CN103898092A - 一种快速磁珠法提取植物组织基因组dna的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒及提取方法，包括LysisA液、LysisB液、LysisC液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。利用本发明试剂盒提取植物组织基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。DNA提取从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成，自动化程度高，提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测，转基因检测，物种鉴定，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、***进化等常用研究手段之一。纯化的DNA是用来进行PCR检测、基因测序的基础物质，尽管在不同样品（动物组织、微生物）中，DNA 是一个相对稳定的分子，但是对于植物组织来说， DNA 提取技术仍然是基于 DNA 扩增的检测技术的瓶颈，能否取得高质量的核酸DNA是后续分析技术成功与否的关键，提取方法的灵敏度、速度也将直接关系到后续试验的成败。对于一般的分析来说，好的制备技术应该是简便、安全、廉价，并且能保证DNA纯度和浓度。用于检测分析的DNA应具备一定的浓度、纯度、完整性。提取试剂和提取技术都可能对这些参数造成影响。
传统的核酸分离方法主要有化学法、抽提法、物理冷冻、煮沸法和和硅胶膜吸附，提取的步骤主要包含细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀，高速离心等过程，植物组织裂解步骤中，去污剂破坏细胞壁使蛋白-核酸复合物游离到溶液中，蛋白质和多糖结合CTAB或PVP从溶解DNA的液相中分离出来，SDS分离核蛋白和核酸，用酚和/或氯仿去除液相中有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如亲脂类分子、多糖、蛋白质，用醇洗涤后即可得到核酸DNA。硅胶膜吸附也可用来协助DNA的提取和纯化，裂解后，DNA结合盐酸胍－氢氧化物离液剂中的硅胶颗粒而沉淀，沉淀用醇洗涤，最后，沉淀用低浓度盐溶液溶解。这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、回收率低，且提取过程中使用酚、氯仿、异丙醇等有毒有害物质，影响人体健康。
磁珠分离纯化技术是近年来发展起来的新方法，是一种简单有效的核酸提纯方法，主要原理是在具有超顺磁性的磁核上均匀包被二氧化硅，二氧化硅连接能特异性吸附核酸的功能基团，在有特定盐如PEG8000等存在的样本裂解溶液中特异性地吸附目标核酸，随后通过分离磁珠达到分离提取核酸的目的。磁珠法克服了传统方法的缺点，具有简便、快捷、高效等特点，很容易实现自动化，因此，该方法已广泛应用于病毒、动物组织等的DNA和RNA的提取中，也出现了各种相应试剂盒。
植物细胞与动物细胞相比，除有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类物质，利用现有的磁珠法提取DNA试剂盒对植物组织的基因组DNA进行提取，所得产物的回收率和纯度都比较低，不能满足进一步实验的需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒，其特征在于：包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。
优选的，Lysis A液为1～2% CTAB， 0.1～0.2mol/L氯化钠，10～20mmol/L EDTA，80～ 120mmol/L Tris-HCL ，pH=7.5～ 8.5；Lysis B液为10～ 20%β-巯基乙醇；LysisC 液为10～30mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有10～20mmol/L氯化钠及0.01～0.05% NaN3 的水溶液按1：30～50的重量比组成；结合液为5～10% PEG8000（聚乙二醇8000），2～4M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5～1mol/L GITC，0.1～0.2mol/L氯化钠，5～10mmol/L EDTA，20～ 40mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.5～ 6.5；washing2液为5～10mmol/L EDTA，20～ 40mmol/L Tris-HCL ，0.1～0.2mol/L氯化钠， pH=5.5～ 6.5；洗脱液为0.5～1.5mmol/L EDTA，5～ 15mmol/L Tris-HCL，PH=7.5～8.5。
优选的，Lysis A液为1.6% CTAB， 0.12mol/L氯化钠，15mmol/L EDTA，80mmol/L Tris-HCL ，pH=7.8；Lysis B液为20%β-巯基乙醇；LysisC 液为20mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化钠及0.03% NaN3 的水溶液按1：35的重量比组成；结合液为10% PEG8000（聚乙二醇8000），3.5M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5mol/L GITC，0.14mol/L氯化钠，8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.8；washing2液为8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.14mol/L氯化钠， pH=5.8；洗脱液为0.1mmol/L EDTA，5mmol/L Tris-HCL，PH=8.2。
优选的，所述磁珠的直径为0.5～2μm。
本发明的一种技术方案为提供一种植物基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将25～100mg预处理后的新鲜植物组织加入到权利要求1所述的Lysis溶液（Lysis A : Lysis B : Lysis C=150～200 : 2 : 5）207μl中，60～70℃温浴15～30min；
2）12000r离心10min，取上清液100μl，加入权利要求1或4所述的结合液100～150μl和权利要求1或3所述的5μl磁珠悬液，混合均匀；
3）将磁珠转移到washing1液中清洗；
4）将磁珠转移到washing2液中清洗；
5）清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，得到纯化的DNA 。
优选的，步骤1）中，样品与Lysis液的质量体积比为25～100mg : 150～250μl。
优选的，步骤2）中，上清液与结合液的体积比为1 : 1～2。
优选的，步骤3）中，参与核酸提取的磁珠与washing1液的体积比为5～10 : 200~400 ，优选的，步骤4）中，参与核酸提取的磁珠与washing2液的体积比为5～10 : 400~600 。
优选的，步骤1）中，样品与Lysis液的质量体积比为30mg : 207μl；步骤2）中，上清液与结合液的体积比为1：1.5；步骤（3）中，参与核酸提取的磁珠与washing1液的体积比为5: 300 ；步骤4）中，参与核酸提取的磁珠与washing2液的体积比为5 : 500。
优选的，所述植物组织包括新鲜植物叶片、干植物叶片、大豆种子、小麦种子、玉米种子等。
本发明的有益效果在于：
1）利用本发明试剂盒提取的基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质，使用本试剂提取30mg干燥大豆、小麦、玉米叶片组织，分别纯化得到了约8μg、15μg和7μg的高纯度基因组DNA，纯度A260/280＝1.7-1.9之间。
2）本发明的DNA提取方法仅需4个步骤，分别是裂解、沉淀、清洗、洗脱，从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成，自动化程度高，实验过程中完全无需人工干预和检测，且提取所使用的试剂高效安全，最大程度的避免对人体的伤害。
附图说明
图l：不同方法提取大豆、小麦及玉米基因组DNA的PCR检测结果图；
其中：1-4：大豆；5-8：小麦；9-12：玉米。1、5、9本发明试剂盒3； 2、6、10索莱宝植物DNA提取试剂盒； 3、7、11金麦格植物DNA提取试剂盒； 4、8、12天根植物DNA提取试剂盒； M：Marker I 100，200，300，400，500，600
图2：本发明试剂盒3提取大豆、小麦、玉米结果图；
其中：1、2：大豆，3、4：小麦，5、6玉米，M：markerλDNA/Hind III 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒1，包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。
其中，Lysis A液为1% CTAB， 0.1mol/L氯化钠，10mmol/L EDTA，80mmol/L Tris-HCL ，pH=7.5；Lysis B液为10%β-巯基乙醇；LysisC 液为10mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有10mmol/L氯化钠及0.01% NaN3 的水溶液按1：30的重量比组成；结合液为5% PEG8000（聚乙二醇8000），2M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5mol/L GITC，0.1mol/L氯化钠，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.5；washing2液为5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL ，0.1mol/L氯化钠， pH=5.5；洗脱液为0.5mmol/L EDTA， 5mmol/L Tris-HCL，PH=7.5。
一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒2，包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。其中，Lysis A液为2% CTAB， 0.2mol/L氯化钠，20mmol/L EDTA，120mmol/L Tris-HCL ，pH= 8.5；Lysis B液 20%β-巯基乙醇；LysisC液为30mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化钠及0.05% NaN3 的水溶液按1： 50的重量比组成；结合液为10% PEG8000（聚乙二醇8000），4M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为1mol/L GITC，0.2mol/L氯化钠，10mmol/L EDTA， 40mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.5～ 6.5；washing2液为5～10mmol/L EDTA，20～ 40mmol/L Tris-HCL ，0.1～0.2mol/L氯化钠， pH=5.5～ 6.5；洗脱液为0.5～1.5mmol/L EDTA，5～ 15mmol/L Tris-HCL，PH=7.5～8.5。
一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒3，包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。经过正交试验测试优选的其各成分的组成为，Lysis A液为1.6% CTAB， 0.12mol/L氯化钠，15mmol/L EDTA，80mmol/L Tris-HCL ，pH=7.8；Lysis B液为20%β-巯基乙醇；LysisC 液为20mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化钠及0.03% NaN3 的水溶液按1：35的重量比组成；结合液为10% PEG8000（聚乙二醇8000），3.5M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5mol/L GITC，0.14mol/L氯化钠，8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.8；washing2液为8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.14mol/L氯化钠， pH=5.8；洗脱液为0.1mmol/L EDTA，5mmol/L Tris-HCL，PH=8.2。
分别利用上述3种试剂盒提取大豆基因组DNA，包括如下步骤：
1. 取30mg粉碎的大豆干燥叶片，加入到207μl lysis液（Lysis A : Lysis B : Lysis C=150: 2 : 5，使用前混匀）中，65℃孵化30min。
2. 常温12000rpm，离心10min，观察样品沉淀完全，吸取上清液备用。
3. 转移100μl上清液，加入到与NP968核酸仪配套的96深孔板的第一、七列孔内，再向第一、七列孔内中加入150μl 结合液和5μl磁珠悬液；第二、八列孔中加入300μl washing1液；第三、九列孔中加入500μl washing2液，第六、十二列孔加100 μl洗脱液；第四、五、十、十一列孔空置，不加任何试剂。
4. 将加好的深孔板及搅拌套装入核酸提取仪，运行程序，程序步骤如下：
5. 吸取第六、十二列孔洗脱液转移至PCR管中，即提取的基因组DNA，置于冰箱中备用。
6. 运用微量分光光度仪（Eppendorf BioPhotometer plus ）测定DNA的浓度和纯度，以其它3种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，测定20组提取结果，求平均值X。结果如表1所示。
| 试剂盒 | 浓度（μg/ml） | OD260/280 |
| 本发明试剂盒1 | 92 | 1.81 |
| 本发明试剂盒2 | 87 | 1.85 |
| 本发明试剂盒3 | 108 | 1.96 |
| 索莱宝植物DNA提取试剂盒 | 78 | 1.73 |
| 金麦格植物DNA提取试剂盒 | 74 | 1.65 |
| 天根植物DNA提取试剂盒 | 65 | 1.62 |
表1
从以上结果可以看出，本发明的三个试剂盒均相对于现有技术的试剂盒有着更好的DNA提取效率，并且本发明的试剂盒3相对于试剂盒1和2提取效果更佳。
实施例2
采用实施例1的试剂盒3和 提取小麦的基因组DNA，包括如下步骤：
1. 取30mg粉碎过的小麦叶片，加入到207μl lysis液Lysis A : Lysis B : Lysis C=150: 2 : 5，使用前混匀）中，65℃孵化30min。
2. 常温12000rpm，离心10min，观察样品沉淀完全，吸取上清液备用。
3. 转移100μl上清液，加入到与NP968核酸仪配套的96深孔板的第一、七列孔内，再向第一、七列孔内中加入150μl 结合液和5μl磁珠悬液；第二、八列孔中加入300μl washing1液；第三、九列孔中加入500μl washing2液，第六、十二列孔加100 μl洗脱液；第四、五、十、十一列孔空置，不加任何试剂。
4. 将加好的深孔板及搅拌套装入核酸提取仪，运行程序，程序步骤如下：
5. 吸取第六、十二列孔洗脱液转移至PCR管中，即提取的基因组DNA，置于冰箱中备用。
6. 运用微量分光光度仪（Eppendorf BioPhotometer plus ）测定DNA的浓度和纯度，以其它3种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，测定20组提取结果，求平均值X。结果如表2所示。
| 试剂盒 | 浓度（μg/ml） | OD260/280 |
| 本发明试剂盒 | 150 | 1.97 |
| 索莱宝植物DNA提取试剂盒 | 118 | 1.58 |
| 金麦格植物DNA提取试剂盒 | 93 | 1.67 |
| 天根植物DNA提取试剂盒 | 96 | 1.69 |
表2
实施例3
采用实施例1的试剂盒3和市面上有的商品试剂盒提取玉米的基因组DNA，包括如下步骤：
1. 取30mg粉碎过的小麦叶片，加入到207μl lysis液Lysis A : Lysis B : Lysis C=150: 2 : 5，使用前混匀）中，65℃孵化30min。
2. 常温12000rpm，离心10min，观察样品沉淀完全，吸取上清液备用。
3. 转移100μl上清液，加入到与NP968核酸仪配套的96深孔板的第一、七列孔内，再向第一、七列孔内中加入150μl 结合液和5μl磁珠悬液；第二、八列孔中加入300μl washing1液；第三、九列孔中加入500μl washing2液，第六、十二列孔加100 μl洗脱液；第四、五、十、十一列孔空置，不加任何试剂。
4. 将加好的深孔板及搅拌套装入核酸提取仪，运行程序，程序步骤如下：
5. 吸取第六、十二列孔洗脱液转移至PCR管中，即提取的基因组DNA，置于冰箱中备用。
6. 运用微量分光光度仪（Eppendorf BioPhotometer plus ）测定DNA的浓度和纯度，以其它3种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，测定20组提取结果，求平均值X。结果如表3所示。
| 试剂盒 | 浓度（μg/ml） | OD260/280 |
| 本发明试剂盒 | 215 | 1.94 |
| 索莱宝植物DNA提取试剂盒 | 138 | 1.68 |
| 金麦格植物DNA提取试剂盒 | 141 | 1.54 |
| 天根植物DNA提取试剂盒 | 124 | 1.79 |
表3
以上实验结果表明，本发明的DNA提取试剂盒与其他3种常规的商品试剂盒相比，所提取的植物基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
Claims (10)
1.一种快速磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒，其特征在于：包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠悬液、结合液、wshing1液、wshing2液、洗脱液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中，Lysis A液为1～2% CTAB， 0.1～0.2mol/L氯化钠，10～20mmol/L EDTA，80～ 120mmol/L Tris-HCL ，pH=7.5～ 8.5；Lysis B液为10～ 20%β-巯基乙醇；LysisC 液为10～30mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有10～20mmol/L氯化钠及0.01～0.05% NaN3 的水溶液按1：30～50的重量比组成；结合液为5～10% PEG8000（聚乙二醇8000），2～4M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5～1mol/L GITC，0.1～0.2mol/L氯化钠，5～10mmol/L EDTA，20～ 40mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.5～ 6.5；washing2液为5～10mmol/L EDTA，20～ 40mmol/L Tris-HCL ，0.1～0.2mol/L氯化钠， pH=5.5～ 6.5；洗脱液为0.5～1.5mmol/L EDTA，5～ 15mmol/L Tris-HCL，PH=7.5～8.5。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：其中，Lysis A液为1.6% CTAB， 0.12mol/L氯化钠，15mmol/L EDTA，80mmol/L Tris-HCL ，pH=7.8；Lysis B液为20%β-巯基乙醇；LysisC 液为20mg/mL蛋白酶K；磁珠悬浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化钠及0.03% NaN3 的水溶液按1：35的重量比组成；结合液为10% PEG8000（聚乙二醇8000），3.5M GITC（异硫氰酸胍）；washing1液为0.5mol/L GITC，0.14mol/L氯化钠，8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.2% trionx-100， pH=5.8；washing2液为8mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCL ，0.14mol/L氯化钠， pH=5.8；洗脱液为0.1mmol/L EDTA，5mmol/L Tris-HCL，PH=8.2。
4.如权利要求l-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠的直径为0.5～2μm。
5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒快速提取植物组织基因组DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将25～100mg预处理后的新鲜植物组织加入到Lysis溶液（Lysis A : Lysis B : Lysis C=150～200 : 2 : 5）中，60～70℃温浴15～30min；
2）12000r离心10min，取上清液100μl，加入结合液100～150μl和5μl磁珠悬液，混合均匀；
3）将磁珠转移到washing1液中清洗；
4）将磁珠转移到washing2液中清洗；
5）清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，得到纯化的DNA 。
6.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：步骤1）中，样品与Lysis液的质量体积比为25～100mg : 150～250μl。
7.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：步骤2）中，上清液与结合液的体积比为1 : 1～2。
8.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：步骤3）中，参与核酸提取的磁珠与washing1液的体积比为5～10 : 200~400 ，优选的，步骤4）中，参与核酸提取的磁珠与washing2液的体积比为5～10 : 400~600 。
9.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：步骤1）中，样品与Lysis液的质量体积比为30mg : 207μl；步骤2）中，上清液与结合液的体积比为1：1.5；步骤（3）中，参与核酸提取的磁珠与washing1液的体积比为5: 300 ；步骤4）中，参与核酸提取的磁珠与washing2液的体积比为5 : 500。
10.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：所述植物组织包括新鲜植物叶片、干植物叶片、大豆种子、小麦种子、玉米种子等。
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