CN103842493B

CN103842493B - 活细胞冷冻保存用具

Info

Publication number: CN103842493B
Application number: CN201280048620.1A
Authority: CN
Inventors: 井上太
Original assignee: KITAZATO BIOPHARMA CO LTD
Current assignee: KITAZATO BIOPHARMA CO LTD
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2032-10-01
Also published as: JP5781621B2; EP2765181A1; KR20140070575A; EP2765181A4; KR101934031B1; CN103842493A; EP2765181B1; HK1198177A1; WO2013051520A1; US20140212962A1; US9538746B2; JPWO2013051520A1

Abstract

活细胞冷冻保存用具（1）具有由耐寒性材料形成的主体部（3）和由耐寒性材料形成的活细胞保持部（2）。活细胞保持部（2）具有细长的活细胞附着保持部（22），活细胞附着保持部（22）具有活细胞收纳用凹部（28a、28b、28c、28d、28e）和剩余冷冻保存液排出通路（29a、29b、29c、29d、29e、29f），该多个活细胞收纳用凹部（28a、28b、28c、28d、28e）在活细胞附着保持部（22）的长度方向上设置有多个，该剩余冷冻保存液排出通路（29a、29b、29c、29d、29e、29f）与活细胞收纳用凹部（28a、28b、28c、28d、28e）连通。

Description

活细胞冷冻保存用具

技术领域

本发明涉及一种在将哺乳动物的卵子、胚胎等卵，造血干细胞、多能干细胞等干细胞，***等，各种活细胞冷冻保存时所使用的细胞冷冻保存用具。

背景技术

哺乳动物胚胎的冷冻保存能够保存特定的***、品种的遗传资源。此外，对于维持濒临灭绝危机的动物种类也是有效的。并且，在人类的***治疗中也是有用的。

作为哺乳动物胚胎的冷冻保存方法，在专利文献1（日本特开2000－189155）中提出了这样的方法：利用足够包裹哺乳动物胚胎或者卵子的最少量的玻璃化液将这些胚胎或者卵子粘在经灭菌处理后的冷冻吸管、冷冻瓶或者冷冻管等冷冻保存用容器的内表面，将该冷冻保存用容器密封，然后使该容器与液氮接触而对该容器进行急速冷却。而且，在融解方法中，将利用上述方法保存的冷冻保存用容器从上述液氮中取出，使容器的一端部开口，向该容器内直接注入33℃～39℃的稀释液，使胚胎或者卵子的冷冻融解稀释。采用该方法，具有能够无因病毒、细菌而感染之忧地以较高的存活率保存和融解稀释哺乳动物胚胎或者卵子这样的优异的效果。

但是，利用足够包裹哺乳动物胚胎或者卵子等卵的最少量的玻璃化液粘在冷冻吸管、冷冻瓶或者冷冻管等冷冻保存用容器的内表面的作业未必容易。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000－189155

专利文献2：日本特开2002－315573（WO02－085110A1）

专利文献3：日本特开2004－329202（美国公开2004－0259072）

发明内容

发明要解决的问题

因此，本申请发明人提出了专利文献2（日本特开2002－315573、WO02－085110A1）。专利文献2的卵冷冻保存用具1由主体部2、卵附着保持用条带3和筒状构件4构成，该主体部2由耐寒性材料形成，该卵附着保持用条带3安装在主体部2的一端，由挠性、透明性且耐液氮性材料形成，该筒状构件4由耐寒性材料形成，其能够包裹卵附着保持用条带3且装拆自如地安装在主体部2的这一端被封锁。

此外，本申请发明人还提出了专利文献3（日本特开2004－329202、美国公开2004－0259072）。专利文献3的卵冷冻保存用具1具有由耐液氮材料形成的卵冷冻保存用管2和用于保护管2的金属制筒状保护构件3。管2具有主体部21和内径为0.1mm～0.5mm的卵保存用细径部22，并且能够被在细径部的顶端侧热封，能够被在主体部21热封。筒状保护构件3具有筒状部31和半筒状部32，该筒状部31用于收纳管2的细径部22的顶端部，该半筒状部32用于收纳细径部22的未被筒状部31收纳的部分及主体部21的顶端部21a。

专利文献2及专利文献3的卵冷冻保存用具是有效的。

但是，期望能够更容易地进行卵冷冻操作，且能够可靠地防止被冷冻的卵脱离的卵冷冻保存用具。

本发明的目的在于，提供一种将活细胞载置于活细胞冷冻保存用具的操作容易，在冷冻活细胞的作业时活细胞不会脱离，且能够迅速地使活细胞冷冻的活细胞冷冻保存用具。

用于解决问题的方案

达到上述目的的活细胞冷冻保存用具如下。

一种活细胞冷冻保存用具，其具有由耐寒性材料形成的主体部和由耐寒性材料形成的活细胞保持部，其中，上述活细胞保持部具有细长的活细胞附着保持部，上述活细胞附着保持部具有活细胞收纳用凹部和剩余冷冻保存液排出通路，该活细胞收纳用凹部在上述活细胞附着保持部的长度方向上设置有多个，该剩余冷冻保存液排出通路与上述活细胞收纳用凹部连通。

附图说明

图1是本发明的实施例的活细胞冷冻保存用具的主视图。

图2是图1所示的活细胞冷冻保存用具的顶端侧部分的放大主视图。

图3是图2所示的活细胞冷冻保存用具的左视图。

图4是图2的A－A剖视图。

图5是图2的B－B剖视图。

图6是图2所示的活细胞冷冻保存用具的放大俯视图。

图7是图2的C－C放大剖视图。

图8是图1所示的活细胞冷冻保存用具的顶端部的放大主视图。

图9是图8的D－D剖视图。

图10是本发明的另一实施例的活细胞冷冻保存用具在活细胞收纳用凹部处被截断而得到的放大横剖视图。

图11是本发明的另一实施例的活细胞冷冻保存用具的放大纵剖视图。

图12是本发明的另一实施例的活细胞冷冻保存用具的顶端部的放大主视图。

图13是图12的E－E剖视图。

图14是图12的F－F剖视图。

具体实施方式

使用图示的实施例说明本发明的活细胞冷冻保存用具。

本发明的活细胞冷冻保存用具1具有由耐寒性材料形成的主体部3和由耐寒性材料形成的活细胞保持部（卵保持部）2。卵保持部2具有细长的卵附着保持部22，卵附着保持部22具有在卵附着保持部22的长度方向上设置有多个的活细胞收纳用凹部（卵收纳用凹部）28a、28b、28c、28d、28e和与卵收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e连通的剩余冷冻保存液排出通路29a、29b、29c、29d、29e、29f。

特别是，该实施例的细胞冷冻保存用具1是卵冷冻保存用具，活细胞保持构件2为卵保持部。另外，本发明的细胞冷冻保存用具能够用于冷冻保存卵子、胚胎等卵，造血干细胞、多能干细胞等干细胞，***等，各种细胞，特别是能够用于冷冻保存上述那样的活细胞。

如图1～图5所示，活细胞冷冻保存用具1具有由耐寒性材料形成的主体部3和由耐寒性材料形成的活细胞保持部2。在该实施例中，如图2～图5（特别是图4）所示，在活细胞保持部2的基端部形成有向顶端方向延伸规定长度的孔部21a，在主体部3的顶端部设有能够进入到上述孔部21a内的延伸规定长度的突出部24。而且，通过将主体部3的突出部24***到活细胞保持部2的孔部21a内，将两者固定在一起。

活细胞保持部2的截面为大致矩形形状，其具有像上述那样与主体部3相连接的基端部和自该基端部向顶端侧突出的活细胞附着保持部22。而且，在该实施例中，活细胞附着保持部22为细长且宽度较窄的带状（薄板状）。而且，其表面形成活细胞附着保持面。

而且，在本发明的活细胞冷冻保存用具1中，如图2～图9所示，在活细胞附着保持部22的表面设有在长度方向上设置有多个的活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e。如图4及图9所示，活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e为大致半球状的凹部。此外，多个凹部28a、28b、28c、28d、28e自比活细胞冷冻保存用具1的顶端靠基端侧规定长度的位置向基端侧以直线状排列，而且，各凹部以大致等间隔隔开。在该实施例中，凹部设有多个，但也可以是1个。此外，在设有多个凹部的情况下，优选为2个～8个。凹部的深度优选为0.05mm～0.5mm，凹部的上表面的开口直径优选为 0.1mm～0.5mm。此外，凹部之间的间隔距离优选为1mm～3mm。

并且，在该实施例中，如图7及图9所示，形成有活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e的部分的背面侧部分形成为鼓出部38a、38b、38c、38d、38e，形成活细胞收纳用凹部的部分并不是薄壁，而具有充分的强度。另外，也可以不设置活细胞收纳用凹部，而平坦地形成活细胞冷冻保存用具1的表面，将其平坦面作为活细胞附着保持部。此外，活细胞附着保持部22的宽度优选为0.4mm～1.0mm，长度优选为5mm～30mm，整体的厚度和凹部部分的厚度优选为0.08mm～1.0mm。此外，活细胞保持部2的厚壁的基端部的长度优选为5mm～30mm，主体部的长度优选为20mm～100mm。

并且，在该实施例的活细胞冷冻保存用具1中，如图6～图8所示，具有设于活细胞附着保持部22的形成有活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e的部分的两侧部且沿活细胞附着保持部22的长度方向延伸的两个侧部鼓出部35、36。因此，活细胞冷冻保存用具1由于在活细胞收纳用凹部的两侧部具有鼓出部，因此能够可靠地抑制在载置活细胞时活细胞向侧部方向移动，并且还能防止载置后的活细胞自活细胞收纳凹部脱出。

并且，在该实施例的活细胞冷冻保存用具1中，如图1～图9（特别是图6及图7）所示，活细胞附着保持部22具有设于活细胞附着保持部22的比活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e靠顶端侧的位置的突出部27。突出部27自活细胞附着保持部22的顶端向上表面侧（形成活细胞收纳用凹部那一侧）突出。此外，如图9所示，突出部27的顶端面形成为向基端侧稍稍倾斜的倾斜面。通过形成这样的突出部27，假如活细胞自活细胞收纳部脱离而向顶端侧移动时，能够防止其自活细胞冷冻保存用具1落下，换言之能够防止其自活细胞附着保持部22落下。特别是，在该实施例的活细胞冷冻保存用具1中，通过与像上述那样设于活细胞附着保持部22的两侧部的鼓出部35、36协同动作，从而防止活细胞落下。

并且，在该实施例的活细胞冷冻保存用具1中，如图2～图9（特别是图8及图9）所示，活细胞附着保持部22具有与活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、 28d、28e连通的剩余冷冻保存液排出通路。在该实施例的活细胞冷冻保存用具1中，剩余冷冻保存液排出通路由沿活细胞附着保持部22的长度方向延伸的槽部29a、29b、29c、29d、29e、29f构成。而且，在该实施例中，槽部29b、29c、29d、29e将相邻的活细胞收纳用凹部连结起来。具体而言，槽部29b将凹部28a和凹部28b连通，槽部29c将凹部28b和凹部28c连通，槽部29d将凹部28c和凹部28d连通，槽部29e将凹部28d和凹部28e连通。

并且，在该实施例中，如图8及图9所示，活细胞附着保持部22具有自活细胞附着保持部22的最靠顶端侧的活细胞收纳用凹部28a向顶端侧延伸的槽部29a，该槽部29a的端部到达上述突出部或者延伸至上述突出部附近。并且，在该实施例中，活细胞附着保持部22具有自活细胞附着保持部22的最靠基端侧的活细胞收纳用凹部28e向基端侧延伸的槽部29f。

通过设置这样的与活细胞收纳用凹部连通的剩余冷冻保存液排出通路，与活细胞一同被收纳在活细胞收纳用凹部中的冷冻保存液的剩余部分流入到该槽部内，因此，能够抑制活细胞被过量的冷冻保存液覆盖，从而能够迅速地进行冷冻。并且，由于相邻的活细胞收纳用凹部被槽部连通，因此，冷冻保存液变得容易自活细胞收纳用凹部移动，而且，残留在多个活细胞收纳用凹部的冷冻保存液量也变得均匀。槽部的宽度优选为100μm～500μm，而且，槽部的深度优选为50μm～500μm。

主体部3和活细胞保持部2由耐寒性材料形成。特别是，主体部3和活细胞保持部2优选为耐液氮性材料，换言之优选为即使与液氮接触也不会发生脆化的材料。此外，活细胞保持部2优选为透明或者半透明体，而且，优选具有一些挠性。作为主体部3和活细胞保持部2的形成材料，优选使用例如3－氟化聚乙烯、低密度聚乙烯、中密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚碳酸酯、尼龙、聚砜、聚酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、超高分子量聚乙烯、乙烯－醋酸乙烯酯共聚物等合成树脂，以及由这些合成树脂形成的薄膜的层叠体。

在上述实施例的活细胞冷冻保存用具1中，如图6、图7及图9（特别是图7）所示，槽部29a、29b、29c、29d、29e并没有到达活细胞收纳用凹部28a、 28b、28c、28d、28e的底部。这样一来，能够在活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e的底部存积一些冷冻保存液。

但是，并不限定于上述那样的方式，也可以像图10及图11所示的活细胞冷冻保存用具10那样，槽部29a、29b、29c、29d、29e到达活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e的底部。这样一来，能够进一步减少存积在活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e中的冷冻保存液。

此外，活细胞收纳用凹部及与该活细胞收纳用凹部连通的剩余冷冻保存液排出通路的方式并不限定于上述那样的方式。

例如也可以是图12～图14所示的活细胞冷冻保存用具20那样的类型。图12是本发明的另一实施例的活细胞冷冻保存用具的顶端部的放大主视图。图13是图12的E－E剖视图。图14是图12的F－F剖视图。

在活细胞冷冻保存用具20中，活细胞附着保持部22具有形成在其上表面的多个短圆筒状突出部，在这些突出部的内部形成有活细胞收纳用凹部51、52、53、54、55。而且，在突出部的侧壁具有与凹部51连通的两个狭缝61a、61b，与凹部52连通的两个狭缝62a、62b，与凹部53连通的两个狭缝63a、63b，与凹部54连通的两个狭缝64a、64b，以及与凹部55连通的两个狭缝65a、65b。此外，各狭缝连通于各自所在凹部的底部。另外，与凹部连通的狭缝也可以是1个，但优选设置两个以上。此外，凹部的深度优选为0.05mm～0.5mm。并且，在该活细胞冷冻保存用具20中，在其背面侧（未形成有短圆筒状突出部的那一面侧）形成有以沿轴线方向延伸且从凹部51的底面的下方通过的方式延伸的凹部56。因此，形成凹部51的底面的部分为薄壁部，使得向凹部的导热良好。

接着，说明本发明的活细胞冷冻保存用具1的使用方法。

在该说明中，以冷冻保存活细胞（具体而言是卵子）的情况为例进行说明。

首先，提取多个作为活细胞的卵子，进行将卵子的细胞内液置换为平衡液的作业，再进行将细胞外液置换为玻璃化液的作业。然后，在显微镜下，使卵子与少量的玻璃化液一同配置附着在设于活细胞冷冻保存用具1的活细胞附着保持部22的各个活细胞收纳用凹部28a、28b、28c、28d、28e。将附着有卵子的活细胞冷冻保存用具1从顶端侧（活细胞保持部22侧）浸渍在预先准备好的液氮中将其冷冻（玻璃化）。通过与液氮接触，使活细胞急剧冷却。在将附着有冷冻活细胞的活细胞冷冻保存用具1收纳在另外准备的筒状容器内之后，再收纳在收纳容器（cane）中，将收纳容器放入液氮罐内保存起来。

产业上的可利用性

本发明的活细胞冷冻保存用具如下。

（1）一种活细胞冷冻保存用具，其具有由耐寒性材料形成的主体部和由耐寒性材料形成的活细胞保持部，在该活细胞冷冻保存用具中，上述活细胞保持部具有细长的活细胞附着保持部，上述活细胞附着保持部具有活细胞收纳用凹部和剩余冷冻保存液排出通路，该活细胞收纳用凹部在上述活细胞附着保持部的长度方向上设置有多个，该剩余冷冻保存液排出通路与上述活细胞收纳用凹部连通。

在上述活细胞冷冻保存器中，活细胞附着保持部具有多个活细胞收纳用凹部，由此，在活细胞配置操作过程中，活细胞附着保持部成为配置活细胞的目标，从而能够良好地进行配置操作，并且，由于被收纳在活细胞收纳用凹部的活细胞的移动受到限制，因此，能够防止活细胞在之后的冷冻作业过程中移动、脱离。并且，由于具有与活细胞收纳用凹部连通的剩余冷冻保存液排出通路，因此，不会在凹部内存积过量的冷冻保存液，能够在冷冻作业时迅速地将活细胞冷却。

而且，本发明的实施方式也可以如下。

（2）根据上述（1）所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述剩余冷冻保存液排出通路是与上述活细胞收纳用凹部连通且沿上述活细胞附着保持部的长度方向延伸的槽部。

（3）根据上述（1）或（2）所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述活细胞保持部具有两个侧部鼓出部，这两个侧部鼓出部设于上述活细胞附着保持部的形成有上述活细胞收纳用凹部的部分的两侧部，且沿上述活细胞附着保持部的长度方向延伸。

（4）根据上述（1）～（3）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述活细胞附着保持部具有设于比最靠顶端侧的上述活细胞收纳用凹部靠顶端侧的位置的突出部。

（5）根据上述（2）～（4）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述槽部将相邻的上述活细胞收纳用凹部连接起来。

（6）根据上述（2）～（5）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述活细胞附着保持部具有自最靠顶端侧的上述活细胞收纳用凹部向顶端侧延伸的槽部。

（7）根据上述（2）～（6）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述活细胞附着保持部具有自最靠基端侧的上述活细胞收纳用凹部向基端侧延伸的槽部。

（8）根据上述（1）～（7）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述耐寒性材料是耐液氮性材料。

（9）根据上述（1）～（8）中任一项所述的活细胞冷冻保存用具，其中，上述活细胞附着保持部为薄板状。

Claims

1.一种活细胞冷冻保存用具，其具有由耐寒性材料形成的主体部和由耐寒性材料形成的活细胞保持部，该活细胞冷冻保存用具的特征在于，

上述活细胞保持部具有细长的活细胞附着保持部，上述活细胞附着保持部具有活细胞收纳用凹部和剩余冷冻保存液排出通路，该活细胞收纳用凹部在上述活细胞附着保持部的长度方向上设置有多个，该剩余冷冻保存液排出通路与上述活细胞收纳用凹部连通，

上述剩余冷冻保存液排出通路是与上述活细胞收纳用凹部连通且沿上述活细胞附着保持部的长度方向延伸的槽部，

上述活细胞附着保持部还具有自最靠顶端侧的上述活细胞收纳用凹部向顶端侧延伸的槽部，以及自最靠基端侧的上述活细胞收纳用凹部向基端侧延伸的槽部。

2.根据权利要求1所述的活细胞冷冻保存用具，其中，

上述槽部将相邻的上述活细胞收纳用凹部连接起来。

3.根据权利要求1或2所述的活细胞冷冻保存用具，其中，

上述活细胞保持部具有两个侧部鼓出部，这两个侧部鼓出部设于上述活细胞附着保持部的形成有上述活细胞收纳用凹部的部分的两侧部，且沿上述活细胞附着保持部的长度方向延伸。

4.根据权利要求1或2所述的活细胞冷冻保存用具，其中，

上述活细胞附着保持部具有设于比最靠顶端侧的上述活细胞收纳用凹部靠顶端侧的位置的突出部。

5.根据权利要求1或2所述的活细胞冷冻保存用具，其中，

上述耐寒性材料是耐液氮性材料。

6.根据权利要求1或2所述的活细胞冷冻保存用具，其中，

上述活细胞附着保持部为薄板状。