CN103898009A - 一株根瘤菌及其应用 - Google Patents

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严君
韩晓增
冀照君
郭爱雪
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Abstract

一株根瘤菌及其应用，它涉及一株根瘤菌及其应用。本发明目的是为了解决现有大豆接种的根瘤菌在长期连作的条件下竞争结瘤能力和固氮酶活性差的问题，本发明一株根瘤菌，它为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64，已于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月10日，保藏编号为CGMCC No.8693。本发明的应用是指在长期大豆连作的土壤上的应用。本发明的根瘤菌具有高效结瘤的特性，能够提高大豆生物量，改善大豆氮素营养，适用于黑龙江省长期大豆连作土壤区。本发明应用于农业领域。

Description

一株根瘤菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株根瘤菌及其应用。
背景技术
我国是大豆生产和消费大国，由于人口的不断怎加导致大豆的消费量也在不断地增长，供需矛盾十分紧张。为了满足人们对大豆产品的需求，农民不得不在有限的耕地上连续种植大豆，目前大豆连作面积已达35%以上，而大豆又是典型的不耐连作的作物，长期的连作会导致大豆结瘤、固氮能力下降、生长发育受阻，多种病虫害连年发生、产量和品质下降，甚至绝产。目前用于大豆接种的根瘤菌大多来自于非长期连作条件下分离的根瘤菌，其抗逆能力、定殖能力、竞争结瘤能力、固氮酶活性等都不理想，影响了大豆的生产。因此筛选出能够在长期大豆连作土壤上与大豆根系建立有效共生关系的高效根瘤菌对于大豆生产具有重要的作用。
发明内容
本发明目的是为了解决现有大豆接种的根瘤菌在长期连作的条件下竞争结瘤能力和固氮酶活性差的问题，而提供一株根瘤菌及其应用。
本发明一株根瘤菌，它为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64，已于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月9日，保藏编号为CGMCC No.8693。
本发明一株根瘤菌的应用是指根瘤菌在长期大豆连作的土壤上的应用。
本发明从黑龙江海伦农业生态实验站长期大豆连作实验地选取地上部生长旺盛的大豆植株分离筛选出一株根瘤菌，菌落为圆形，乳白色半透明，粘质较多，边缘整齐，菌落表面光滑，培养5-7d后菌落直径达0.8-2.0mm。挑取菌苔涂片，油镜下观察，根瘤菌为（0.5-0.8）×（1.1-0.3）μm的小杆菌。内含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状革兰氏阴性（G-），无芽孢，菌体单个或成对。对本发明所分离的菌株的recA序列进行测序，将获得的recA基因序列输入GenBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明的recA基因序列与慢生根瘤菌属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与B.liaoningense的序列相似性为95.5%，从而确定分离出来的根瘤固氮菌S-S20131G64为慢生根瘤菌属的新菌株系，并命名为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64。
本发明具有如下有益效果：1.本发明的根瘤固氮株系S-S20131G64具有高效结瘤的特性，接种该根瘤菌至少能够提高大豆生物量20-32%，可用于生产实践中；2.通过接种本发明的根瘤固氮株系S-S20131G64，能够改善大豆氮素营养，从而达到大豆高产且培肥土壤的目的；3.本发明的根瘤固氮菌株系S-S20131G64适用于黑龙江省长期大豆连作土壤区，作为大豆常规栽培的措施之一。
附图说明
图1为根瘤菌S-S20131G64在YMA培养基上的菌落形态；
图2为根瘤菌S-S20131G64在革兰氏染色后在显微镜下的观察图像；
图3为根瘤菌S-S20131G64的recA部分序列分析***发育树状图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一株根瘤菌为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumhailunense）S-S20131G64，已于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月9日，保藏编号为CGMCC No.8693。
本实施方式的海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64应用在长期大豆连作的土壤上。
本实施方式从黑龙江海伦农业生态实验站长期大豆连作实验地选取地上部生长旺盛的大豆植株分离筛选出一株根瘤菌，菌落为圆形，乳白色半透明，粘质较多，边缘整齐，菌落表面光滑，培养5-7d后菌落直径达0.8-2.0mm。挑取菌苔涂片，油镜下观察，根瘤菌为（0.5-0.8）×（1.1-0.3）μm的小杆菌。内含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状革兰氏阴性（G-），无芽孢，菌体单个或成对。对本发明所分离的菌株的recA序列进行测序，将获得的recA基因序列输入GenBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明的recA基因序列与慢生根瘤菌属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与B.liaoningense的序列相似性为95.5%，从而确定分离出来的根瘤固氮菌S-S20131G64为慢生根瘤菌属的新菌株系，并命名为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64。
本实施方式具有如下有益效果：1.本实施方式的根瘤固氮株系S-S20131G64具有高效结瘤的特性，接种该根瘤菌至少能够提高大豆生物量20-32%，可用于生产实践中；2.通过接种本实施方式的根瘤固氮株系S-S20131G64，能够改善大豆氮素营养，从而达到大豆高产且培肥土壤的目的；
具体实施方式二：本实施方式一株根瘤菌的应用是指根瘤菌在长期大豆连作的土壤上的应用。
本实施方式的根瘤固氮菌株系S-S20131G64适用于黑龙江省长期大豆连作土壤区，作为大豆常规栽培的措施之一。
具体实施方式三：本实施方式根瘤菌S-S20131G64的分离按以下步骤进行：一、从黑龙江海伦农业生态实验站长期大豆连作实验地选取地上部生长旺盛的大豆植株，观察其根部着生的根瘤，摘取颜色为粉红色的根瘤置于小采样瓶中，瓶子底部放入无水硫酸钠作为干燥剂。二、将采取的根瘤带回实验室后，用无菌水清洗三次，使用3%次氯酸钠消毒5min，并用无菌水洗涤消过毒的根瘤7次，保留最后一次的洗涤水用于YMA平板涂布检测根瘤消毒彻底与否。三、用无菌的镊子，将单个的消毒洗涤的瘤子转移到无菌的EP管内，并用灭菌的枪头捣碎瘤子，然后，直接用该枪头在YMA培养基平板上划线。YMA培养基平板在28℃恒温培养箱内倒置培养，每日观察，直至长出单菌落，选择边缘整齐，乳白色半透明的单菌落接种到YMA固体培养基上。
根瘤菌S-S20131G64在YMA培养基上的菌落形态（如图1所示）：菌落为圆形，乳白色半透明，粘质较多，边缘整齐，菌落表面光滑，培养5-7d后菌落直径达0.8-2.0mm。挑取菌苔涂片，油镜下观察，根瘤菌为（0.5-0.8）×（1.1-0.3）μm的小杆菌。内含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状革兰氏阴性（G-），无芽孢，菌体单个或成对，根瘤菌S-S20131G64革兰氏染色后在显微镜下的图像如图2所示。
YMA固体培养基（即酵母汁甘露醇琼脂培养基）的组成为：甘露醇10g/l，酵母粉3g/l，K2HPO40.25g/l，KH2PO40.25g/l，MgSO4-7H2O0.2g/l，NaCl0.1g/l，CaCO33g/l，琼脂粉10g/l，其余为蒸馏水，pH调节至7.0。
本实施方式菌株S-S20131G64（保藏编号为CGMCC No.8693）具有固氮能力强，固氮量大，抗逆能力强等特点。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而能够增加土壤间根瘤菌的群体，对豆科植物的结瘤固氮有促进作用。
对本实施方式的根瘤菌S-S20131G64的recA序列进行测序：
为了鉴定根瘤菌的***发育地位，对所分离的菌株的recA序列进行测序。首先提取菌株总的DNA，然后采用持家基因recA的引物recA41F/recA640R扩增其recA基因，将PCR产物直接测序，将获得的recA基因序列输入GenBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本实施方式海伦慢生根瘤菌的recA基因序列与慢生根瘤菌属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与B.liaoningense的序列相似性为95.5%，从而确定分离出来的根瘤固氮菌S-S20131G64为慢生根瘤菌属的新菌株系，并命名为海伦根瘤菌Bradyrhizobium hailunense。recA基因与多重学列比对的结果相似，因此采用recA即能定种。根瘤菌S-S20131G64的recA部分序列分析***发育树状图如图3所示。
对本实施方式的根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64进行接种试验：
本试验所取土壤为黑龙江省海伦市不同大豆连作年限，包括玉米/大豆轮作、大豆连作1年，连作5年及连作15年的耕作土壤。供试土壤为中厚层黑土。将采集的土壤风干过筛后放在高压灭菌锅中灭菌。本试验选用我们分离出来的根瘤菌：S-S20131G64，广谱分布的模式菌株Bradyrhizobium USDA6T，另设不接种处理作为对照。营养液（营养液配方如下(/L)：Ca(NO3)2·4H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.12g，CaCl2·2H2O0.10g，KH2PO40.10g，Na2HPO4·12H2O0.15g，柠檬酸铁0.05g，微量元素1mL。微量元素的配方（/L）：H2MoO40.02g，MnSO41.81g，H2BO32.86g，CuSO4·5H2O0.8g，ZnSO4·7H2O0.22g）与土混合时，土（kg）与营养液（mL）的比例为1:32，将土与营养液充分混合均匀后，装盆。试验采用完全随机区组设计，4个重复。把经过消毒、催芽的大豆种子播种于塑料盆土壤中。每盆播种3棵，播种一周后进行间苗，每盆只保留一棵长势健壮的幼苗。间苗后，把培养好的根瘤菌菌液接种到幼苗的根部，每棵种苗加入菌液1-2mL，保证每棵种苗的接菌量达到1.0×109个以上。植株生长45d后收获，取大豆植株地上生物量，观察大豆的结瘤情况并测定根瘤的固氮酶活性。
表1不同连作年限土壤接种根瘤菌后大豆的生物量、结瘤固氮情况
Figure BDA0000474135710000041
试验结果如表1所示，从表1可以看出：1.本试验的根瘤固氮株系S-S20131G64具有高效结瘤的特性，接种该根瘤菌至少能够提高大豆生物量20-32%，可用于生产实践中；2.通过接种本试验的根瘤固氮株系S-S20131G64，能够改善大豆氮素营养，从而达到大豆高产且培肥土壤的目的；3.本试验的根瘤固氮菌株系S-S20131G64适用于黑龙江省长期大豆连作土壤区，作为大豆常规栽培的措施之一。
Figure IDA0000474135820000011

Claims (2)

1.一株根瘤菌，其特征在于它为海伦慢生根瘤菌（Bradyrhizobium hailunense）S-S20131G64，已保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月9日，保藏编号为CGMCC No.8693。
2.如权利要求1所述的一株根瘤菌的应用，其特征在于根瘤菌在长期大豆连作的土壤上的应用。
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