CN102401820A - 小麦中几种真菌毒素含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，是利用高效液相色谱串联质谱的方法检测小麦中的真菌毒素，检测中涉及的几种真菌毒素为DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN和T-2毒素，具体检测方法是：把小麦样品用粉碎机磨细，通过提取液获得粗提液；通过氨基柱获得净化后的毒素提取液；配制含量不同的混合毒素标准液；采用高效液相色谱串联质谱的方法检测毒素提取液中各种不同的真菌毒素；最后根据混合毒素标准液的检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN和T-2毒素的含量。

Description

小麦中几种真菌毒素含量的检测方法

技术领域

本发明属分析化学领域，具体涉及对小麦中多种毒素的检测方法，尤其是同时对小麦中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的检测方法。

背景技术

    小麦赤霉病是我国小麦产区重要的植物病害，不仅导致严重的产量损失，而且由于致病菌禾谷镰刀菌在谷物中产生许多真菌毒素，严重影响人畜健康。这类毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3Ac-DON、15Ac-DON、T-2以及玉米赤霉烯酮（ZEN）等。我国赤霉病的控制研究历经数十年，尽管在农药控制以及抗病育种方面都取得了重要成果，但是仍没有达到理想的控制效果，尤其在我国小麦主产区黄淮流域，小麦品种绝大部分对赤霉病表现敏感，病害流行威胁严重。最近十年，基于对镰刀菌单端孢霉烯族毒素代谢分子机理的解析，一些重要解毒素基因的转基因育种开始兴起，尤其在美国加拿大地区已取得重大进展。

    镰刀菌单端孢霉烯族毒素的生物合成代谢中，Tri101可以催化C-3羟基的乙酰化，减轻合成产物的毒性，以保护镰刀菌本身不被毒素抑制。研究表明，C-3羟基的乙酰化可以降低最终合成的毒素如DON和T-2毒性的100倍。而镰刀菌毒素生物合成途径中的最后一步，就是清除被保护的C-3结构，随即将具有毒性的毒素释放到菌体外。

国内外许多实验室已经从Fusarium  sporotrichoides，Fusarium graminearum 中分离到的Tri101基因，并***到小麦、水稻、烟草等植物中，表现出较好的毒素抗性。由于Tri101来自于产毒素镰刀菌，且毒素合成代谢复杂，转Tri101基因小麦是否会成为毒素产生的主体，或者病原菌在毒素合成主途径被控制后，是否会出现代谢旁路，甚至产生其他有毒物质？鉴于对这些因素的考虑，有必要对小麦中的各种不同毒素的产生及代谢情况进行***的检测和排查，以确保小麦食用安全性，而建立这样的检测方法也显得尤为重要。

目前的检测方法大多是针对样品中单一毒素的特性，采用免疫亲和柱的方法纯化样品，获得针对单一毒素的提取液，所以对于同一个样品中的多种毒素要进行多次不同方法的提取和不同的液相色谱检测才能获得同一样品中不同毒素的含量。

发明内容

本发明的目的在于：针对小麦中毒素产生过程中合成途径的改变，研究快速检测小麦中多种真菌毒素的定量检测方法，以确保小麦中相关毒素的含量在限定范围之内，为小麦的食用安全提供有效的保障。

本发明的目的是这样实现的：一种对小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，是利用高效液相色谱串联质谱的方法检测小麦中的真菌毒素，其特征在于：检测中涉及的几种真菌毒素为镰刀菌属的脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Ac-DON、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Ac-DON、玉米赤霉烯酮ZEN和T-2毒素，采用的毒素标准液为含有DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的混合毒素标准液，具体检测方法是：

a) 将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取10.00 g麦粉置于250 mL三角瓶中，加入50.0 mL的提取液，室温摇床200 r/min 振荡30分钟, 于室温6000 r/min离心5分钟，收集上清，得到粗提液；

b) 将氨基柱用3 mL的提取液进行预平衡，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即准确移入5.0 mL粗提液，用离心管收集过氨基柱的提取滤液，再用2 ml的提取液（乙腈+水，体积比为80：20）洗脱，收集洗脱的滤液，把提取滤液和洗脱的滤液合并，置于氮吹仪上，水浴温度50℃吹干，然后加入洗脱液，定容至5.0 mL，得到净化后的毒素提取液；

c) 混合毒素标准液的配制：把DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的标准品用洗脱液配置成7种毒素含量不同的混合毒素标准液，每个混合毒素标准液中的DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN毒素浓度相同，由高到低依次为1000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml和10 ng/ml， T-2毒素的浓度依次为50 ng/ml、25 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.0 ng/ml和0.5 ng/ml；

d) 采用高效液相色谱串联质谱的方法检测毒素提取液中各种不同的真菌毒素； 

e) 真菌毒素含量计算：根据混合毒素标准液的检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN和T-2毒素的含量。

在本发明中， b步骤中的氨基柱是Agilent公司生产的，规格为500 mg，6 mL。

在本发明中，a和b步骤中的提取液为乙腈+水，它们的体积比为80：20；b和C步骤中的洗脱液是甲醇+水，它们的体积比为20：80。

在本发明中，d步骤中高效液相色谱串联质谱的检测条件为：色谱柱为 SB-C18 柱250 ×4.6 mm, 5 μm；流动相：A：5 mmol/L乙酸铵溶液，B：甲醇，采用梯度洗脱，具体洗脱梯度为：

时间min	流速mL/min	A%	B%
				0	0.3	80	20
8	0.3	10	90
				13	0.3	10	90
13.01	0.3	80	20

柱温：30℃；进样量：2 ul； 质谱条件：电喷雾离子源正模式，毛细管电压4 KV，干燥气流量 10 L/min，雾化气压力40 psi，采用多反应监测模式采集，各种不同真菌毒素的质谱采集参数为：

本发明的优点在于：能同时测定小麦中DON、3Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素，与现有的检测方法一般只能针对样品中单一毒素进行检测，具有明显的技术优势。 

本发明的优点在于：用氨基柱去除粗提液中的杂质，采用乙腈+水（体积比为80：20）的提取液提取小麦样品中毒素，获得毒素粗提液，用液质连用的方法检测小麦中多种毒素的含量。 

本发明的优点在于：液相色谱的流动相通过梯度洗脱的方法，使得不同的毒素能够在不同的时间出峰，从而能够有效地分离各种不同毒素。质谱检测条件为：电喷雾离子源（ESI+），毛细管电压4KV，干燥气流量 10L/min，雾化气压力40 psi，多反应监测（MRM）模式采集样品。 

本发明的优点还在于：测定小麦中毒素含量准确、可靠。DON的出峰时间为3-7分钟左右，检出限为10 ng/g； 3-Ac-DON的出峰时间为7-10分钟，检出限为10 ng/g； 15-Ac-DON的出峰时间为7-10分钟，检出限为10 ng/g； ZEN的出峰时间为10-13分钟，检出限为 8 ng/g；T-2毒素的出峰时间为10-13分钟，检出限为0.5 ng/g。以上毒素的检出限较之国标的单一毒素检测方法均有所降低，灵敏度有所提高。

具体实施方式

    以下各实施例使用的小麦均为同一批次的生抗2号小麦样品。

实施例1

采用国家标准GB/T 23503-2009食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦样品中DON毒素的含量。

将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取25.00 g试样于100 mL容量瓶中，实验设五个重复，分别加入5.0 g聚乙二醇，用水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2 min，定量滤纸过滤后以玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液，移取2 mL过滤液加入到DON毒素免疫亲和柱中，以1滴/s的流速通过免疫亲和柱，用5 mLPBS和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，直至抽干小柱；

加入1.0 mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，用于DON毒素的液相色谱测定；

液相色谱条件：C18柱(250 ×4.6 mm, 5 μm)，流动相：甲醇+水（体积比为20：80），流速：0.8 mL/min，柱温：30℃，进样量：50 ul，检测波长：218 nm;

DON毒素含量计算：根据标准毒素检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中DON毒素的含量。

实施例2

采用国家标准GB/T 23501-2009 食品中T-2毒素的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦样品中T-2毒素的含量。

将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取25.00 g试样于100 mL容量瓶中，实验设五个重复，用提取液：甲醇+水（体积比为80：20）水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2 min，定量滤纸过滤，移取10.0 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液，量取10 mL过滤液加入到T-2毒素免疫亲和柱中，以1滴/s的流速通过免疫亲和柱，用10 mL的水淋洗免疫亲和柱，直至抽干小柱；

加入1.0 mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，将洗脱液在50℃下用氮气吹干，加入50μL 4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶液和50μL 1-蒽腈（1-AN）溶液，在涡旋混合器上混匀1 min.50℃反应15 min,在冰水中冷却10 min中后取出，50℃下氮气吹干，用1.0 mL乙腈+水（体积比为75：25）溶解，用于T-2毒素的液相色谱测定；

液相色谱条件：C18柱(250 ×4.6 mm, 5 μm)，流动相：乙腈+水（体积比为75：25），流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：20 uL，检测波长：激发波长381nm，发射波长470 nm；

T-2毒素含量计算：根据标准毒素检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中T-2毒素的含量。

实施例3

采用GB/T 23504-2009食品中玉米赤霉烯酮的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法检测小麦样品中ZEN毒素的含量。

将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取50.00 g试样于100 mL容量瓶中，实验设五个重复，加入5 g氯化钠，用提取液：乙腈+水（体积比为90：10）定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2 min，定量滤纸过滤，移取10.0 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀后用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液，量取10 mL过滤液加入到ZEN毒素免疫亲和柱中，依次用10 mLPBS清洗缓冲液和10 mL的水淋洗免疫亲和柱，直至抽干小柱；

加入1.0 mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，用甲醇定容至1 mL;

液相色谱条件：C18柱(250 ×4.6 mm, 5 μm)，流动相：乙腈+水+甲醇（体积比为46:46:8），流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：20 ul，检测波长：激发波长274 nm，发射波长440 nm.

ZEN毒素含量计算：根据标准毒素检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中ZEN毒素的含量。

实施例4

采用本专利同步检测小麦样品中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的含量。

将小麦样品用粉碎机粉碎过20目筛，称取10.00 g麦粉置于250 ml 三角瓶中，设5个重复，每个三角瓶里分别加入50.0 ml乙腈+水（体积比为80：20）的提取液，摇床200 r/min 振荡30分钟, 于室温6000 r/min离心5分钟，收集上清，得到粗提液；

将氨基柱（Agilent，500 mg，6 ml）用3 ml的提取液（乙腈+水，体积比为80：20）进行预平衡，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即准确移入5.0 ml粗提液，用离心管收集过氨基柱的提取滤液，再用2 ml的提取液（乙腈+水，体积比为80：20）洗脱，收集洗脱的滤液，把提取滤液和洗脱的滤液合并，置于氮吹仪上，水浴温度50℃吹干，然后加入洗脱液（甲醇+水，体积比为20：80），定容至5.0 ml，得到净化后的毒素提取液；

毒素标准液的配制：把DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2的标准品用洗脱液（甲醇+水，体积比为20：80）稀释，把DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的标准品用洗脱液配成配置成7个毒素含量不同的混合毒素标准液，每个混合毒素标准液中的DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN毒素浓度相同，在7个每个混合毒素标准液中，由高到低DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN毒素的浓度依次为1000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml和10 ng/ml， T-2毒素的浓度依次为50 ng/ml、25 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.0 ng/ml和0.5 ng/ml；

色谱条件： SB-C18 柱(250 ×4.6 mm, 5 μm)，流动相：A: 5 mmol/L乙酸铵溶液，B：甲醇，采用梯度洗脱，具体洗脱梯度见表1，柱温：30℃，进样量：2 ul；

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾离子源（ESI+），毛细管电压4KV，干燥气流量 10 L/min，雾化气压力40 psi，多反应监测（MRM）模式采集，各种不同真菌毒素的质谱采集参数见表2；

表2 不同真菌毒素的质谱采集参数

真菌毒素含量计算：根据标准毒素检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，分别计算出小麦中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的含量。

实施例5

鉴于申请人目前没有发现针对3-Ac-DON和15-Ac-DON毒素的检测标准，因此没有建立针对3-Ac-DON和15-Ac-DON毒素的检测模型，在比对中缺少单独检测的技术数据。

表3采用四种不同方法检测的毒素结果

注：“∕”表示没有此项结果

由表3可见，本发明测定小麦中毒素含量准确、可靠。本发明较之国标中的单一毒素检测方法的回收率都在95%-102%之间，没有太大差异，而在检测灵敏度发面却大大有所提高，DON较之国标灵敏度提高了50倍；T-2较之国标提高了20倍；ZEN较之国标也提高了2倍多，且能同时进行5种毒素的检测，效率大大提高。

Claims (4)

1.  一种小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，是利用高效液相色谱串联质谱的方法检测小麦中的真菌毒素，其特征在于：检测中涉及的几种真菌毒素为镰刀菌属的脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Ac-DON、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Ac-DON、玉米赤霉烯酮ZEN和T-2毒素，采用的毒素标准液为含有DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的混合毒素标准液，具体检测方法是：

a) 将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取10.00 g麦粉置于250 mL三角瓶中，加入50.0 mL的提取液，室温摇床200 r/min 振荡30分钟, 于室温6000 r/min离心5分钟，收集上清，得到粗提液；

b) 将氨基柱用3 mL的提取液进行预平衡，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即准确移入5.0 mL粗提液，用离心管收集过氨基柱的提取滤液，再用2 ml的提取液（乙腈+水，体积比为80：20）洗脱，收集洗脱的滤液，把提取滤液和洗脱的滤液合并，置于氮吹仪上，水浴温度50℃吹干，然后加入洗脱液，定容至5.0 mL，得到净化后的毒素提取液；

c) 混合毒素标准液的配制：把DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的标准品用洗脱液配置成7种毒素含量不同的混合毒素标准液，每个混合毒素标准液中的DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN毒素浓度相同，由高到低依次为1000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml和10 ng/ml， T-2毒素的浓度依次为50 ng/ml、25 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.0 ng/ml和0.5 ng/ml；

d) 采用高效液相色谱串联质谱的方法检测毒素提取液中各种不同的真菌毒素； 

e) 真菌毒素含量计算：根据混合毒素标准液的检测结果得出毒素浓度对于峰面积的回归方程，计算出小麦样品中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN和T-2毒素的含量。

2.按权利要求1所述的小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，其特征在于： b步骤中的氨基柱是Agilent公司生产的，规格为500 mg，6 mL。

3.根据权利要求1所述的小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，其特征在于：a和b步骤中的提取液为乙腈+水，它们的体积比为80：20；b和C步骤中的洗脱液是甲醇+水，它们的体积比为20：80。

4.根据权利要求1所述的小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，其特征在于：d步骤中高效液相色谱串联质谱的检测条件为：色谱柱为 SB-C18 柱250 ×4.6 mm, 5 μm；流动相：A：5 mmol/L乙酸铵溶液，B：甲醇，采用梯度洗脱，具体洗脱梯度为：

柱温：30℃；进样量：2 ul； 质谱条件：电喷雾离子源正模式，毛细管电压4 KV，干燥气流量 10 L/min，雾化气压力40 psi，采用多反应监测模式采集，各种不同真菌毒素的质谱采集参数为：

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