CN103834608A - 基于胞外多糖水解酶的工程菌及其实现方法 - Google Patents

Abstract

一种生物工程技术领域的基于胞外多糖水解酶的工程菌及其实现方法，该多糖水解酶基因克隆自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)JSD-1，将其连接到表达载体上得到重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入大肠杆菌并诱导合成多糖水解酶。本发明克服现有技术中多糖水解酶多为诱导表达因此表达量较低等不足，应用基因工程菌表达本发明所述的多糖水解酶基因制备多糖水解酶，可为工业化发酵生产多糖水解酶提供一种新方法。

Description

基于胞外多糖水解酶的工程菌及其实现方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其实现方法，具体是一种能够外源表达胞外多糖水解酶(Sg-Hyd)的大肠杆菌工程菌及其实现方法。 

背景技术

多糖水解酶是一类能将多糖分子内的糖苷键水解的酶类，常见的有淀粉酶、木聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、β-葡聚糖酶及β-半乳糖苷酶等，几乎每种生物都发现有多糖水解酶的存在。 

近几年已经开展了大量关于多糖水解酶的研究与此同时各种多糖水解酶也广泛应用于饲料、食品、医药、餐饮、造纸及纺织等行业并起重要作用。因此，开发新型高效多糖水解酶，对加快各行业的发展提高人民生活水平具有重大意义。 

目前，大量的多糖水解酶基因均已被成功克隆和表达。与真核生物基因相比，原核生物基因结构简单、无内含子，具有易克隆、易表达及种类多等优势。其中，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。灰色链霉菌之前的研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还远远不足。 

与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长、分化机制，基因组较其他的原核生物也更大，可达8-9Mb。一般情况下，链霉菌对大分子多糖物质有很强的分解利用能力，推测其基因组内蕴含大量未被开发利用的多糖水解酶基因等。因此，研究链霉菌对大分子多糖物质的分解利用机制，发现全新的多糖水解酶基因序列并通过转基因等方式对目的基因进行外源表达，对新型多糖水解酶制剂的开发及生产具有重大意义。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于胞外多糖水解酶的工程菌及其实现方法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种基于胞外多糖水解酶的工程菌，能够外源表达胞外多糖水解酶的DH5α大肠杆菌。 

所述工程菌通过以下方式构建得到： 

1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1（CGMCC NO.5706）基因组DNA为模 板进行PCR扩增； 

所述的PCR引物是指含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物，具体包括： 

正向引物Hyd-NdeⅠ-F: 

5'-GGAATTCCATATGGCCGTCTGGAACTCCTGCGACCAGTGG-3' 

反向引物Hyd-EcoRⅠ-R: 

5'-GGAATTCTCAGCCGCCCGAGACGGTCAGGCTGTC-3' 

所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。 

2）构建具有Sg-Hyd基因的质粒：将步骤1得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到pET-30a质粒。 

所述的克隆载体采用pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。 

3）构建具有Sg-Hyd基因的表达载体，具体步骤包括： 

3.1)用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切处理含有Sg-Hyd基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有β-1,4-胞外多糖水解酶(Sg-Hyd)基因的片段； 

3.2)用NdeⅠ和EcoRⅠ内切酶处理pET-30a质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段； 

3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg-Hyd基因的表达载体。 

4）将表达载体转化至大肠杆菌：将步骤3中得到的含有Sg-Hyd基因的表达载体质粒转入Transetta(DE3)感受态细胞内。通过具有卡那霉素抗性和氯霉素的LB液体培养基进行筛选获得阳性克隆，即含有Sg-Hyd基因的工程菌。 

所述的β-1,4-胞外多糖水解酶，其原始氨基酸序列如SEQ ID NO.3，共编码237个氨基酸，切除前33个氨基酸信号肽序列后的成熟蛋白为204个氨基酸，分子量为22.0KD，如SEQ ID NO.4(加入起始氨基酸M共205个氨基酸)。 

所述的Sg-Hyd基因，其原始核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其长度为714个碱基对，切除编码信号肽对应的99个核苷酸后成熟蛋白对应的氨基酸为615个核苷酸，如SEQ ID NO.2(加入起始密码子ATG共618个核苷酸)。 

附图说明

图1目的基因序列信号肽分析图。 

图2目的基因PCR扩增结果电泳图。 

图3含有目的基因的克隆载体酶切电泳图。 

图4含有目的基因的表达载体酶切电泳图。 

图5重组菌诱导蛋白SDS-PAGE电泳图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

灰略红链霉菌(Streptomyces griseus)JSD-1的培养 

灰略红链霉菌(Streptomyces griseus)分离自上海浦江镇腐烂土壤，保藏编号为CGMCC No.5706；该菌株于2012年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中国科学院微生物研究所(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号100101) 

将该菌接种于LB液体培养基中，32℃培养60h，离心收集菌体并提取细菌的基因组DNA。 

所述的LB液体培养基组分为：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g、去离子水1L，pH6.8-7.2。 

实施例2 

灰色链霉菌多糖水解酶(Sg-Hyd)基因的克隆 

通过对灰色链霉菌多糖水解酶基因序列进行信号肽序列分析(如图1)，以成熟蛋白的编码基因序列的两端设计含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物如下： 

正向引物Hyd-NdeⅠ-F: 

5'-GGAATTCCATATGGCCGTCTGGAACTCCTGCGACCAGTGG-3' 

反向引物Hyd-EcoRⅠ-R: 

5'-GGAATTCTCAGCCGCCCGAGACGGTCAGGCTGTC-3' 

以灰色链霉菌JSD-1基因组DNA为模板，采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。 

实施例3 

含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因克隆载体的构建 

将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为700bp(见图2)；然后将PCR产物切胶回收后连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金)，随后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞。 

挑取具有相应抗性的克隆，通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌提取其质粒后送上海桑尼生物有限公司进行测序。 

实施例4 

含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因表达载体的构建 

选取序列正确的质粒，用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因的片段(如图3)；同样，用NdeⅠ和EcoRⅠ内切酶处理pET-30a表达载体，并通过琼脂糖凝胶电泳回收较大的载体片段。 

将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆，扩大培养提取其质粒便获得含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因表达载体。用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切通过琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)，确认载体构建无误。

实施例5 

含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因表达菌株的构建 

将含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因表达载体质粒转入Transetta(DE3)感受态细胞内。通过含卡那霉素和氯霉素(浓度均为2525μg/mL)的LB固体培养基进行筛选获得阳性克隆。获得的阳性克隆便为含有多糖水解酶(Sg-Hyd)基因的表达菌株。 

实施例6 

多糖水解酶(Sg-Hyd)的外源表达 

挑取阳性克隆并接种于卡那霉素和氯霉素浓度均为25μg/mL的LB液体培养基中，32℃、150rpm震荡培养2-3h，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG使发酵液中IPTG浓度达为0.05mM，25℃、140rpm继续培养6小时进行诱导表达，并分别取空白(诱导前)、2、4、6小时样品。待诱导表达完成，离心收集菌体，用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再用1/10发酵液体积的1×PBS缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下超声波破碎至菌液澄清，13000rpm/min离心10min收集上清，上清液即为多糖水解酶的粗酶液。 

实施例7 

重组菌诱导表达多糖水解酶粗酶液的SDS-PAGE 

制备15%SDS-PAGE胶，将粗酶液与5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴10min，每个点样孔上样10μL，120V电泳10min待条带进入分离胶后调高电压至160V，电泳60-65min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。立即停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液过夜染色，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见(如图5)。 

所述的15%SDS-PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为： 

分离胶：蒸馏水1.1mL，30%丙烯酰胺溶液2.5mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.3mL，10%过硫酸铵(APS)0.05mL，10%SDS溶液0.05mL，TEMED0.002mL； 

浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30%丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL， 10%过硫酸铵(APS)0.01mL，10%SDS溶液0.01mL，TEMED0.001mL； 

所述的5×SDS-PAGE Loading Buffer组分为：1M Tris-HCl(pH6.8)1.25mL，SDS0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL。小份分装(500μL)后与室温保存，使用前每小份加入β-巯基乙醇25μL。 

所述的考马斯亮蓝R-250溶液组分为：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。 

所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。 

Claims (5)

1.一种基于胞外多糖水解酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达胞外多糖水解酶的DH5α大肠杆菌；

所述的胞外多糖水解酶具体为β-1,4-胞外多糖水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的β-1,4-胞外多糖水解酶具有Sg-Hyd基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为714个碱基对，共编码237个氨基酸，切除前33个氨基酸信号肽序列后的成熟蛋白加入起始氨基酸M共205个氨基酸，分子量为22.0KD。

2.根据权利要求1所述的工程菌的实现方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1（CGMCC NO.5706）基因组DNA为模板进行PCR扩增；

正向引物Hyd-NdeⅠ-F:

5'-GGAATTCCATATGGCCGTCTGGAACTCCTGCGACCAGTGG-3'

反向引物Hyd-EcoRⅠ-R:

5'-GGAATTCTCAGCCGCCCGAGACGGTCAGGCTGTC-3'

2）构建具有Sg-Hyd基因的质粒：将步骤1得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到pET-30a质粒；

3）构建具有Sg-Hyd基因的表达载体；

4）将表达载体转化至大肠杆菌：将步骤3中得到的含有Sg-Hyd基因的表达载体质粒转入Transetta感受态细胞内，通过具有卡那霉素抗性和氯霉素的LB液体培养基进行筛选获得阳性克隆，即含有Sg-Hyd基因的工程菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶进行扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤3具体包括：

3.1)用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切处理含有Sg-Hyd基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有Sg-Hyd基因的片段；

3.2)用NdeⅠ和EcoRⅠ内切酶处理pET-30a质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；

3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg-Hyd基因的表达载体。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的克隆载体采用pEASY-Blunt SimpleCloning Vector。

Images