CN103822894A - 一种基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法：先收集多份进口鱼粉和国产鱼粉的样品，粉碎后过40目筛，采集扫描其近红外光谱，采用改进的偏最小二乘法建立定标模型，实现快速检测鱼粉中的牛磺酸含量。研究结果表明，近红外光谱分析方法可以方便快速测定鱼粉中牛磺酸的含量。该方法样品预处理简单、检测快速，对优化饲料配方，提高动物生长效率具有十分重要的意义。

Description

一种基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种利用近红外光谱法对鱼粉中的牛磺酸含量的检测方法。

背景技术

牛磺酸(Taurine)俗称牛胆碱，化学名2-氨基乙磺酸。分子量125.15，无毒，无臭，味微苦，对热稳定，在水中12℃时溶解度为0.5%，不溶于无水乙醇、***和丙酮，是一种游离氨基酸。牛磺酸在自然界中分布普遍存在于有机体内，动物体内的牛磺酸含量远高于植物。在海洋生物中含量最高。如鱼类的青花鱼、沙丁鱼、墨鱼、章鱼、贝类的牡蛎、海螺、蛤蜊等和虾中牛磺酸的含量都很丰富。牛磺酸能促进大脑发育，增强视力，调节神经组织的兴奋性，增加心肌收缩力，促进脂类物质的消化等作用。由于鱼粉是富含牛磺酸和蛋白质的重要饲料原料，弄清楚其牛磺酸含量，对于优化饲料配方、提高养殖效率具有十分重要的意义。

目前，牛磺酸的测定方法主要有分光光度法、荧光法、液相色谱法和薄层扫描法，氨基酸分析仪测定法等。分光光度法的检测灵敏度较低。荧光法对前处理要求比较高。液相色谱和氨基酸分析仪测定法检测成本高、耗时长不利于完成大批量的检测任务。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷，本发明的目的在于提供一种利用近红外光谱法简单快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法。

本发明提供一种基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法，包括以下步骤：

1).收集多份进口鱼粉和国产鱼粉的样品，粉碎后过40目筛；

2).用高效液相法测定步骤1)所述的鱼粉中牛磺酸的含量；

3).扫描步骤1)所述的样品近红外吸收光谱，每份重复2次，取平均值为吸收光谱值；

4).随机抽取步骤1)所述的一部分进口鱼粉和一部分国产鱼粉样品作为验证样品集，剩余鱼粉样品作为校正样品集，在近红外光谱仪分析软件中输入校正样品集样品对应的牛磺酸用高效液相法测定值，用改进的偏最小二乘法建立近红外光谱多元定标模型；利用软件中的自动优化功能进行自动优化，选出最佳光谱范围、最佳光谱预处理方式，利用最佳条件对模型进行交互验正均方根检验；

5).用步骤4)中所述的验证样品集鱼粉样品对定标方程进行外部验证；外部验证采用未参与定标，但样品性质与参与定标的样品性质相似的样品，通过比较这些未参与定标样品的预测值与HPLC值的差异来判断模型的预测准确性；

6).校正模型的评价参数

$R^2=1-\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{yi}-\mathrm{ym})}^2}---\left(1\right)$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{m}\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(2\right)$

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(3\right)$

R²为定标模型决定系数；

RMSECV为交互验证均方根；

RMSEP为预测均方根；

公式中Di表示第i个样品的HPLC值和预测值之差；

m为校正样品数；

yi为第i个校正样品HPLC值；

ym为m个校正样品预测值的平均值；

n为验证样品数；

R²=1则说明存在完全拟合，R²接近100%意味着预测浓度值接近真值，RMSECV和RMSEP分别用来评价模型的拟合能力和预测能力，决定系数越接近于1，RMSECV和RMSEP越小，说明模型的预测精度越高。

作为本发明的进一步限定，所述步骤4)中最佳光谱预处理方式是一阶导数，对应的最佳光谱范围为9403.6cm^-1-4246.6cm^-1。

具体地，所述步骤4)中作为校正样品集的进口鱼粉和国产鱼粉份数分别大于50个。

借由上述技术方案，可得出本发明所具有的优点和有益效果：

1、近红外光谱仪检测鱼粉中的牛磺酸含量的方法在国内外尚未见报道，该检测方法具有简单、耗时短等优点，定标模型建立后，NIR光谱完成1次测量只需约20秒，而HPLC完成一次测量至少需要40min。

2、近红外光谱分析方法可以方便快速测定鱼粉中牛磺酸含量，该方法对优化饲料配方，提高动物生长效率具有十分重要的意义。

附图说明

图1是本发明的基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法的流程示意图。

图2是本发明的鱼粉中的牛磺酸含量的近红外光谱图。

图3是本发明的基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法检验集预测值与真值相关关系散点图。

具体实施方式

术语定义

改进的偏最小二乘法：偏最小二乘法是一种数学优化技术，它通过最小化误差的平方和找到一组数据的最佳函数匹配。用最简的方法求得一些绝对不可知的真值，而令误差平方之和为最小。该方法也存在计算速度相对较慢、计算过程较繁，需要多次迭带，模型建立过程复杂，较抽象，难理解等缺点。改进的偏最小二乘法有利于剔除不相关或非线性变量，简化模型的同时提高模型的稳健性。

1.实验部分

1.1仪器

布鲁克MATRIX-I型近红外光谱仪

1.2实验方法

近红外扫描采用漫反射方式，光谱测试谱区范围：12000—4000cm^-1，光谱分辨率：16cm^-1，扫描次数：64次，以内置背景为参照，每份样品重复测定2次，取平均值为吸收光谱值。

1.3校正模型的评价参数

$R^2=1-\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{yi}-\mathrm{ym})}^2}---\left(1\right)$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{m}\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(2\right)$

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(3\right)$

R²为定标模型决定系数；

RMSECV为交互验证均方根；

RMSEP为预测均方根；

公式中Di表示第i个样品的HPLC值和预测值之差；

m为校正样品数；

yi为第i个校正样品HPLC值；

ym为m个校正样品预测值的平均值；

n为验证样品数；

1.4操作步骤

请参阅图1所示，收集258个鱼粉(进口鱼粉118个，国产鱼粉140个)，样品粉碎后过40目筛，随机抽取6个进口鱼粉和6个国产鱼粉样品作为验证样品集，剩余246个鱼粉样品作为校正样品集。注意此处的作为校正样品集的进口鱼粉和国产鱼粉份数要分别大于50个。用高效液相法检测258个鱼粉样品中牛磺酸的含量。

扫描该批鱼粉样品近红外吸收光谱，每份重复2次，取平均值为吸收光谱值，请参阅图2所示。在近红外光谱仪分析软件中输入校正样品集中样品对应的牛磺酸HPLC测定值，利用软件中的自动优化功能进行自动优化，选出最佳光谱范围、最佳光谱预处理方式，利用最佳条件对模型进行交互验正均方根检验。其中，最佳光谱预处理方式是一阶导数，对应的最佳光谱范围为9403.6cm^-1-4246.6cm^-1。

2.结果分析

2.1校正模型的建立

利用近红外光谱仪自带的OPUS软件，对校正样品集的全部光谱进行相互交叉验证检验模型稳健性，然后通过比较模型的决定系数(R²)来和交互验正均方根(RMSECV)来衡量模型的质量。决定系数(R²)越大，交互验正均方根(RMSECV)越小，模型质量越好。从表1可以看出，经过光谱处理后的各项指标都优于未进行光谱处理的结果集中体现在决定系数增大而交互验正均方根减小，由表1可以看出，一阶导数对校正模型的处理结果是最好的，对应的波数范围为9403.6cm^-1-4246.6cm^-1。

表1不同光谱预处理方法模型内部验证的决定系数交互验正均方根(RMSECV)值

同时对HPLC法和近红外光谱法进行t检验，t值为0.12，小于t_0.05=1.97，说明在0.05显著性条件下，两种方法不存在显著性差异，表明近红外光谱法和液相色谱法不存在***误差，进一步说明，所建的校正模型具有良好的预测能力，可以达到液相色谱法的精度要求。

2.2校正模型的验证

外部验证一般采用未参与定标，但样品性质与参与定标的样品性质相似的样品，通过比较这些未参与定标样品的预测值与HPLC值的差异来判断模型的预测准确性。本实验采用12个样品(6个进口鱼粉样品和6个国产鱼粉样品)作为检验集，下图3显示牛磺酸含量检验集预测值与真值相关关系散点图如下：预测模型决定系数(R²)为93.31%，预测均方根(RMSEP)为0.0442。建立的模型预测结果很好，能满足鱼粉中牛磺酸的检测精度要求。

另外参照国家标准GB/T18868-2002《饲料中水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸快速测定近红外光谱法》对蛋氨酸的允许偏差，当蛋氨酸含量≥0.5时，测定值与经典方法测定值之间的偏差绝对值<0.10；当蛋氨酸含量<0.5时，测定值与经典方法测定值之间的偏差绝对值<0.08。

表2NIR预测值与HPLC法测定值之间的绝对偏差

由表2的内容可以看出，本试验选取的12个验证样本中测定值与HPLC法测定值之间的绝对偏差值最高为0.0491，远远小于0.10，满足要求，进一步论证本方法可行。

3对未知鱼粉样品的测定

校正模型通过外部样品的验证后，可以直接用于未知鱼粉样品的检测，所有样品需要粉碎后过40目筛。在操作软件OPUSLAB界面下扫描未知鱼粉样品的近红外光谱，可以直接得到样品的牛磺酸含量预测结果。

预测结果是否能够保证准确，是本项技术的核心。当未知样品超出了校正模型的预测范围时，预测结果的准确性不能够保证，我们称这类超出模型预测范围的样品为异常样品。异常样品包括浓度异常样品（组分与建模样品一致，但浓度不在校正样品范围内）和光谱残差异常样品（组成组分与建模样品不一致），简单来说，就是不在校正样品的覆盖范围内。

在实际应用中，结合马氏距离和光谱残差可以识别出异常样品。未知样品的马氏距离大小代表着这个样品与建模样品相识程度，马氏距离越小，与建模样品越相似，预测结果准确性高；光谱残差是指样品光谱经过有效信息提取后，残留下来的差谱，光谱残差越多表明原光谱中包含了较多的无用信息，该样品可能含有未知组分。在建立定量模型过程中，OPUS软件会计算并设定校正模型的马氏距离（MD）阈值，如果未知样品的马氏距离超出了阈值，该样品为异常样品，软件会自动报警，将结果标红和打叉。另外OPUS应用光谱残差做F检验，当F概率（F值，1，M-1）〉0.99时，该样品会被识别为异常样品。日常工作中，未知鱼粉样品被识别为异常样品（标红、打叉），需要用HPLC法检测鱼粉中的牛磺酸含量，并将该样品加入定量模型中，以扩充模型的适用范围。

校正模型建立后，NIR光谱完成1次测量只需20S，而HPLC完成一次测量至少需要40min。完成12个鱼粉样品中的牛磺酸含量测定近红外光谱法半小时内可以完成，而用HPLC法需要一整天的时间才能完成。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种基于近红外光谱法快速检测鱼粉中牛磺酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1).收集多份的进口鱼粉和国产鱼粉的样品，粉碎后过40目筛；

2).用高效液相法测定步骤1)所述的鱼粉中牛磺酸的含量；

3).扫描该批样品近红外吸收光谱，每份重复2次，取平均值为吸收光谱值；

4).随机抽取步骤1)所述的一部分进口鱼粉和一部分国产鱼粉样品作为验证样品集，剩余鱼粉样品作为校正样品集，在近红外光谱仪分析软件中输入校正样品集样品对应的牛磺酸用高效液相法测定值，用改进的偏最小二乘法建立近红外光谱多元定标模型；利用软件中的自动优化功能进行自动优化，选出最佳光谱范围、最佳光谱预处理方式，利用最佳条件对模型进行交互验正均方根检验；

5).用步骤4)中所述的验证样品集鱼粉样品对定标方程模型进行外部验证；外部验证采用未参与定标，但样品性质与参与定标的样品性质相似的样品，通过比较这些未参与定标样品的预测值与HPLC值的差异来判断模型的预测准确性；

6).校正模型的评价参数

$R^2=1-\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(\mathrm{yi}-\mathrm{ym})}^2}---\left(1\right)$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{m}\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(2\right)$

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\left(\mathrm{Di}\right)}^2}---\left(3\right)$

R²为定标模型决定系数；

RMSECV为交互验证均方根；

RMSEP为预测均方根；

公式中Di表示第i个样品的HPLC值和预测值之差；

m为校正样品数；

yi为第i个校正样品HPLC值；

ym为m个校正样品预测值的平均值；

n为验证样品数R²=1则说明存在完全拟合，R²接近100%意味着预测浓度值接近真值，RMSECV和RMSEP分别用来评价模型的拟合能力和预测能力，决定系数越接近于1，RMSECV和RMSEP越小，说明模型的预测精度越高。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中最佳光谱预处理方式是一阶导数，对应的最佳光谱范围为9403.6cm^-1-4246.6cm^-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中作为校正样品集的进口鱼粉和国产鱼粉份数分别大于50个。

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