CN103864953A

CN103864953A - 改性聚多糖及其制备方法

Info

Publication number: CN103864953A
Application number: CN201410133893.7A
Authority: CN
Inventors: 汤朝晖; 李明强; 于海洋; 宋万通; 陈学思
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: CN103864953B

Abstract

本发明提供了一种改性聚多糖及其制备方法，该改性聚多糖包括：聚多糖，其为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；分别接枝于所述聚多糖的羟基上的式（I）所示的第一接枝链和式（II）所示的第二接枝链，接枝率分别为0～96%和4%～100%。该制备方法包括：烯丙基缩水甘油醚在碱性化合物水溶液中与上述聚多糖的羟基通过环氧开环，得到侧链烯基功能化的聚多糖；巯基化合物与所述侧链烯基功能化的聚多糖发生光引发的巯基-烯基点击化学反应，得到改性聚多糖；所述巯基化合物选自巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、巯基丁二酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽。该改性聚多糖能用作药物载体，其制备方法安全可靠、绿色高效。

Description

改性聚多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及聚多糖技术领域，特别涉及一种改性聚多糖及其制备方法。

背景技术

葡聚糖作为自然界最丰富的天然多糖之一，已经被广泛地用于生物技术和生物医学等领域，比如，医学和药学、尤其是血浆代用品，组织工程，基因治疗，生物器件涂层和表面修饰等。具体地说来，其天然的丰富来源、优良的水溶性和生物相容性，使葡聚糖成为了一种极具潜力且安全可靠的临床用生物材料。因为葡聚糖具有良好的安全性和巨大的应用潜力，美国食品和药物管理局已批准其用于静脉注射。然而，与其他具有多种官能团如氨基、羧基或磺酸基的聚多糖，如壳聚糖、海藻酸盐、硫酸软骨素、肝素和透明质酸相比，葡聚糖仅具有羟基，缺乏生物活性和细胞粘附能力，这将可能阻碍其进一步的应用。

通过化学键和的方式，将其他化学官能团或生物活性分子与葡聚糖键合，有望充分发挥葡聚糖及其衍生物在生物医学领域的应用潜能。通常，葡聚糖侧链修饰的方法主要包括酯化、醚化和还原胺化。2001年，Sharpless和同事提出：利用点击化学反应可快速、高效和选择性地实现模块化的化学键合。最近，金属铜介导的Huisgen1,3-偶极环加成反应，这一经典的点击化学反应已经用于聚多糖的疏水性修饰（Polymer Chemistry2013，4:2235-8；Carbohydrate Polymers2013，93:537-46）。使用金属铜介导的Huisgen1,3-偶极环加成反应对聚多糖进行改性时，在多糖侧链引入的是叠氮或炔基。

目前，对葡聚糖等聚多糖改性的研究空间仍旧很大，可丰富聚多糖类材料的种类、利于应用。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种改性聚多糖及其制备方法，本发明提供的改性聚多糖经过侧链修饰，能用作药物载体和药物非活性组分等。

本发明提供一种改性聚多糖，包括：

聚多糖，所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；

接枝于所述聚多糖的羟基上的第一接枝链，所述第一接枝链的接枝率为0～96%，所述第一接枝链如式（I）所示：

和接枝于所述聚多糖的羟基上的第二接枝链，所述第二接枝链的接枝率为4%～100%，所述第二接枝链如式（II）所示：

式（II）中，-S-R独立地选自巯基乙酸脱氢后的基团、巯基丙酸脱氢后的基团、巯基乙胺盐酸盐脱氢后的基团、巯基乙醇脱氢后的基团、巯基丁二酸脱氢后的基团、半胱氨酸脱氢后的基团和还原型谷胱甘肽脱氢后的基团。

优选的，所述聚多糖的分子量为5000～70000。

与现有技术相比，本发明提供的改性聚多糖包括主链、第一接枝链和第二接枝链；所述主链由葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖这些聚多糖形成；所述第一接枝链和第二接枝链分别接枝在所述聚多糖的羟基上，接枝率分别为0～96%和4%～100%；所述第一接枝链如式（I）所示，所述第二接枝链如式（II）所示，式（II）中，-S-R独立地选自巯基乙酸脱氢后的基团、巯基丙酸脱氢后的基团、巯基乙胺盐酸盐脱氢后的基团、巯基乙醇脱氢后的基团、巯基丁二酸脱氢后的基团、半胱氨酸脱氢后的基团和还原型谷胱甘肽脱氢后的基团。在本发明中，一定量的第二接枝链实现了所述聚多糖侧链的羧基化或胺基化等修饰，使改性后的聚多糖具有生物活性或修饰靶点，能用作药物载体和药物非活性组分等而广泛运用于生命科学领域，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。实验表明，采用所述改性聚多糖担载抗肿瘤药物顺铂或阿霉素，载药胶束具有缓释能力，且呈现明显的剂量-药效关系。

本发明还提供一种改性聚多糖的制备方法，包括以下步骤：

烯丙基缩水甘油醚在碱性化合物水溶液中与聚多糖的羟基发生环氧开环反应，得到侧链烯基功能化的聚多糖；所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；

在光引发剂存在的条件下，巯基化合物与所述侧链烯基功能化的聚多糖通过紫外光引发巯基-烯基点击化学反应，得到改性聚多糖；所述巯基化合物独立地选自巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、巯基丁二酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽。

优选的，所述聚多糖的分子量为5000～70000。

优选的，所述光引发剂为水溶性自由基光引发剂。

优选的，所述碱性化合物水溶液为氢氧化钠水溶液。

优选的，所述碱性化合物水溶液的浓度为0.01M～1M。

优选的，所述巯基-烯基点击化学反应的巯基与烯基的物质的量的比值为3～50:1。

优选的，所述紫外光的波长为245nm～365nm。

优选的，所述巯基-烯基点击化学反应的时间为0.5h～3h。

与现有技术相比，本发明首先在碱性化合物水溶液中，将烯丙基缩水甘油醚与聚多糖的羟基通过环氧开环反应，实现葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖这些聚多糖的侧链烯基功能化；然后，本发明任意选用巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、巯基丁二酸、半胱氨酸或还原型谷胱甘肽这些巯基化合物，利用紫外光引发的巯基-烯基点击化学反应，实现聚多糖的侧链改性。本发明改性后的聚多糖具有生物活性或修饰靶点，能用作药物载体和药物非活性组分等而广泛运用于生命科学领域，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。

另外，本发明提供的改性聚多糖的制备方法避免了有机溶剂和其他重金属催化剂的使用，且整个反应过程均可在水溶液中实现，反应条件温和，可控性强，是一种安全、可靠、高效的聚多糖改性方法，易于推广和放大。

附图说明

图1为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图；

图2为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖的红外光谱图；

图3为本发明实施例2制备的巯基乙胺修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图；

图4为本发明实施例2制备的巯基乙胺修饰的葡聚糖的红外光谱图；

图5为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖和巯基乙胺修饰的葡聚糖的X射线光电子能谱图；

图6为本发明实施例28制备的巯基丙酸修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图；

图7为本发明实施例28制备的巯基丙酸修饰的葡聚糖的红外光谱图；

图8为本发明实施例29制备的巯基丁二酸修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图；

图9为本发明实施例29制备的巯基丁二酸修饰的葡聚糖的红外光谱图；

图10为本发明实施例47和实施例55制备的葡聚糖接枝物-阿霉素载药胶束在磷酸缓冲液中的释放结果；

图11为本发明实施例61和实施例67制备的葡聚糖接枝物-顺铂载药胶束在磷酸缓冲液中的释放结果；

图12为本发明实施例12、19、34和37制备的材料对A549细胞的毒性考察结果图；

图13为本发明实施例47和实施例55制备的阿霉素载药胶束及阿霉素裸药对A549细胞的毒性考察结果图；

图14为本发明实施例61和实施例67制备的顺铂配合物及顺铂裸药对MCF-7细胞的药效考察结果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明公开了一种改性聚多糖，包括：聚多糖，所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；接枝于所述聚多糖的羟基上的第一接枝链，所述第一接枝链的接枝率为0～96%，所述第一接枝链如式（I）所示；和接枝于所述聚多糖的羟基上的第二接枝链，所述第二接枝链的接枝率为4%～100%，所述第二接枝链如式（II）所示；

本发明实施例提供的改性聚多糖属于接枝聚合物，其以聚多糖为主链化合物，通过所述聚多糖的羟基，接枝式（I）所示的第一接枝链和式（II）所示的第二接枝链，所述第二接枝链的非接枝端基为一些巯基化的功能分子脱氢后的基团，可赋予改性聚多糖生物活性或修饰靶点，利于其在生命科学领域中的应用。

本发明提供的改性聚多糖包括聚多糖，其形成主链，所述主链的接枝位点为聚多糖的羟基。所述聚多糖的结构示意式如式（1）所示：

在本发明中，所述聚多糖作为主链化合物被改性，其为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖，优选为葡聚糖。作为优选，所述聚多糖的分子量为5000～70000，更优选为10000～60000。

所述葡聚糖、普鲁兰多糖和香菇多糖分别如式（III）～（V）所示：

本发明提供的改性聚多糖包括式（I）所示的第一接枝链，其接枝在所述聚多糖的羟基上，接枝物示意式如式（2）所示；本发明提供的改性聚多糖包括式（II）所示的第二接枝链，其接枝在所述聚多糖的羟基上，接枝物示意式如式（3）所示。

在本发明中，所述第一接枝链的接枝率为0～96%，优选为2%～56%，更优选为5%～40%；所述第二接枝链的接枝率为4%～100%，优选为5%～60%，更优选为10%～50%。本发明对所述第一接枝链和第二接枝链的位置关系没有特殊限制，也就是说，本发明接枝聚合物可以是嵌段聚合物，也可以是无规聚合物；本发明可以没有第一接枝链。

在本发明中，一定量的第二接枝链实现了所述聚多糖侧链的羧基化或胺基化等修饰，使改性后的聚多糖具有生物活性或修饰靶点，能用作药物载体和药物非活性组分等而广泛运用于生命科学领域，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。实验表明，采用所述改性聚多糖担载抗肿瘤药物顺铂或阿霉素，载药胶束具有缓释能力，且呈现明显的剂量-药效关系。

本发明还公开了一种改性聚多糖的制备方法，包括以下步骤：烯丙基缩水甘油醚在碱性化合物水溶液中与聚多糖的羟基发生环氧开环反应，得到侧链烯基功能化的聚多糖；所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；在光引发剂存在的条件下，巯基化合物与所述侧链烯基功能化的聚多糖通过紫外光引发巯基-烯基点击化学反应，得到改性聚多糖；所述巯基化合物独立地选自巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、巯基丁二酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽。

本发明通过对葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖这些聚多糖进行水相改性，实现了聚多糖的羧基或胺基等侧链改性。上述多糖已经作为药物非活性组分、药物载体、抗肿瘤药物等广泛运用于生命科学领域，而经改性的聚多糖衍生物具有新的生物活性或修饰靶点，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。

首先，本发明实施例向反应器内加入聚多糖、碱性化合物水溶液和烯丙基缩水甘油醚进行环氧开环反应，得到侧链烯基功能化的聚多糖终产物。

本发明对聚多糖进行改性，所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖，优选为葡聚糖；所述葡聚糖、普鲁兰多糖和香菇多糖分别如式（III）～（V）所示。所述聚多糖的分子量优选为5000～70000，更优选为10000～60000。

本发明采用烯丙基缩水甘油醚与聚多糖的羟基发生环氧开环反应，制备烯基修饰的聚多糖。所述烯丙基缩水甘油醚如式（VI）所示：

本发明制备烯基修饰的聚多糖在碱性化合物水溶液中进行，所述碱性化合物水溶液优选为氢氧化钠水溶液；所述碱性化合物水溶液的浓度优选为0.01M～1M，更优选为0.1M～0.5M。在本发明中，所述环氧开环反应的时间优选为12h～72h，更优选为12h～24h；所述环氧开环反应的温度优选为20℃～50℃，更优选为25℃～45℃。

本发明第一步反应所得的反应产物可通过透析、冻干进行纯化，也可使用醇类快速沉降、洗涤后，通过透析、冻干进行纯化，所述醇类包括甲醇、乙醇或异丙醇等。本发明对所得产物进行核磁共振测试，结果表明，烯丙基缩水甘油醚与聚多糖分子成功键合，并将烯基引入到聚多糖侧链。

本发明将烯丙基缩水甘油醚在碱性化合物水溶液中与聚多糖的羟基通过环氧开环反应，实现聚多糖的侧链烯基功能化。所述环氧开环反应的效率优选在4%以上，更优选为5%～60%，此处，反应的效率也可以表示为侧链烯基相对于聚多糖的接枝率。

然后，本发明将所述侧链烯基功能化的聚多糖、光引发剂和巯基化合物加入反应器、优选为透光性好的石英瓶内，通过紫外光照射进行巯基-烯基点击化学反应，得到改性聚多糖接枝产物。

本发明采用巯基化合物，与所述侧链烯基功能化的聚多糖进行巯基-烯基点击化学反应。所述巯基化合物为巯基化的功能分子，表示为SH-R；所述巯基化合物独立地选自巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙胺盐酸盐、巯基乙醇、巯基丁二酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽，优选为巯基乙酸、巯基乙胺盐酸盐或半胱氨酸。在本发明中，所述巯基-烯基点击化学反应的巯基与烯基的物质的量的比值优选为3～50：1，更优选为5～20:1。

本发明利用巯基-烯基点击化学反应对聚多糖进行修饰时，需要使用光引发剂，且通过紫外光照射来实现。所述光引发剂优选为水溶性自由基光引发剂，更优选为2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮，能使本发明化学反应均在水溶液中进行。在本发明中，所述巯基-烯基点击化学反应的烯基与光引发剂的物质的量的比值优选为1～20：1，更优选为5～15:1。所述紫外光的波长优选为245nm～365nm，更优选为365nm。在本发明中，所述巯基-烯基点击化学反应的时间优选为0.5h～3h，更优选为0.5h～1.5h。

本发明第二步反应所得的反应产物可通过透析除掉小分子杂质，冻干后得到白色固体产物。本发明利用核磁共振和X射线光电子能谱仪对所得产物进行测试，结果表明，巯基化合物与聚多糖侧链的烯基通过巯基-烯基点击化学反应，实现了聚多糖侧链的修饰。

本发明在光引发剂存在条件下，使用巯基化的功能分子（SH-R），通过紫外光引发巯基-烯基点击化学反应，实现聚多糖的侧链改性。所述巯基-烯基点击化学反应的效率优选在80%以上，优选为90%～99.8%，此处，反应的效率也可以表示为巯基相对于侧链烯基功能化的聚多糖的接枝率。

本发明实施例所有反应的示意式可以如式（4）所示：

本发明实施例所有反应的示意式可以分别如式（5）～（7）所示：

得到改性聚多糖后，本发明将其担载抗肿瘤药物顺铂或阿霉素，并进行药效考察等实验。结果表明，载药胶束具有缓释能力，且呈现明显的剂量-药效关系。

综上所述，本发明提供了一种实现聚多糖侧链改性的方法，所述聚多糖包括葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖。所述改性的方法分两步：首先，烯丙基缩水甘油醚在碱性化合物水溶液中与上述聚多糖通过环氧开环，实现聚多糖的侧链烯基功能化；而后，利用光引发的巯基-烯基点击化学反应，实现聚多糖的侧链改性。

本发明制备的改性聚多糖具有生物活性或修饰靶点，能用作药物载体和药物非活性组分等而广泛运用于生命科学领域，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。另外，本发明提供的改性聚多糖的制备方法属于一种绿色化学改性手段，整个反应过程可完全在水溶液中进行，无需使用价格昂贵且存在机体毒性的金属催化剂。同时，整个反应过程所需条件温和，可控性强，易于推广和放大。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的改性聚多糖及其制备方法进行具体描述。

实施例1

向50mL的反应瓶内加入1.0216g分子量为5000的葡聚糖，用20mL浓度为0.1M的氢氧化钠溶液充分搅拌溶解后，加入0.2157g烯丙基缩水甘油醚，在25℃的条件下反应12h，然后用冰乙醇沉降反应得到的产物，再依次经过过滤、冰乙醇洗涤三次、真空干燥，得到白色固体产物，最后用去离子水充分溶解所述白色固体产物，经透析袋透析48h，换水10次，冷冻干燥后，得到终产物，为前体聚合物，即葡聚糖-烯丙基缩水甘油醚接枝物（Dex-AGE）。对所述终产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为5.4%，反应产率为78%。

向干燥的石英瓶内加入0.2189g制备的Dex-AGE，用6mL去离子水搅拌溶解后，通氩气0.5h，在室温、氩气保护条件下，加入1.6mg2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和0.0373g巯基丙酸，通过波长为365nm的紫外光照射反应2h，将反应得到的产物透析72h，换水12次，冷冻干燥后，得到白色冻干粉产物，为接枝产物，即改性葡聚糖。对所述接枝产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为93.7%，反应产率为92%。

实施例2

向250mL的反应瓶内加入5.0010g分子量为40000的葡聚糖，用100mL浓度为0.1M的氢氧化钠溶液充分搅拌溶解后，加入3.5205g烯丙基缩水甘油醚，在35℃的条件下反应24h，然后用乙醇沉降反应得到的产物，再依次经过过滤、冰乙醇洗涤三次、真空干燥，得到白色固体产物，最后用去离子水充分溶解所述白色固体产物，经透析袋透析72h，换水12次，冷冻干燥后，得到终产物，为前体聚合物，即Dex-AGE。

对所述终产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为22.9%，反应产率为62%；谱图如图1所示，图1为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图。利用红外光谱对所述终产物进行结构分析，结果参见图2，图2为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖的红外光谱图。结果表明，烯丙基缩水甘油醚与葡聚糖分子成功键合，并将烯基引入到葡聚糖侧链。

向干燥的石英瓶内加入0.2132g制备的Dex-AGE，用10mL去离子水搅拌溶解后，通氩气0.5h，在室温、氩气保护条件下，加入5.8mg2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和0.2946g巯基乙胺盐酸盐，通过波长为365nm的紫外光照射反应1h，将反应得到的产物透析72h，换水12次，冷冻干燥后，得到白色冻干粉产物，为接枝产物，即改性葡聚糖。

对所述接枝产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为99.1%，反应产率为92%；谱图如图3所示，图3为本发明实施例2制备的巯基乙胺修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图。利用红外光谱对所述接枝产物进行结构分析，结果参见图4，图4为本发明实施例2制备的巯基乙胺修饰的葡聚糖的红外光谱图。结果表明，巯基乙胺与葡聚糖侧链的烯基通过巯基-烯基点击化学反应，实现了葡聚糖侧链的胺基化修饰。

利用X射线光电子能谱仪对制备的前体聚合物和胺基化葡聚糖进行元素分析，结果参见图5，图5为本发明实施例2制备的烯基修饰的葡聚糖和巯基乙胺修饰的葡聚糖的X射线光电子能谱图。图5中，A曲线对应前体聚合物，B曲线对应胺基化葡聚糖。B曲线在168.3eV和163.2eV处的峰归属为S2p，证实产物改性葡聚糖中硫元素的存在，进一步证实巯基-烯基点击化学反应的成功进行。

实施例3～27

按照实施例1的方法，实施例3～27经过第一步反应和第二步反应，分别制备改性葡聚糖。实施例3～27第一步反应的内容参见表1，表1为本发明实施例3～27第一步反应的内容；实施例3～27第二步反应的内容参见表2，表2为本发明实施例3～27第二步反应的内容。

表1本发明实施例3～27第一步反应的内容

表2本发明实施例3～27第二步反应的内容

注：实施例8、15和16、21～23、26和27没有第二步反应。

实施例28

以实施例2制备的Dex-AGE为前体聚合物。

向干燥的石英瓶内加入0.2301g实施例2制备的Dex-AGE，用10mL去离子水搅拌溶解后，通氩气0.5h，在室温、氩气保护条件下，加入6.3mg2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和0.2970g巯基丙酸，通过波长为365nm的紫外光照射反应1h，将反应得到的产物透析72h，换水12次，冷冻干燥后，得到白色冻干粉产物，为接枝产物，即改性葡聚糖。

对所述接枝产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为95.3%，反应产率为93%；谱图如图6所示，图6为本发明实施例28制备的巯基丙酸修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图。结果表明，巯基丙酸与葡聚糖侧链的烯基通过巯基-烯基点击化学反应，实现了葡聚糖侧链的羧基化修饰。

利用红外光谱对所述接枝产物进行结构分析，结果参见图7，图7为本发明实施例28制备的巯基丙酸修饰的葡聚糖的红外光谱图。从图7可以看出，1571cm^-1处可见明显的羰基的伸缩振动峰，进一步证实聚合物中羧基的成功引入。

实施例29

以实施例2制备的Dex-AGE为前体聚合物。

向干燥的石英瓶内加入0.2589g实施例2制备的Dex-AGE，用15mL去离子水搅拌溶解后，通氩气0.5h，在室温、氩气保护条件下，加入7.1mg2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和0.4728g巯基丁二酸，通过波长为365nm的紫外光照射反应1h，将反应得到的产物透析72h，换水12次，冷冻干燥后，得到白色冻干粉产物，为接枝产物，即改性葡聚糖。

对所述接枝产物进行核磁共振测试，计算得到其接枝率为93.4%，反应产率为90%；谱图如图8所示，图8为本发明实施例29制备的巯基丁二酸修饰的葡聚糖以氘代二甲亚砜作为溶剂时的¹H NMR结果图。结果表明，巯基丁二酸与葡聚糖侧链的烯基通过巯基-烯基点击化学反应，实现了葡聚糖侧链的羧基化修饰。

利用红外光谱对所述接枝产物进行结构分析，结果参见图9，图9为本发明实施例29制备的巯基丁二酸修饰的葡聚糖的红外光谱图。从图9可以看出，1585cm^-1处可见明显的羰基的伸缩振动峰，证实聚合物中羧基的成功引入。

实施例30～44

以之前实施例制备的Dex-AGE为原料，按照实施例28第二步反应的方法，实施例30～44分别制备得到改性葡聚糖。实施例30～44反应的内容参见表3，表3为本发明实施例30～44反应的内容。

表3本发明实施例30～44反应的内容

实施例45～56

利用上述实施例制备的侧链含羧基的葡聚糖，通过静电复合作用担载抗肿瘤药物阿霉素，方法为：将功能化的葡聚糖溶于去离子水中，调节pH值7.0～8.0，加入阿霉素盐酸盐，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水8次以除去游离阿霉素，得到担载阿霉素的纳米胶束。将所述纳米胶束在无菌条件下冷冻干燥，得到阿霉素纳米粒冻干粉。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收，测定得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过以下公式计算阿霉素在纳米粒中的包封效率（DLE）和包封量（DLC）；

实施例45～56担载药物的内容参见表4，表4为本发明实施例45～56担载药物的内容。

表4本发明实施例45～56担载药物的内容

实施例57～72

利用上述实施例制备的侧链含羧基的葡聚糖，通过羧基与铂的配位作用担载抗肿瘤药物顺铂，具体方法为：将功能化的葡聚糖溶于去离子水中，调节pH值7.4～8.2，加入顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析36h，换水8次以除去游离顺铂，得到顺铂配合物的胶束。将所述顺铂配合物的胶束在无菌条件下冷冻干燥，得到顺铂配合物冻干粉，其Pt含量利用电感耦合等离子体质谱测定。

实施例57～72担载药物的内容参见表5，表5为本发明实施例57～72担载药物的内容。

表5本发明实施例57～72担载药物的内容

实施例73

取5mg的实施例47和实施例55制备的阿霉素载药胶束，溶解在5mL浓度0.01M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为3500的透析袋，在37℃条件下用40mL缓冲液进行透析，在1h、3h、5h、7h、10h、16h、24h、36h、48h、60h分别取样3mL，并加入相应量的缓冲液。使用紫外-可见光谱仪测试阿霉素浓度，得到累积释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图10所示，图10为本发明实施例制备的葡聚糖接枝物-阿霉素载药胶束在磷酸缓冲液中的释放结果。在图10中，A曲线对应实施例47制备的载药胶束，B曲线对应实施例55制备的载药胶束。结果表明，实施例47和实施例55制备的阿霉素载药胶束均具有缓释能力。

实施例74

取5mg的实施例61和实施例67制备的顺铂载药胶束，溶解在5mL浓度为0.01M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为3500的透析袋，在37℃条件下用40mL缓冲液进行透析，在1h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h分别取样3mL，并加入相应量的缓冲液。利用电感耦合等离子体质谱进行定量分析，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图11所示，图11为本发明实施例61和实施例67制备的葡聚糖接枝物-顺铂载药胶束在磷酸缓冲液中的释放结果。在图11中，A曲线对应实施例61制备的载药胶束，B曲线对应实施例67制备的载药胶束。结果表明，实施例61和实施例67制备的顺铂载药胶束具有缓释能力，可有效降低小分子顺铂的毒性，提高机体耐受能力。

实施例75

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（约10⁴个）细胞，在37℃培养24h后弃培养液；

用培养基将实施例12制备的前体聚合物和改性葡聚糖、实施例19、实施例34、实施例37制备的材料分别稀释为1.0g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.125g/L、0.0625g/L、0.03125g/L6个浓度的样品；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的细胞存活率。

比较上述材料的细胞相容性，结果参见图12，图12为本发明实施例12、19、34和37制备的材料对A549细胞的毒性考察结果图。在图12中，A、B、C、D、E依次为实施例12制备的前体聚合物、实施例12制备的改性葡聚糖、实施例19、实施例34、实施例37制备的材料对A549细胞的细胞毒性考察结果。由图12可知，上述材料对细胞具有良好的生物相容性。

实施例76

用培养基将阿霉素裸药稀释为0.02g/L、0.01g/L、0.005g/L、0.0025g/L、0.00125g/L、0.000625g/L6个浓度的样品，用培养基将实施例47和实施例55制备的阿霉素复合物分别按照阿霉素浓度稀释为0.02g/L、0.01g/L、0.005g/L、0.0025g/L、0.00125g/L、0.000625g/L6个浓度的样品；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到细胞的存活率。

比较阿霉素裸药及阿霉素复合物胶束细胞增殖抑制的效果，结果参见图13，图13为本发明实施例47和实施例55制备的阿霉素载药胶束及阿霉素裸药对A549细胞的毒性考察结果图。其中，曲线A为阿霉素裸药对A549细胞的毒性效果，曲线B为实施例47制备的阿霉素复合物胶束对A549细胞的毒性效果，曲线C为实施例55制备的阿霉素复合物胶束对A549细胞的毒性效果。由图13可知，与阿霉素裸药相比，载药胶束保持了原药的抗肿瘤活性，并呈现明显的剂量-药效关系。

实施例77

收集对数期MCF-7细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（约10⁴个）细胞，在37℃培养24h后弃培养液；

用培养基将顺铂裸药稀释为150μM/L、75μM/L、37.5μM/L、18.75μM/L、9.375μM/L、4.6875μM/L6个浓度的样品，用培养基将实施例61和实施例67制备的顺铂配合物分别按照顺铂中Pt浓度稀释为300μM/L、150μM/L、75μM/L、37.5μM/L、18.75μM/L、9.375μM/L6个浓度的样品；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养72h；

72h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到使用各个浓度的顺裸药铂及顺铂配合物后细胞的存活率。

比较顺铂裸药及顺铂配合物作用的效果，结果参见图14，图14为本发明实施例61和实施例67制备的顺铂配合物及顺铂裸药对MCF-7细胞的药效考察结果图。其中，曲线A为顺铂裸药对MCF-7细胞的毒性效果，曲线B为实施例61制备的顺铂配合物对MCF-7细胞的毒性效果，曲线C为实施例67制备的顺铂配合物对MCF-7细胞的毒性效果。由图14可知，与顺铂裸药相比，顺铂配合物具有缓释功能，显著降低了原药毒性，且呈现明显的剂量-药效关系。

由以上实施例可知，本发明制备得到了一种改性聚多糖，其侧链有羧基或胺基化修饰，从而具有生物活性或修饰靶点，能用作药物载体和药物非活性组分等而广泛运用于生命科学领域，有利于拓展此类聚多糖材料的应用范围。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种改性聚多糖，包括：

聚多糖，所述聚多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或香菇多糖；

2.根据权利要求1所述的改性聚多糖，其特征在于，所述聚多糖的分子量为5000～70000。

3.一种改性聚多糖的制备方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述聚多糖的分子量为5000～70000。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为水溶性自由基光引发剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述碱性化合物水溶液为氢氧化钠水溶液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碱性化合物水溶液的浓度为0.01M～1M。

8.根据权利要求3至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述巯基-烯基点击化学反应的巯基与烯基的物质的量的比值为3～50:1。

9.根据权利要求3至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长为245nm～365nm。

10.根据权利要求3至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述巯基-烯基点击化学反应的时间为0.5h～3h。