CN103926398B - 一种免疫磁珠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种免疫磁珠的制备方法，首先取冷冻干燥过的硅基磁珠分散到极性有机溶剂中超声处理后，加入溶解于该极性有机溶剂中的分散剂，搅拌后，滴加溶解于该极性有机溶剂的带有双端羧基的有机小分子，滴加完毕后反应6~18h；反应结束后，磁分离出羧基磁珠，依次用无水乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液pH值为6～7，超声处理15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到羧基磁珠；羧基磁珠用MES缓冲液清洗至少一次，重悬羧基磁珠于MES缓冲液中，通过活化剂碳二亚胺将磁珠活化后，在MES缓冲液环境中偶联抗体。本发明工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，特别是涉及一种免疫磁珠的制备方法。
背景技术
目前，免疫检测和免疫诊断使用的方法是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗原或抗体）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但是，目前所用的固相载体存在问题有：批间差异不易控制，包***作繁复，自动化程度不高，不适宜大批量样本的操作。
免疫磁珠是由作为载体的磁性微球和免疫配基结合而成的纳米级材料。磁性微球载体通常是带有氨基、羧基、羟基或巯基等化学官能团的磁珠，该官能团与不同的免疫配基如活性蛋白、抗体、抗原、亲和素、生物素等结合形成免疫磁珠。磁性微球载体具有超顺磁性特点，可使免疫磁珠置于磁场时，显示其磁性，从磁场移出时，磁性消除，免疫磁珠重新分散。
包被抗体的免疫磁珠作为固相载体，其上的抗体与相应抗原发生特异性结合形成抗原-抗体-磁珠复合物，这种复合物在磁场作用下，迅速向磁场移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性抗原的目的，这种分离方法具有检测速度快、特异性高、灵敏度高、重复性好等优点。免疫磁珠的磁分离方法还可借助亲和素-生物素***的生物放大作用进行更深入的应用。免疫磁珠的磁分离方法可重复性好，操作简单，不需要昂贵的仪器设备，不影响被分离生物材料的生物学性状和功能；并且由于磁珠特殊的性能，可以将免疫检测实现自动化，用于大规模样本的检测，其反应动力学较传统免疫检测方法快，并且具有更大的固相结合表面。
纳米Fe3O4由于制备简单、稳定性高、较强的超顺磁性、生物相容性和表面易于修饰等特点，成为目前应用最广泛的磁珠材料之一。但是，由于纳米Fe3O4的小尺寸效应、磁偶极子引力等作用，磁性纳米粒子易于团聚，且化学稳定性不高易受氧化，表面羟基不足，导致其难以直接应用到生物领域。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种免疫磁珠的制备方法，其工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种免疫磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
S1、羧基磁珠的制备
取冷冻干燥过的硅基磁珠2~100 g分散到0.2~3L极性有机溶剂中超声处理30～60min后，加入溶解于该极性有机溶剂中的分散剂10～100ml，分散剂浓度为10～50g/L，搅拌30~60min后，滴加溶解于该极性有机溶剂的带有双端羧基的有机小分子30～500ml，带有双端羧基的有机小分子浓度为4~20g/L，控制滴加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为60～80℃，滴加完毕后反应6~18h；反应结束后，磁分离出羧基磁珠，依次用无水乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液pH值为6～7，超声处理15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到羧基磁珠；
S2、免疫磁珠的制备
上述步骤S1中所得的羧基磁珠用MES缓冲液清洗至少一次，重悬（1～20）mg羧基磁珠于200μl MES缓冲液中，通过活化剂碳二亚胺将磁珠活化后，在MES缓冲液环境中偶联抗体，羧基磁珠与活化剂碳二亚胺按照（4～10）：1的体积比。
上述免疫磁珠的制备方法中，步骤S1中采用的硅基磁珠为本申请人的专利申请“一种核酸提取磁珠的制备方法及应用”（申请号：201410125272.4、申请日：2014年3月31日）中的硅基磁珠。此硅基磁珠为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，SiO2外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm ~1μm，饱和磁化强度为43.0～74.5emu/g。
此硅基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
（1）、Fe3O4纳米颗粒的制备
分别配制浓度为0.1～1mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5～2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10~1/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60～70℃，再向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10～11，在温度为70～80℃条件下反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100～300nm，饱和磁化强度较高为57.4～79.4 emu/g；
（2）、纳米硅基磁珠的制备
将步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2～500g分散到0.1～3L无水乙醇中超声波处理30～60min后，加入20～1000ml浓度为10～50g/L的分散剂，搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25％氨水至体系PH值为10，再滴加0.25～500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为30～50℃，滴加完毕后反应3～5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6～7，超声分散15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
进一步地，上述步骤（1）中采用的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。
此硅基磁珠，无外加磁场时，呈黑色悬浮液状态，放置有永磁铁时，核酸提取磁珠能够与水快速分离。
上述免疫磁珠的制备方法中，步骤S1中采用的极性有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一种。
上述免疫磁珠的制备方法中，步骤S1中采用的分散剂为柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一种。
上述免疫磁珠的制备方法中，步骤S1中采用的带有双端羧基的有机小分子为1,4-丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一种。
上述免疫磁珠的制备方法中，步骤S2的具体方法是：
S2-1、活化磁珠：取羧基磁珠于离心管中，震荡30～60min；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0 的MES溶液洗涤羧基磁珠，重复洗涤一次；用100μL 浓度为15mmol/L、PH 6.0 的MES重悬磁珠，再加入100μL浓度为10mg/ml的碳二亚胺溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡孵育30～60min，将磁珠活化；
S2-2、包被磁珠：用1ml浓度为15mmol/L、PH 6.0的MES洗涤活化后的磁珠数次，将抗体加入500μl浓度为15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混匀，在室温条件下震荡孵育24h，得到免疫磁珠；
S2-3、免疫磁珠活性检测
取100μL浓度为10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗涤三次，加入500μL 按1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育30min，用PBST洗涤四次，加入显色液100μL，待显色完全后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪检测试验结果。
上述免疫磁珠的制备方法，其制得的羧基磁珠为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面的SiO2中间层，SiO2层外键合带有双端羧基的有机小分子；10mg羧基磁珠分散在100ml无水乙醇中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为500nm~1.2μm，饱和磁化强度为41.0～77.4emu/g。
上述免疫磁珠的制备方法，其制得的羧基磁珠，无外加磁场时，呈黑色悬浮液状态，放置有永磁铁时，羧基磁珠能够与水快速分离。
一种免疫磁珠的应用方法，免疫磁珠利用酶联免疫吸附法进行病原检测。
上述免疫磁珠应用于人体、动物、食品、化妆品、饲料和临床样本检验中。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
本发明免疫磁珠的制备方法，其在硅基磁珠表面化学偶联羧基小分子，工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产；制得的羧基磁珠，饱和磁化强度较高为41.0～77.4emu/g，剩磁和矫顽力接近于零，能够在较小的磁场作用下达到快速彻底的固液分离效果，当撤去外加磁场后又能很快到分散到溶液中；采用的硅基磁珠通过在Fe3O4纳米颗粒外表面包覆SiO2壳层，能很大程度地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的互相作用，使粒子具有良好的水溶性、化学稳定性及生物相容性，且SiO2表面存在丰富的羟基，可使复合粒子容易进一步生物功能化；在极性有机溶剂条件下加入带有双端羧基的有机小分子，该分子一端羧基与硅基磁珠的表面键合，另一端裸露在外部，形成了羧基磁珠；羧基磁珠能够与蛋白特异性结合，经验证磁珠法酶联免疫吸附实验操作简便，灵敏度高，背景值低。
本发明免疫磁珠的制备方法，其制得的免疫磁珠具有高的表面质量比，可以结合更多的抗体参加免疫反应；免疫磁珠表面通过共价键结合抗体，较物理吸附更坚固；免疫磁珠由于粒径很小，在温育过程中，均匀分散在反应液中，近似于均相反应，反应迅速、高均一性；免疫磁珠超顺磁性在后期洗涤分离过程中更利于全自动仪器应用。
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例一
S1、硅基磁珠的制备
称取无水三氯化铁300g溶解于1L超纯水中，称取六水硫酸亚铁铵392g溶解于1L超纯水中，把两种溶液转入5L反应釜中200r/min搅拌30min后，称取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超纯水中转入反应釜；通氩气除氧30min，调整反应温度为60℃，调整转速为500r/min，向溶液中滴加25％氨水至体系pH值为11,升温至80℃，调整转速为100r/min条件下反应3h；反应完毕后冷却至室温，停止搅拌关闭氩气，取出反应物，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物3次至洗涤液为中性，-10℃冷冻干燥48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
称取超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100g分散到3L无水乙醇中，超声处理30min后，加入1L浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25％氨水至体系pH值为10；再滴加体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为50℃，滴加完毕后反应3h；取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
S2、羧基磁珠的制备
取冷冻干燥过的硅基磁珠2g分散到200ml四氢呋喃中超声处理30min后，加入10ml浓度为20g/L的聚乙二醇-1000的四氢呋喃溶液， 500r/min搅拌30min后，滴加溶解于四氢呋喃中的1,4-丁二酸溶液30ml其浓度为4g/L，控制滴加速度为0.1ml/min，体系温度为60℃，滴加完毕后反应6h；反应结束后，磁分离用无水乙醇及去离子水依次洗涤数次至洗涤液pH值为6，超声处理30min，分散在万分之二NaN3水中，调整其浓度为10mg/ml，即得到羧基磁珠；
S3、羧基磁珠偶联人IgG
S3-1、活化磁珠：取1ml羧基磁珠于离心管中，在样品混合仪上震荡30min；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0 的MES溶液洗涤羧基磁珠，重复洗涤一次；用100μL 浓度为15mmol/L、PH 6.0 的MES重悬磁珠，再加入100μL浓度为10mg/ml的碳二亚胺溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡孵育30～60min，将磁珠活化；
S3-2、包被磁珠：用1ml浓度为15mmol/L、PH 6.0的MES洗涤活化后的磁珠2遍，将400μg人IgG加入500μl浓度为15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混匀，在室温条件下震荡孵育24h，制成人IgG免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性检测
取100μL浓度为10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗涤三次，加入500μL 按1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育30min，用PBST洗涤四次，加入显色液100μL，待显色完全后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪检测试验结果。
实施例二
S1、硅基磁珠的制备
与实施例一中步骤S1相同；
S2、羧基磁珠的制备
取冷冻干燥过的硅基磁珠10 g分散到700ml N,N-二甲基甲酰胺溶液中超声处理60min后，加入20ml浓度为50g/L的柠檬酸三钠的N,N-二甲基甲酰胺溶液，500r/min搅拌30min后，滴加溶解于N,N-二甲基甲酰胺中的顺丁烯二酸溶液100ml其浓度为10g/L，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为60℃，滴加完毕后反应10h；反应结束后，磁分离用无水乙醇及去离子水依次洗涤数次至洗涤液pH值为6，超声处理30min，分散在万分之二NaN3水中，调整其浓度为10mg/ml，即得到羧基磁珠；
S3、羧基磁珠偶联甲胎蛋白
S3-1、活化磁珠：取1ml羧基磁珠于离心管中，在样品混合仪上震荡30min；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0 的MES溶液洗涤羧基磁珠，重复洗涤一次；用100μL 浓度为15mmol/L、PH 6.0 的MES重悬磁珠，再加入100μL浓度为10mg/ml的碳二亚胺溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡孵育30～60min，将磁珠活化；
S3-2、包被磁珠：用1ml浓度为15mmol/L、PH 6.0的MES洗涤活化后的磁珠2遍，将400μg甲胎蛋白加入500μl浓度为15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混匀，在室温条件下震荡孵育24h，得到免疫磁珠；用PBS洗涤3次，磁分离，将共价鍵结合配体的磁珠分散于PBS中，4 ℃保存备用；
S3-3、免疫磁珠活性检测
取100μL浓度为10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗涤三次，加入500μL 按1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育30min，用PBST洗涤四次，加入显色液100μL，待显色完全后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪检测试验结果。
实施例三
S1、硅基磁珠的制备
与实施例一中步骤S1相同；
S2、羧基磁珠的制备
取冷冻干燥过的硅基磁珠100 g分散到3L N,N-二甲基甲酰胺溶液中超声处理60min后，加入100ml浓度为50g/L的柠檬酸三钠的N,N-二甲基甲酰胺溶液，500r/min搅拌30min后，滴加溶解于N,N-二甲基甲酰胺中的顺丁烯二酸溶液500ml其浓度为5g/L，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为60℃，滴加完毕后反应18h；反应结束后，磁分离用无水乙醇及去离子水依次洗涤数次至洗涤液pH值为6，超声处理30min，分散在万分之二NaN3水中，调整其浓度为10mg/ml，即得到羧基磁珠；
S3、羧基磁珠偶联甲肝抗原
S3-1、活化磁珠：取1ml羧基磁珠于离心管中，在样品混合仪上震荡30min；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0 的MES溶液洗涤羧基磁珠，重复洗涤一次；用100μL 浓度为15mmol/L、PH 6.0 的MES重悬磁珠，再加入100μL浓度为10mg/ml的碳二亚胺溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡孵育30～60min，将磁珠活化；
S3-2、包被磁珠：用1ml浓度为15mmol/L、PH 6.0的MES洗涤活化后的磁珠2遍，将400μg甲肝抗原加入500μl浓度为15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混匀，在室温条件下震荡孵育24h，得到免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性检测
取100μL浓度为10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗涤三次，加入500μL 按1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育30min，用PBST洗涤四次，加入显色液100μL，待显色完全后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪检测试验结果。
免疫磁珠活性检测结果：
| 免疫磁珠项目 | 背景值 | 样品 |
| 人IgG磁珠 | 0.005 | 2.303 |
| 甲胎蛋白磁珠 | 0.002 | 1.943 |
| 甲肝抗原磁珠 | 0.019 | 1.841 |
抗体和磁珠偶联后仍具有很高的活性，并且磁珠对活性检测的干扰影响很小。
Claims (8)
1.一种免疫磁珠的制备方法，其特征是：其包括以下步骤：
S1、羧基磁珠的制备
取冷冻干燥过的硅基磁珠2~100 g分散到0.2~3L极性有机溶剂中超声处理30～60min后，加入溶解于该极性有机溶剂中的分散剂10～100ml，分散剂浓度为10～50g/L，搅拌30~60min后，滴加溶解于该极性有机溶剂的带有双端羧基的有机小分子30～500ml，带有双端羧基的有机小分子浓度为4~20g/L，控制滴加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为60～80℃，滴加完毕后反应6~18h；反应结束后，磁分离出羧基磁珠，依次用无水乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液pH值为6～7，超声处理15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到羧基磁珠；其中，采用的硅基磁珠为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，SiO2外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm ~1μm，饱和磁化强度为43.0～74.5emu/g；
S2、免疫磁珠的制备
上述步骤S1中所得的羧基磁珠用MES缓冲液清洗至少一次，重悬（1～20）mg羧基磁珠于200μl MES缓冲液中，通过活化剂碳二亚胺将磁珠活化后，在MES缓冲液环境中偶联抗体，羧基磁珠与活化剂碳二亚胺按照（4～10）：1的体积比。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：硅基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
（1）、Fe3O4纳米颗粒的制备
分别配制浓度为0.1～1mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5～2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10~1/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60～70℃，再向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10～11，在温度为70～80℃条件下反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100～300nm，饱和磁化强度为57.4～79.4 emu/g；
（2）、纳米硅基磁珠的制备
将步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2～500g分散到0.1～3L无水乙醇中超声波处理30～60min后，加入20～1000ml浓度为10～50g/L的分散剂，搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25％氨水至体系PH值为10，再滴加0.25～500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为30～50℃，滴加完毕后反应3～5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6～7，超声分散15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：步骤S1中采用的极性有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：步骤S1中采用的分散剂为柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一种。
5.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：步骤S1中采用的带有双端羧基的有机小分子为1,4-丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一种。
6.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：步骤S2的具体方法是：
S2-1、活化磁珠：取羧基磁珠于离心管中，震荡30～60min；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0 的MES溶液洗涤羧基磁珠，重复洗涤一次；用100μL 浓度为15mmol/L、PH 6.0 的MES重悬磁珠，再加入100μL浓度为10mg/ml的碳二亚胺溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡孵育30～60min，将磁珠活化；
S2-2、包被磁珠：用1ml浓度为15mmol/L、PH 6.0的MES洗涤活化后的磁珠数次，将抗体加入500μl浓度为15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混匀，在室温条件下震荡孵育24h，得到免疫磁珠；
S2-3、免疫磁珠活性检测
取100μL浓度为10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗涤三次，加入500μL 按1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育30min，用PBST洗涤四次，加入显色液100μL，待显色完全后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪检测试验结果。
7.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征是：其制得的羧基磁珠为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面的SiO2中间层，SiO2层外键合带有双端羧基的有机小分子；10mg羧基磁珠分散在100ml无水乙醇中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为500nm~1.2μm，饱和磁化强度为41.0～77.4emu/g。
8.一种权利要求1～7中任一权利要求所述的方法制得的免疫磁珠应用于人体、动物、食品、化妆品、饲料和临床样本检验中。
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