CN102618532A - 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102618532A CN102618532A CN2012101313235A CN201210131323A CN102618532A CN 102618532 A CN102618532 A CN 102618532A CN 2012101313235 A CN2012101313235 A CN 2012101313235A CN 201210131323 A CN201210131323 A CN 201210131323A CN 102618532 A CN102618532 A CN 102618532A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant leaf
- extracting
- centrifuge tube
- genomic dna
- magnetic force
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 51
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title abstract description 62
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title abstract 5
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 8
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003801 milling Methods 0.000 claims description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 claims description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 abstract description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 abstract 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 abstract 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 abstract 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 10
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 240000001890 Ribes hudsonianum Species 0.000 description 5
- 235000016954 Ribes hudsonianum Nutrition 0.000 description 5
- 235000001466 Ribes nigrum Nutrition 0.000 description 5
- 241000594182 Sarcophaga sigma Species 0.000 description 5
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 5
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 5
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 5
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N chloroform phenol Chemical compound C1(=CC=CC=C1)O.C(Cl)(Cl)Cl.C1(=CC=CC=C1)O.C1(=CC=CC=C1)O VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法，基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，通过预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜，通过预处理溶液可以有效的去除多糖、多酚、单宁等杂质对于基因组DNA提取的干扰。快速裂解液以盐酸胍和Tween 20为主要成分，常温条件下能够在2min内充***解植物细胞，并且后续的离心步骤只要2min即可，大大节约了操作时间。盐酸胍为强变性剂，其裂解细胞的效果好，而且，本发明中不需要加入有机溶剂氯仿等，不会对操作人员产生危害，安全可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
随着分子生物学和生物医学的不断发展，基因组DNA成为了一个重要的研究课题，基因组DNA对生物的生长、遗传、变异等生命过程起着控制作用。对基因组DNA的研究，首先涉及到基因组DNA的提取。
对于植物来说，提取基因组DNA的主要步骤是：破壁、破膜、去除杂质、漂洗和洗脱。首先，在提取的过程当中使用SDS或者CTAB等去污试剂可以破坏细胞膜，使细胞内的蛋白质沉淀下来，从而将细胞内的基因组DNA释放；其次，利用高盐沉淀的方法或者氯仿酚抽提的方法去除蛋白质、多酚和多糖等杂质；然后，在提取的上清中加入适量体积的乙醇、异丙醇和PEG等溶剂，使得基因组DNA吸附在硅胶柱、硅胶磁珠和玻璃珠离子交换柱等介质上；再加入漂洗液进行漂洗，最后是加入洗脱液将基因组DNA从介质上洗脱下来。
目前，市面上核酸纯化普遍使用的吸附介质是硅胶柱，硅胶柱采取的固体介质为纤维状的硅胶膜，主要成分都是二氧化硅。基本原理为：核酸在高盐，低温，低PH或者合适浓度的乙醇和异丙醇的情况下(不能低于4.0)能够选择性地与硅胶柱或者磁珠结合，而在高温，低盐，高PH的情况下，能够从硅胶柱上或者磁珠被洗脱下来。大部分情况下，核酸与硅胶柱的结合需要加入一定量的乙醇或者异丙醇，片段越小，加入的量越大，吸附率不高。
植物基因组DNA的提取方法一般有CTAB法、SDS法和高盐法。
CTAB法有很好的去污效果，因为CTAB是一种去污剂，在加热的情况下，能有效的裂解植物细胞，同时CTAB还可以和糖类进行结合，并通过离心作用将多糖去除。CTAB法也被应用于多种植物基因组DNA的提取，但是目前通用的CTAB法试剂盒使用起来操作繁琐，而且，一般会与氯仿酚等有毒的有机溶液配合使用。
SDS法是基因组DNA提取的传统方法，不但用于植物基因组DNA的提取，也用于其他组织DNA的提取，比如细胞，动物组织，血液。SDS是一种阴离子表面活性剂，在加热的情况下，可以裂解研磨过后的植物细胞，并且SDS还可以与K离子反应，产生白色絮状物质，这种物质可以与蛋白结合，通过离心一起沉淀。但是SDS法也有一定的缺陷，在裂解和离开的过程当中消耗的时间较长。
提供一种现有技术中的植物基因组DNA的提取方法-CTAB法，其包括如下步骤：
步骤1、取新鲜植物叶片(不超过100mg)或者干燥组织(不超过50mg)，放于研钵，加入液氮研磨充分；
步骤2、研磨后材料全部转移到2mL离心管，加入，加入500μLCTAB裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0；1.0mol/L NaCl；2％CTAB；2％PVP40)和20μLβ-巯基乙醇，瞬时涡旋后置于60℃水浴锅中，水浴30min(干燥组织可酌情延长时间)；
步骤3、加入600μL氯仿/异戊醇(24∶1)，漩涡振荡混匀，并在12,000rpm下离心10min；
步骤4、小心吸取300μL上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入混合液300μL无水乙醇和20μL磁珠溶液，充分涡旋混匀；
步骤5、室温静置5min，离心管上磁力架，静置1min；
步骤6、吸去上清，加入70％乙醇，离心管下磁力架，充分涡旋混匀，静置1min，离心管上磁力架；
步骤7、重复操作步骤6一次；
步骤8、离心管置于磁力架上风干10min；
步骤9、加入100-150μL预热(65℃)洗脱液。离心管下磁力架，充分涡旋混匀，在65℃水中进行水浴5min；
步骤10、离心管置于磁力架上，静置2min；
步骤11、小心将上清吸出，备用。
该技术方案仍然存在一些缺点：
1、通用性不强。对于提取水稻，小麦等普通植物的基因组DNA效果良好，但是对于提取棉花，葡萄，黑加仑这些多糖、多酚、单宁、脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA的时候，其纯化成功率较低，无法彻底去除多酚，多酚类物质。多酚在提取的过程中会有氧化而产生褐变，多糖等物质与基因组DNA结合后会产生粘稠的胶状物，这2种情况都容易造成基因组DNA降解，导致提取的基因组DNA纯度不高。
2、裂解液在裂解研磨后的叶片组织，需要在60℃水浴加热30min，同时需要离心时间10min，这些步骤消耗的时间过多。
3、提取棉花等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA时，需要加入有害的有机溶剂氯仿等，对于操作人员的健康不利，同时产生的废液也会造成污染。
发明内容
本发明的目的是要提供一种可以适用于棉花，葡萄，黑加仑等植物的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
根据本发明的一个方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，
预处理溶液：0.05M～0.2M Tris-Hcl、0.01～0.05M EDTA(乙二胺四乙酸)、体积比为1％～3％的巯基乙醇、质量/体积比为0.5％～2％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，
快速裂解液：50～100mmol/L KAC(醋酸钾)，PH＝5.2、10～50mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、4～6M GHCL(盐酸胍)、5～25mM sodium citrate(柠檬酸钠)、1％～5％Tween 20(聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯)，
DNA结合液：质量/体积比为5％～10％的PEGS000(聚乙二醇8000)、1.5-4M GITC(异硫氰酸胍)，0.5-1M NaCl，
磁珠悬浮液：磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50-100mg/mL，
洗脱液：1～10mM Tris-HCl、1-2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH＝8.0。
其有益效果是，预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜，但是不能破坏细胞核，由于基因组DNA位于细胞核内，而多糖、多酚、单宁等则存在于细胞质中，由于多糖、多酚、单宁会溶于预处理溶液内，所以通过预处理溶液可以有效的去除多糖、多酚、单宁等杂质对于基因组DNA提取的干扰。
裂解液以盐酸胍和Tween 20为主要成分，常温条件下能够在2min内充***解植物细胞，并且后续的离心步骤只要2min即可，大大节约了操作时间。盐酸胍为强变性剂，其裂解细胞的效果远好于CTAB和SDS。
采用2倍体积的5％PEG，4M GITC和0.5M NaCl溶液代替无水乙醇作为DNA结合液，效果更好，得率更高。
而且，本发明采用的技术方案当中，不需要加入有机溶剂氯仿等，不会对操作人员产生危害，安全可靠。
在一些实施方式中，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基。
其有益效果是，通过磁珠对基因组DNA产生吸附作用，从而实现对基因组DNA的提取操作，由于纳米级别的磁珠外表面为一层二氧化硅，由于磁珠颗粒小，比表面积大，磁珠法的得率一般都要高于硅胶柱式法，更为重要的是，磁珠方更容易实行自动化和高通量。
根据本发明的另一方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒的提取方法，其包括：
步骤一、取植物叶片放于研钵内研磨充分，研磨时间为1-2min；
步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500μL预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；
步骤三、加入500μL快速裂解液；
步骤四、在8,000-12,000rpm下离心1-3min；
步骤五、小心吸取400μL上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000μL DNA结合液和10-50μL磁珠悬浮液，充分涡旋混匀；
步骤六、在18-25℃下静置5-10min后，将离心管置于磁力架上，静置1-3min；
步骤七、吸去上清，加入体积比为70％的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置1-3min，再将离心管置于磁力架上；
步骤八、将离心管置于磁力架上风干5-15min；
步骤九、加入100-150μL预热65℃的DNA结合液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在55-80℃水中水浴2-8min；
步骤十、将离心管置于磁力架上，静置1-2min；
步骤十一、小心将上清吸出，备用。
其有益效果是，本发明的提取方法尤其适用于棉花，葡萄，黑加仑这些多糖、多酚、单宁、脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA提取。
在一些实施方式中，在步骤一中，
若所取植物叶片为新鲜植物叶，则取量不超过100mg，
若所取植物叶片为干燥组织，则取量不超过50mg，。
其有益效果是，因为新鲜植物叶中含水份较多，所以取量稍大些，而干燥组织的含水量较少，所以取量可以稍小些。
在一些实施方式中，在步骤一中，在研钵内加入液氮后再进行研磨。
其有益效果是，利用液氮创造一个低温环境，一方面，低温可以抑制核酸酶的活性，使得基因组DNA免受核酸酶的侵袭，另一方面，低温可以使物体的脆性增强，从而更便于研磨，而且研磨时也更省力。
在一些实施方式中，在步骤七与步骤八之间还包括一步骤，吸去上清，加入体积比为70％乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置1-3min，再将离心管置于磁力架上。
其有益效果是，通过两次同样的重复操作，使得提取的基因组DNA的纯度更加的高。
附图说明
图1是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的琼脂糖电泳对比图；其中M道为标记泳道，1，2泳道为实验1-1中CTAB方法提取的棉花新鲜嫩叶基因组DNA条带，3，4泳道为实验1-1中采用本发明提取的棉花新鲜嫩叶基因组DNA条带，5，6泳道为实验1-2中CTAB方法提取的棉花老叶基因组DNA条带，7，8泳道为实验1-2中采用本发明提取的棉花老叶基因组DNA条带。
图2是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的又一琼脂糖电泳对比图；其中，1，2泳道为实验2中采用CTAB方法提取的水稻叶片基因组DNA条带；3，4泳道为实验2中采用本发明提取的水稻叶片基因组DNA条带。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步的阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于解释说明本发明，可以有不同形式的等效替换，本实施例不能限制本发明的保护范围。
1、试剂盒
一种基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，
预处理溶液包括：0.2M tris-HCL、0.05M EDTA、体积比为2％的巯基乙醇和质量/体积比为2％的PVP，
快速裂解液包括：100mmol/L KAC，PH＝5.2、50mmol/L EDTA、6MGHCl、5mM sodium citrate、2％Tween 20，
DNA结合液包括：5％PEG8000、4M GITC，0.5M NaCl，
磁珠悬浮液包括：磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50mg/mL，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基，
洗脱液包括：5mM Tris-HCl、1M EDTA，pH＝8.0。
其中tris-HCL采用加拿大生物技术公司(BBI)的BB0079，EDTA采用美国西格玛公司(Sigma)的E6758，PVP采用加拿大生物技术公司(BBI)的#PB0436，KAC采用加拿大生物技术公司(BBI)的PB0438，GHCL采用美国西格玛公司(Sigma)的#G3272，sodium citrate采用美国西格玛公司(Sigma)的#C8532，Tween 20采用美国西格玛公司(Sigma)的#P9416，PEG8000采用加拿大生物技术公司(BBI)的#PB0433，GITC采用美国西格玛公司(Sigma)的#G9277，NaCl采用加拿大生物技术公司(BBI)的ST1218。
2、基因组DNA提取方法
采用该试剂盒从植物当中提取基因组DNA的方法，其步骤包括：
步骤一、取植物叶片放于研钵内，并加入液氮研磨充分，研磨时间为2min；
步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500μL预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；
步骤三、加入500μL快速裂解液；
步骤四、在12,000rpm下离心2min；
步骤五、小心吸取400μL上清至一新的2mL离心管中，在吸取的时候避免吸起沉淀，加入混合液800μL DNA结合液和20μL磁珠悬浮液，充分涡旋混匀；
步骤六、在20℃下静置5min后，将离心管置于磁力架上，静置1min；
步骤七、吸去上清，加入70％乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置1min，再将离心管置于磁力架上；
步骤八、重复步骤七的全部操作一次
步骤九、将离心管置于磁力架上风干10min；
步骤十、加入150μL预热65℃的DNA洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在65℃水中水浴5min；
步骤十一、将离心管置于磁力架上，静置2min；
步骤十二、小心将上清吸出，备用。
3、结果对比分析
将本发明技术方案的实验结果与现有技术的CTAB方法的实验结果进行对比分析。
实验1-1
选用100mg棉花新鲜嫩叶进行基因组DNA的提取。同时采用本发明的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图1所示(2％琼脂糖胶电泳，)。
实验结论：本发明提取方法的提取效果要明显好于现有技术的CTAB方法。
实验1-2
选用50mg棉花老叶进行基因组DNA的提取。同时采用本发明的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液洗脱。
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图1所示。
实验结论：现有技术的CTAB方法基因组DNA提取的量很少，纯度也很低，而本发明的提取方法仍然能够提取到较多的基因组DNA，而且纯度也比CTAB方法高很多。
实验2
选用100mg水稻新鲜叶片进行基因组DNA的提取。同时采用本发明的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液洗脱。
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图2所示。
实验结论：对于水稻等植物，两种方法的效果差别不大，但是在时间上，本发明所需要的时间比现有技术的CTAB方法要少的多。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，
预处理溶液：0.05M～0.2M Tris-Hcl、0.01～0.05M EDTA(乙二胺四乙酸)、1％～3％巯基乙醇、0.5％～2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，
快速裂解液：50～100mmol/L KAC(醋酸钾)，PH＝5.2、10～50mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、4～6M GHCL(盐酸胍)、5～25mM sodium citrate(柠檬酸钠)、1％～5％Tween 20(聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯)，
DNA结合液：5％～10％PEG8000(聚乙二醇8000)、1.5-4M GITC(异硫氰酸胍)，0.5-1M NaCl，
磁珠悬浮液：磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50-100mg/mL，
洗脱液：1～10mM Tris-HCl、1-2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH＝8.0。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其中，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基。
3.权利要求1或2所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒的提取方法，其包括：
步骤一、取植物叶片放于研钵内研磨充分，研磨时间为1-2min；
步骤二、若所取植物叶片为多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500μL预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；
步骤三、加入500μL快速裂解液；
步骤四、在8,000-12,000rpm下离心1-3min；
步骤五、小心吸取400μL上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000μL DNA结合液和10-50μL磁珠悬浮液，充分涡旋混匀；
步骤六、在18-25℃下静置5-10min后，将离心管置于磁力架上，静置1-3min；
步骤七、吸去上清，加入体积比为70％的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置1-3min，再将离心管置于磁力架上；
步骤八、将离心管置于磁力架上风干5-15min；
步骤九、加入100-150μL预热65℃的DNA结合液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在55-80℃水中水浴2-8min；
步骤十、将离心管置于磁力架上，静置1-2min；
步骤十一、小心将上清吸出，备用。
4.根据权利要求3所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中：步骤一中，
若所取植物叶片为新鲜植物叶，则取量不超过100mg，
若所取植物叶片为干燥组织，则取量不超过50mg。
5.根据权利要求4所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中，步骤一中，在研钵内加入液氮后再进行研磨。
6.根据权利要求3或4或5所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中，步骤七与步骤八之间还包括一步骤，吸去上清，加入体积比为70％的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置1-3min，再将离心管置于磁力架上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101313235A CN102618532A (zh) | 2012-05-02 | 2012-05-02 | 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101313235A CN102618532A (zh) | 2012-05-02 | 2012-05-02 | 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102618532A true CN102618532A (zh) | 2012-08-01 |
Family
ID=46558743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012101313235A Pending CN102618532A (zh) | 2012-05-02 | 2012-05-02 | 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102618532A (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898092A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-02 | 西安天隆科技有限公司 | 一种快速磁珠法提取植物组织基因组dna的试剂盒及方法 |
| CN104630208A (zh) * | 2015-02-11 | 2015-05-20 | 杭州百迈生物技术有限公司 | 提取基因组dna的试剂盒和提取方法 |
| CN106119394A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-11-16 | 刘明涛 | 一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用 |
| CN106480014A (zh) * | 2015-09-02 | 2017-03-08 | 创想生物科技有限公司 | 选择性分离核酸的方法及其套组 |
| CN107267502A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-10-20 | 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） | 一种高效提取甘蔗糖制品dna的试剂盒和方法 |
| CN109055363A (zh) * | 2018-09-21 | 2018-12-21 | 武汉菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于筛选超长片段核酸的磁珠试剂及筛选方法 |
| CN110358762A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-22 | 云南省农业科学院热区生态农业研究所 | 一种提取植物叶片基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
| CN111197073A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-05-26 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 从粪便中提取dna样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法 |
| CN112501155A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-03-16 | 南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院) | 一种应用于转基因小鼠基因鉴定的dna提取试剂盒 |
| CN114015681A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 深圳市人民医院 | 一种改进的多糖多酚植物ctab的提取方法 |
| CN114426967A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 西南大学 | 一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法和试剂盒 |
| CN115873848A (zh) * | 2022-12-24 | 2023-03-31 | 蓝景科信河北生物科技有限公司 | 植物dna提取试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000063362A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Annovis, Inc. | Magnetic dna extraction kit for plants |
| CN102344921A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-08 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种用金磁微粒纯化植物组织基因组dna的方法 |
| CN102344920A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-08 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种用金磁微粒纯化植物种子基因组dna的方法 |
-
2012
- 2012-05-02 CN CN2012101313235A patent/CN102618532A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000063362A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Annovis, Inc. | Magnetic dna extraction kit for plants |
| CN102344921A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-08 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种用金磁微粒纯化植物组织基因组dna的方法 |
| CN102344920A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-08 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种用金磁微粒纯化植物种子基因组dna的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 丛玉隆: "《临床实验室管理》", 31 August 2004, 中国医药科技出版社 * |
| 何春燕等: "《医学生物化学实验指导》", 30 September 2010, 湖北科学技术出版社 * |
| 刘松财: "《生物化学实验技术》", 30 June 2010, 吉林大学出版社 * |
| 史仁玖等: "药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究", 《时珍国医国药》 * |
| 许良中: "《实用肿瘤病理方法学》", 31 December 1997, 上海医科大学出版社 * |
| 闫桂琴: "《遗传学实验教程》", 31 December 2010, 科学出版社 * |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898092B (zh) * | 2014-01-27 | 2016-08-10 | 西安天隆科技有限公司 | 一种快速磁珠法提取植物组织基因组dna的试剂盒及方法 |
| CN103898092A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-07-02 | 西安天隆科技有限公司 | 一种快速磁珠法提取植物组织基因组dna的试剂盒及方法 |
| CN104630208A (zh) * | 2015-02-11 | 2015-05-20 | 杭州百迈生物技术有限公司 | 提取基因组dna的试剂盒和提取方法 |
| CN104630208B (zh) * | 2015-02-11 | 2018-01-02 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 提取基因组dna的试剂盒和提取方法 |
| CN108048449A (zh) * | 2015-02-11 | 2018-05-18 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 一种提取基因组dna的试剂盒 |
| CN108048449B (zh) * | 2015-02-11 | 2021-10-08 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 一种提取基因组dna的试剂盒 |
| CN106480014B (zh) * | 2015-09-02 | 2020-05-15 | 创想生物科技有限公司 | 选择性分离核酸的方法及其套组 |
| CN106480014A (zh) * | 2015-09-02 | 2017-03-08 | 创想生物科技有限公司 | 选择性分离核酸的方法及其套组 |
| CN106119394A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-11-16 | 刘明涛 | 一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用 |
| CN107267502A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-10-20 | 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） | 一种高效提取甘蔗糖制品dna的试剂盒和方法 |
| CN109055363A (zh) * | 2018-09-21 | 2018-12-21 | 武汉菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于筛选超长片段核酸的磁珠试剂及筛选方法 |
| CN110358762A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-22 | 云南省农业科学院热区生态农业研究所 | 一种提取植物叶片基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
| CN111197073A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-05-26 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 从粪便中提取dna样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法 |
| CN114426967A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 西南大学 | 一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法和试剂盒 |
| CN112501155A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-03-16 | 南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院) | 一种应用于转基因小鼠基因鉴定的dna提取试剂盒 |
| CN114015681A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 深圳市人民医院 | 一种改进的多糖多酚植物ctab的提取方法 |
| CN115873848A (zh) * | 2022-12-24 | 2023-03-31 | 蓝景科信河北生物科技有限公司 | 植物dna提取试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102618532A (zh) | 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 | |
| CN110684764B (zh) | 用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法 | |
| CN109385418B (zh) | 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂 | |
| CN104178480B (zh) | 利用dna吸附柱快速提取植物dna的试剂盒及方法 | |
| CN102286460B (zh) | 一种改进ctab法提取杏鲍菇中的dna | |
| CN103361339A (zh) | 一种提取丝状真菌基因组dna的方法及试剂盒和遗传转化子的快速筛选方法 | |
| CN103898092A (zh) | 一种快速磁珠法提取植物组织基因组dna的试剂盒及方法 | |
| CN107904229A (zh) | 基因组dna提取方法及提取试剂盒 | |
| CN113293159A (zh) | 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 | |
| CN104404030B (zh) | 一种快速提取植物基因组dna的试剂盒及方法 | |
| CN102161988A (zh) | 一种提取单个鱼卵仔鱼微量总dna的简便快速方法 | |
| CN103820434A (zh) | 一种真菌菌丝总dna的提取方法 | |
| CN111808721B (zh) | 一种核酸提取芯片及采用其快速提取血液dna的方法 | |
| CN101735297B (zh) | 一种植物低分子量rna的快速提取方法 | |
| CN105255857A (zh) | 一种茶树dna的提取方法 | |
| CN102703430B (zh) | 一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总dna的方法 | |
| CN101921743A (zh) | 一种获取古代动物遗传信息的方法 | |
| CN101705225B (zh) | 一种用于多重pcr小分子扩增片段的高效分离方法 | |
| CN108192892B (zh) | 一种羟基纳米磁珠法提取rna的试剂盒及提取方法 | |
| CN106636075A (zh) | 一种铁皮石斛基因组dna的提取方法 | |
| CN107267498A (zh) | 一种通用型从微量植物材料中提取dna的试剂盒及方法 | |
| CN104164421A (zh) | 一种葡萄果皮rna的提取方法 | |
| CN101125874A (zh) | 利用研磨法从凝胶中纯化小片段dna的方法和用途 | |
| CN102888396B (zh) | 一种分离植物低分子量rna的方法 | |
| CN110904095B (zh) | 一种提高小片段核酸纯化得率的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SUZHOU QBIOSOURCE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YI CHUN Effective date: 20140321 Free format text: FORMER OWNER: JI YUN LI KAI LI ZONGFEI Effective date: 20140321 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 201100 MINHANG, SHANGHAI TO: 215000 SUZHOU, JIANGSU PROVINCE |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20140321 Address after: Xinghu Street Industrial Park of Suzhou city in Jiangsu province 215000 BioBAY No. 218 building A2 Room 309 Applicant after: Suzhou pioneer Biotechnology Co., Ltd. Address before: 201100, 332, clear water road, Shanghai, Minhang District Applicant before: Yi Chun Applicant before: Ji Yun Applicant before: Li Kai Applicant before: Li Zongfei |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120801 |