存在下温育蛋白质以检查相互作用。如图6中所示用实施例1和实施例2，当以3或5摩尔当量过量测试时，所有这些化合物与USP7形成络合物至不同的程度，并显示对USP7的1：1的结合化学计量。USP7的存在或不存在的化合物的质量没有观察到差异。为了分离弱的非共价络合物，USP7/抑制剂络合物稀释于50/50/1H2O/CH3CN/HCOOH且在高能仪器条件(energetic instrumental conditions)(Vc＝120V，Pi＝4毫巴)下分析。在这些条件下，没有观察到USP7与实施例1、2、3和5间的结合，表明了USP7与实施例1、2、3和5形成非共价络合物。 
所有这些数据清楚地表明，这些USP7的特异性抑制剂通过可逆的方式结合USP7。 
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.-一种式(I’)化合物：
其中
·每一个R1是相同的或不同的，R1选自由卤素、R、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、NO2、(C1-C6)亚烷基-OR、(C1-C6)亚烷基-NRR’、(C1-C6)亚烷基-CO2R、(C1-C6)亚烷基-CONRR’、-O-(C1-C6)亚烷基-CO2R、-O-(C1-C6)亚烷基-CONRR’、CO2-(C1-C6)亚烷基-OR、CO2-(C1-C6)亚烷基-NRR’、CONH-(C1-C6)亚烷基-OR、CONH-(C1-C6)亚烷基-NRR’、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR’、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C＝C(R11)2、(C1-C6)亚烷基-COR、NHCOR、或被至少一个杂原子间断的(C1-C6)烷基组成的组，所述杂原子优选地选自O、N或S，优选O；
·L1是任选地被＝O、CN、C(O)R、C(O)OR、或C(O)NRR’中的一种或多种取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基、或直链或支链CH2(C1-C6)亚烷基，其中后一种(C1-C6)亚烷基任选地被卤素、OR、NRR’或CF3中的一种或多种取代；
·q是0、1、2、3或4；
·X’是CR7；
·R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR；
·n是0、1或2；
·p是1、2或3；
·R3、R4、R8’和R8各自是相同的或不同的，R3、R4、R8’和R8选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组；
·A选自由以下组成的组：
--C(O)-；
--C(O)NH-；
-SO2-；或
-SO2N-；
·L2是直链或支链(C1-C6)亚烷基-O或任选地被选自O、NR或S的至少一个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基和/或任选地被：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基；
·R6选自由芳基、杂芳基、环烷基、杂环、H组成的组，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环是单环的或多环的，且任选地被直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、OR、＝O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直链或支链(C2-C6)亚烯基或C(O)NRR’中的一种或多种取代；
·每一个R和R’是相同的或不同的，每一个R和R’独立地选自H、直链或支链(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳族或非芳族杂环、直链或支链-(C1-C6)烷基-芳基或直链或支链-(C1-C6)烷基-杂环，其中所述杂环是芳族或非芳族；任选地被或不被OH、CO2H、C(O)NH2、NH2取代；
·R9选自由-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR’、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2、或它们的离子化形式组成的组；
·R10独立地选自键、直链或支链(C1-C6)烷基；
·R11独立地选自氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基，所
述烷基或芳基任选地被OH、NH2、C(O)OH或C(O)NH取代；
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体，
除了下列以外
-q是0，L1是CH2，X’是CR7且R7是OH，i是1，A是C＝O，L2是C2H4且R6是
-q是1，R1是7位的Cl，L1是CH2，X’是CR7且R7是OH，i是1，A是C＝O，L2R6是CH(CH2CH3)2。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A是C＝O。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R7是OR、OR9、NRR’或SR。
4.根据权利要求1至2所述的化合物，其中R7是OH或OR9。
5.根据权利要求1至2所述的化合物，其中R7是OH。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’或NHC(O)R组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OH或直链或支链-O-(C1-C6)烷基组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中R3、R4、R8、R8'各自是相同的或不同的，R3、R4、R8、R8'各自选自由H、-O-(C1-C6)烷基、OH组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中L2是直链或支链C1-C6(亚烷基)或直链或支链-[C1-C6(亚烷基)]-O-。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中R6选自由芳基、杂芳基、环烷基或H组成的组，其中所述芳基、杂芳基或环烷基任选地被卤素、直链或支链O-(C1-C6)烷基取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中p+n＝4。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中p是2且n是2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中L1是CH2。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，选自由下列组成的组：
3-({4-羟基-1-[3-(2-甲氧基苯基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({1-[2-(3-氟苯氧基)乙酰基]-4-羟基哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-6，7-二甲氧基-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
4-羟基-1-([2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({4-羟基-1-[3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-7-氯-3，4-二氢喹唑啉-4-酮或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
15.-一种用于制备根据权利要求1至14的化合物的方法，包括式(II)化合物与式(III)化合物反应
其中R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X’、A、q、n和i是如在权利要求1至13中任一项所定义的，Y是离去基团。
16.-一种用于制备根据权利要求1至14的化合物的方法，包括式(IV)化合物与式(V)化合物反应
其中R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n和i是如在权利要求1至13中任一项所定义的，Y是选自环氧基、卤素、活化OH的离去基团。
17.一种药物组合物，其包含式(I’)化合物
其中
·每一个R1是相同的或不同的，R1选自由卤素、R、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、NO2、(C1-C6)亚烷基-OR、(C1-C6)亚烷基-NRR’、(C1-C6)亚烷基-CO2R、(C1-C6)亚烷基-CONRR’、-O-(C1-C6)亚烷基-CO2R、-O-(C1-C6)亚烷基-CONRR’、CO2-(C1-C6)亚烷基-OR、CO2-(C1-C6)亚烷基-NRR’、C(O)NH-(C1-C6)亚烷基-OR、CONH-(C1-C6)亚烷基-NRR’、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR’、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C＝C(R11)2、(C1-C6)亚烷基-COR、NHCOR、或被至少一个杂原子间断的(C1-C6)烷基组成的组，所述杂原子优选地选自O、N或S，优选O；
·L1是任选地被＝O、CN、C(O)R、C(O)OR、或C(O)NRR’中的一种或多种取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基、或直链或支链CH2(C1-C6)亚烷基，其中后一种(C1-C6)亚烷基任选地被卤素、OR、NRR’或CF3中的一种或多种取代；
·q是0、1、2、3或4；
·X’是CR7；
·R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR；
·n是0、1或2；
·p是1、2或3；
·R3、R4、R8'和R8各自是相同的或不同的，R3、R4、R8'和R8选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组；
·A选自由以下组成的组：
--C(O)-；
--C(O)NH-；
-SO2-；或
-SO2N-；
·L2是任选地被选自O、NR或S的至少一个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基和/或任选地被：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基；
·R6选自由芳基、杂芳基、环烷基、杂环、H组成的组，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环是单环的或多环的，且任选地被直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、OR、＝O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直链或支链(C2-C6)亚烯基或C(O)NRR’中的一种或多种取代；
·每一个R和R’是相同的或不同的，每一个R和R’独立地选自H、直链或支链(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳族或非芳族杂环、直链或支链-(C1-C6)烷基-芳基或直链或支链-(C1-C6)烷基-杂环，其中所述杂环是芳族或非芳族；任选地被或不被OH、CO2H、C(O)NH2、NH2取代；
·R9选自由-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR’、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2、或其离子化形式组成的组；
·R10独立地选自键、直链或支链(C1-C6)烷基；
·R11独立地选自氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基，所
述烷基或芳基任选地被OH、NH2、C(O)OH或C(O)NH取代；
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体，
与药学上可接受的赋形剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中L2是直链或支链(C1-C6)亚烷基-O或任选地被选自O、NR或S的至少一个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基和/或任选地被：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的药物组合物，其中R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n如在权利要求2至13中任一项所定义的。
20.根据权利要求17至19所述的药物组合物，其中式(I’)化合物选自由下列组成的组：
3-({4-羟基-1-[3-(2-甲氧基苯基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[1-(2-乙基丁酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({1-[2-(3-氟苯氧基)乙酰基]-4-羟基哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-6,7-二甲氧基-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
4-羟基-1-([2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({4-羟基-1-[3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3,4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-7-氯-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
21.如权利要求17至20中任一项所定义的式(I’)化合物用于抑制去泛素化酶的用途。
22.根据权利要求21的使用的用途，所述用途为抑制USP7(泛素特异性蛋白酶7)/HAUSP(疱疹相关泛素特异性蛋白酶)。
23.根据权利要求17至20中任一项所述的化合物，用于治疗和/或预防癌症及转移、神经退行性疾病、如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、免疫疾病、糖尿病、骨和关节疾病、骨质疏松症、关节炎的炎性病症、心血管疾病、病毒感染和疾病、和/或病毒传染和/或潜伏、细菌感染和疾病。
24.根据权利要求22所述的化合物的用途，其中所述病毒感染和疾病选自单纯疱疹-1或-2病毒感染、甲型肝炎、丙型肝炎、SARS冠状病毒感染和疾病、EB病毒、鼻病毒感染和疾病、腺病毒感染和疾病、脊髓灰质炎。
25.一种组合，其包含如权利要求17至20中任一项所定义的式(I’)化合物和一种或多种活性剂，所述一种或多种活性剂选自抗癌剂、神经学剂、血栓溶解剂、抗氧化剂、抗糖尿病剂、抗感染剂、抗高血压剂、利尿剂、血栓溶解剂、免疫抑制剂、心血管剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗菌剂。

Claims (22)

1.-一种式(I’)化合物：
其中
·每一个R1是相同的或不同的，R1选自由卤素、R、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’、NO2、(C1-C6)亚烷基-OR、(C1-C6)亚烷基-NRR’、(C1-C6)亚烷基-CO2R、(C1-C6)亚烷基-CONRR’、-O-(C1-C6)亚烷基-CO2R、-O-(C1-C6)亚烷基-CONRR’、CO2-(C1-C6)亚烷基-OR、CO2-(C1-C6)亚烷基-NRR’、CONH-(C1-C6)亚烷基-OR、CONH-(C1-C6)亚烷基-NRR’、OCF3、SO2R、SO3H、SO2NRR’、NHSO2R、R10C≡CR11、(R10)(R11)C＝C(R11)2、(C1-C6)亚烷基-COR、NHCOR、或被至少一个杂原子间断的(C1-C6)烷基组成的组，所述杂原子优选地选自O、N或S，优选O；
·L1是任选地被＝O、CN、C(O)R、C(O)OR、或C(O)NRR’中的一种或多种取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基、或直链或支链CH2(C1-C6)亚烷基，其中后一种(C1-C6)亚烷基任选地被卤素、OR、NRR’或CF3中的一种或多种取代；
·q是0、1、2、3或4；
·X’是CR7；
·R7是OR、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基-OR、C(O)OR、C(O)NRR’、CN、OR9、NRR’或SR；
·n是0、1或2；
·p是1、2或3；
·R3、R4、R8’和R8各自是相同的或不同的，R3、R4、R8’和R8选自由H、直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OH、-O-(C1-C6)烷基、NRR’、CN、CF3、OR、C(O)R、C(O)OR或C(O)NRR’组成的组；
·A选自由以下组成的组：
--C(O)-；
--C(O)NH-；
-SO2-；或
-SO2N-；
·L2是直链或支链(C1-C6)亚烷基-O或任选地被选自O、NR或S的至少-个杂原子间断的直链或支链(C1-C6)亚烷基和/或任选地被：R、OR、NRR’、(C1-C6)烷基-OR、(C1-C6)烷基-NRR’、OC(O)R、NHC(O)R、NHC(O)NRR’、CN、C(＝NH)NHOR取代的直链或支链(C1-C6)亚烷基；
·R6选自由芳基、杂芳基、环烷基、杂环、H组成的组，其中所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环是单环的或多环的，且任选地被直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、NRR’、CN、CF3、OR、＝O、C(O)R、C(O)OR、NHC(O)R、OC(O)R、直链或支链(C2-C6)亚烯基或C(O)NRR’中的一种或多种取代；
·每一个R和R’是相同的或不同的，每一个R和R’独立地选自H、直链或支链(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳族或非芳族杂环、直链或支链-(C1-C6)烷基-芳基或直链或支链-(C1-C6)烷基-杂环，其中所述杂环是芳族或非芳族；任选地被或不被OH、CO2H、C(O)NH2、NH2取代；
·R9选自由-C(O)R、-C(O)NHR、-C(O)OR、-C(O)CH2-NRR’、-C(O)-CH2-CH2-CO2R、-C(O)-CH2-SO3H、-C(O)-(C5H4N)、-PO3H2、或它们的离子化形式组成的组；
·R10独立地选自键、直链或支链(C1-C6)烷基；
·R11独立地选自氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基，所述烷基或芳基任选地被OH、NH2、C(O)OH或C(O)NH取代；
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A是C＝O。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R7是OR、OR9、NRR’或SR。
4.根据权利要求1至2所述的化合物，其中R7是OH或OR9。
5.根据权利要求1至2所述的化合物，其中R7是OH。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链(C1-C6)烷基、卤素、OR、NRR’、CN、CF3、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’或NHC(O)R组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中每一个R1是相同的或不同的，R1选自由直链或支链C1-C6(烷基)、卤素、OH或直链或支链-O-(C1-C6)烷基组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中R3、R4、R8、R8'各自是相同的或不同的，R3、R4、R8、R8'各自选自由H、-O-(C1-C6)烷基、OH组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中L2是直链或支链C1-C6(亚烷基)或直链或支链-[C1-C6(亚烷基)]-O-。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中R6选自由芳基、杂芳基、环烷基或H组成的组，其中所述芳基、杂芳基或环烷基任选地被卤素、直链或支链O-(C1-C6)烷基取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中p+n＝4。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中p是2且n是2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中L1是CH2。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，选自由下列组成的组：
3-({4-羟基-1-[3-(2-甲氧基苯基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[1-(2-乙基丁酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({1-[2-(3-氟苯氧基)乙酰基]-4-羟基哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-6，7-二甲氧基-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(2-甲基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(3-环戊基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[4-羟基-1-(3-苯基丙酰基)哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
7-氯-3-({4-羟基-1-[2-甲基-3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-({4-羟基-1-[3-(噻吩-2-基)丙酰基]哌啶-4-基}甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
3-{[1-(2-苄基丙酰基)-4-羟基哌啶-4-基]甲基}-7-氯-3，4-二氢喹唑啉-4-酮
或它们的药学上可接受的盐或它们的光学异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
15.-一种用于制备根据权利要求1至14的化合物的方法，包括式(II)化合物与式(III)化合物反应
其中R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X’、A、q、n和i是如在权利要求1至13中任一项所定义的，Y是离去基团。
16.-一种用于制备根据权利要求1至14的化合物的方法，包括式(IV)化合物与式(V)化合物反应
其中R1、R8、R3、R4、R5、R6、L1、L2、X、q、n和i是如权利要求1至13中任一项所定义的，Y是选自环氧基、卤素、活化OH的离去基团。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至14的式(I)化合物与药学上可接受的赋形剂。
18.如权利要求1至14中任一项所定义的式(I)化合物用于抑制去泛素化酶的用途。
19.根据权利要求18的使用的用途，所述用途为抑制USP7(泛素特异性蛋白酶7)/HAUSP(疱疹相关泛素特异性蛋白酶)。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，用于治疗和/或预防癌症及转移、神经退行性疾病、如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、免疫疾病、糖尿病、骨和关节疾病、骨质疏松症、关节炎的炎性病症、心血管疾病、病毒感染和疾病、和/或病毒传染和/或潜伏、细菌感染和疾病。
21.根据权利要求20所述的化合物的用途，其中所述病毒感染和疾病选自单纯疱疹-1或-2病毒感染、甲型肝炎、丙型肝炎、SARS冠状病毒感染和疾病、EB病毒、鼻病毒感染和疾病、腺病毒感染和疾病、脊髓灰质炎。
22.一种组合，其包含如权利要求1至14中任一项所定义的式(I)化合物和一种或多种活性剂，所述一种或多种活性剂选自抗癌剂、神经学剂、血栓溶解剂、抗氧化剂、抗糖尿病剂、抗感染剂、抗高血压剂、利尿剂、血栓溶解剂、免疫抑制剂、心血管剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗菌剂。
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