CN103901143A

CN103901143A - 一种用于少量生物血清中四溴双酚a分析的前处理方法

Info

Publication number: CN103901143A
Application number: CN201410171617.XA
Authority: CN
Inventors: 于云江; 王琼; 孙朋; 向明灯; 李良忠
Original assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2014-04-28
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-04-28
Also published as: CN103901143B

Abstract

一种用于少量生物血清中四溴双酚A分析的前处理方法，涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，可为血清中四溴双酚A含量的测定提供前处理技术。样品加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，经细胞超声破碎仪超声提取血清中四溴双酚A，再用氯化钾溶液洗涤、无水硫酸钠干燥后，将提取液浓缩至恒重测定脂肪重量，样品复溶后经含氧化锆颗粒的Hybrid固相萃取小柱去除脂类杂质。样品经超高效液相色谱-串联质谱仪检测表明方法所需血清量较少，净化效果好，除脂效果优异，操作简单，回收率较高。该发明可以有效提取净化少量生物血清样品中四溴双酚A，为四溴双酚A环境与健康研究提供基础方法。

Description

一种用于少量生物血清中四溴双酚A分析的前处理方法

技术领域

本发明涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，特别是涉及分析一种少量生物血清中四溴双酚A含量的样品提取、净化方法。

背景技术

近年来，四溴双酚A作为使用量巨大的溴系阻燃剂之一被广泛应用于家用电器和日常用品中，如计算机、打印机、手机、电视机、洗衣机等电子产品以及纺织品、泡沫家具、建筑材料等。根据欧洲溴科学和环境论坛(BrominatedScience and Environmental Forum，BSEF)报告，除约旦、以色列、美国、日本等，我国也是四溴双酚A主要生产国。由于相关产品生产规模的不断增长、含四溴双酚A电子废弃物的不断增加，以及可释放到环境中四溴双酚A数量的增加，使得人们开始关注四溴双酚A潜在的环境污染问题和对人体健康的影响。

调查显示，由于四溴双酚A使用广泛，世界上很多国家和地区的土壤、沉积物、水体和大气等多种环境介质以及生物样品中均检测到四溴双酚A的赋存，且含量较高。由于频繁在环境介质及生物介质中检测出四溴双酚A，使得公众对四溴双酚A的生物毒性倍加关注。目前研究发现四溴双酚A及其代谢产物在生物体反复暴露的情况下具有潜在的生物蓄积性，及细胞、免疫和内分泌干扰等生物毒性。近年来，四溴双酚A被认为是一种值得探讨和关注的潜在内分泌干扰物，也有研究认为四溴双酚A具有潜在环境持久性和生物累积性，可能引起持久性有机污染问题。欧洲保护东北大西洋海洋环境公约组织(OSPAR)自2001年将四溴双酚A纳入优化控制污染物后至今未将其取消，其报告中认为四溴双酚A具有持久性污染问题。基于此，开展四溴双酚A环境与健康方面的研究具有重要意义，特别是研究四溴双酚A在生物体血清中的浓度以及通过动物实验模拟四溴双酚A进入生物体后在血清中的分布规律对四溴双酚A的影响研究具有重要作用。

由于四溴双酚A在生物血清样品中浓度较低，且血清样本基质比较复杂，同时生物血清样品可采集量较小，因此对血清样品前处理技术的要求就变得更加严格。很多样品在分析前没有经过很好的提取以及净化处理，分析时不能准确反应生物血清中四溴双酚A浓度，或者由于基质效应较大影响回收率。因此前处理技术是分析样品中四溴双酚A含量技术的关键，并直接影响四溴双酚A环境健康效应的研究发展。

发明内容

本发明的目的是针对生物血清样品前处理复杂的问题提供一种样品用量少、回收率高、除杂效果好、准确迅速的提取与净化技术，减弱基质干扰作用，实现对少量生物血清样品中四溴双酚A的定量分析。本发明与现有技术的区别在于，采用细胞超声破碎的方式提取血清样品中四溴双酚A，采用含有氧化锆颗粒的固相萃取小柱去除血清中脂类杂质，保证了提取效率并避免复杂的净化步骤损失样品中四溴双酚A含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述。

一种适用于分析少量生物血清样品中四溴双酚A的前处理方法(图1)，包括以下步骤：

(1)准确移取血清，加入C13标记的四溴双酚A、稀盐酸以及异丙醇；

(2)加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，经细胞超声破碎仪超声提取；

(3)置离心机内低速离心5分钟，移出上层提取液；

(4)重复步骤(2)-(3)两次；

(5)合并三次提取液，转移入分液漏斗；

(6)加入氯化钾溶液充分震荡，静置后分别收集有机相与水相，重复三次；

(7)合并三次收集的水相，加入等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，充分震荡后，收集有机相；

(8)收集步骤(6)-(7)中产生的有机相，经无水硫酸钠干燥后，至旋转蒸发仪浓缩，转移到已知重量的玻璃离心管，氮气吹干至恒重；

(9)称重含样品的玻璃管，用重量法测定脂肪重量；

(10)称重后样品用甲醇复溶，经含有氧化锆颗粒的Hybrid固相萃取小柱去除脂类杂质，收集流出液体，氮吹仪浓缩至一定体积后，用0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。

该方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群。

本方法步骤(2)中细胞超声破碎仪超声强度为25％，超声4秒，停止3秒，共7分钟后移除提取液，重复三次。

本发明的优点和积极效果是：样品经细胞超声破碎仪超声萃取后，使用氯化钾洗涤提取液，为保证回收率采用有机溶剂反萃洗涤液，洗涤后提取液经无水硫酸钠干燥后浓缩至干称量脂肪重量，再用甲醇复溶后经含有氧化锆颗粒的Hybrid固相萃取小柱去除脂肪。血清样品中脂类杂质的去除是前处理程序中重要的一步，如果不能有效除尽，会影响检测结果并污染仪器。本方法所需血清量较少，净化效果好，除脂效果优异，操作简单，回收率较高，采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定，检出限为0.01ng/g fat，特别适用于少量生物血清样品中四溴双酚A含量的测定。

本前处理方法的加标回收率如表1所示。

表1本前处理方法的加标回收率

附图说明

图1为分析方法流程图；

图2为标准曲线图；

图3为血清样品不同提取方式的回收率比较图；

图4为血清样品不同净化除脂类杂质方式的回收率比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

(1)血清样品的前处理

准确移取血清，加入10ng C13标记的四溴双酚A、2mL6moL/L盐酸以及6mL异丙醇，加入20mL等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂，经细胞超声破碎仪超声提取，细胞超声破碎仪超声强度为25％，超声4秒，停止3秒，共7分钟，之后置离心机内以3000转每分钟的速度离心5分钟，移出上层提取液，重复三次；合并三次提取液，转移入分液漏斗，加入20mL质量浓度为1％的氯化钾，溶液充分震荡洗涤，静置后分别收集有机相与水相，重复三次；收集的水相部分加入20mL等体积混合的甲基叔丁基醚与正己烷试剂充分震荡反萃，静置后收集有机相；合并所有有机相用无水硫酸钠干燥，经旋转蒸发仪浓缩后，转移到已知重量的玻璃离心管，氮气吹干至恒重；称重含样品的玻璃管，用重量法测定脂肪重量；称重后样品用甲醇复溶，经含有氧化锆颗粒的Hybrid固相萃取小柱(美国Supelco公司)去除脂类杂质，收集流出液体，经氮吹仪浓缩至1mL后，用0.2μm PTFE过滤器(美国Pull公司)过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。

(2)利用超高效液相色谱-串联质谱分析四溴双酚A浓度

仪器型号：超高效液相色谱-串联质谱联用仪ACQUITY UPLC-MS/MS(美国Waters公司)，包括四元梯度液相色谱泵，高压二元梯度泵，以及Masslynx4.1工作站。

色谱条件：采用美国Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，500mm×2.1mm I.D)；柱温40℃；流速0.30mL/min；进样量10μL；流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；采用梯度洗脱，初始浓度为70％B，0～0.5min为70％B线性升高到100％B，0.5～2min为100％B，2min为瞬间降至70％B，2～3min为70％B，总体运行时间共计3min。

质谱条件：采用电喷雾负离子检测模式(ESI-)；毛细管电压为3.5kV；离子源温度为120℃；脱溶剂气为氮气(N₂)；锥孔反吹气流速为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流速为800L/h；碰撞室压力为3.8×10^-3mbar；质量分析器低端分辨率LM1为13.0，LM2为13.0；高端分辨率HM1为13.0V，HM2为13.0V；离子能量1为1.0，2为4.0；采用MRM多通道检测。

(3)标准曲线的绘制

取混合均匀的空白血清样品，按照步骤(1)中所述血清样品的前处理方法分别对样品进行处理。待处理结束后，用获得的空白血清样品配置系列基质四溴双酚A与C13标记的四溴双酚A标准曲线。以四溴双酚A对C13标记的四溴双酚A的峰面积比与浓度值做定量标准曲线(图2)，用以计算样品中分析物的量。

(4)样品浓度及回收率的测定

血清样品采集于实验用品系为Wistar的大鼠。将18只大鼠于实验动物房内适应性饲养一周，观察无异常后随机分为3组，分别为对照组、低剂量组、高剂量组。对照区大鼠不做处理，低剂量组大鼠每日上午8时经口灌胃给予10mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，高剂量组大鼠每日上午8时经口灌胃给予30mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，连续给药90天后，将大鼠麻醉，心脏穿刺取血。所需血液室温静置15分钟，3000转每分钟离心10分钟，分离上层血清，置于保温箱内迅速带回实验室，于-80℃低温冰箱内贮藏。之后按照步骤(1)对样品进行超声提取，提取液经氯化钾洗涤，并用有机溶剂反萃洗涤液，洗涤后提取液经无水硫酸钠干燥后浓缩至干称量脂肪重量，再用甲醇复溶后经美国色谱科的Hybrid固相萃取小柱去除脂类杂质。之后经超高效液相色谱-串联质谱仪检测，与步骤(3)中标准曲线对照获得血清中四溴双酚A的含量。以样品检测得到的四溴双酚A对C13标记的四溴双酚A的峰面积比代入步骤(3)中标准曲线中，求得的浓度即为样品中四溴双酚A的浓度。

同时，根据样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积与相同浓度标准曲线中C13标记的四溴双酚A的峰面积做对比，计算回收率。方法回收率按照下式进行计算：

R＝(A/A₀)×100％

R-回收率，％；

A-测定样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积；

A0-标准曲线中相同浓度下C13标记的四溴双酚A峰面积。

利用本发明检测经口暴露不同剂量四溴双酚A大鼠血清中四溴双酚A浓度，结果如表2所示。

表2实际血清样品中四溴双酚A浓度

剂量组	样品量n	四溴双酚A浓度(μg/g，fat)
			对照区	6	0.00±0.00
低剂量组	6	19.53±6.63
			高剂量组	6	38.11±22.56

Claims

1.一种用于少量生物血清中四溴双酚A分析的前处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，

(3)置离心机内低速离心5分钟，移出上层提取液；

(4)重复步骤(2)-(3)两次；

(5)合并三次提取液，转移入分液漏斗；

(9)称重含样品的玻璃管，用重量法测定脂肪重量；

2.如权利1要求所述的前处理方法，其特征在于：该方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群。

3.如权利1要求所述的前处理方法，其特征在于：步骤(2)中细胞超声破碎仪超声强度为25％，超声4秒，停止3秒，共7分钟后移出提取液，重复三次。