CN104502307A - 一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法，一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法，首先对待测样品进行匀浆处理，然后进行近红外光谱数据采集，最后与预先建立的长牡蛎糖原和蛋白质含量近红外模型进行比对，从而获取待测样品的测量值。本发明在对长牡蛎糖原和蛋白质含量分析过程，具有检验速度快、无需使用化学试剂、实验成本低、且对环境无污染的特点。长牡蛎糖原和蛋白质含量快速检测方法的建立，对开展长牡蛎肉质分析、肉质性状选育、育种世代的鉴定及种质资源评价都有非常重要的意义。

Description

一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法

技术领域

本发明涉及一种贝类营养成分的方法，具体地说，涉及一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法。

背景技术

长牡蛎（Crassostrea gigas）又称太平洋牡蛎，具有环境适应性强、生长迅速、营养丰富等优点，是产量最高的世界广布性大宗经济贝类。2012年我国牡蛎总产量达395万吨，居世界首位，为人们提供了丰富的蛋白源。

牡蛎不同的风味和营养品质影响着消费者的消费倾向，进而决定着其商品价值。随着生活水平的不断提高，人们对于牡蛎的消费，更加注重肉质的风味和营养，而牡蛎中糖原含量和蛋白质含量影响着其风味和营养品质，因此，选育口感佳、营养好的新品种是牡蛎高端市场的迫切需求。但是传统的糖原和蛋白质化学检测方法具有耗时长、效率低、检测成本高的缺点。因而，建立一种检验速度快的长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法是开展牡蛎肉质性状新品系选育的基础。

本发明在对长牡蛎糖原和蛋白质含量分析过程，具有检验速度快、无需使用化学试剂、实验成本低、且对环境无污染的特点。长牡蛎糖原和蛋白质含量快速检测方法的建立，对开展长牡蛎肉质分析、肉质性状选育、育种世代的鉴定及种质资源评价都有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法，该方法具有检验速度快、无需使用化学试剂、实验成本低、且对环境无污染的特点，应用前景广泛。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法，首先对待测样品进行匀浆处理，然后进行近红外光谱数据采集，最后与预先建立的长牡蛎糖原和蛋白质含量近红外模型进行比对，从而获取待测样品的测量值，其特征在于：所述的长牡蛎糖原和蛋白质含量近红外模型的建立包括如下步骤：

①对长牡蛎主产区进行周年取样，获取不同年龄、不同季节的长牡蛎样本数在50个以上；

②采集各个样品的近红外光谱，并将样本分为建模集样本和验证集样本；

③运用常规化学检测的方法检测样品中糖原和蛋白质的含量，获取各样品的化学真实值；

④通过偏最小二乘回归法将光谱信息与化学真实值信息进行拟合，建立糖原和蛋白质近红外分析模型，并检验模型的准确性和预测能力。

与现有技术相比，本发明在对长牡蛎糖原和蛋白质含量分析过程，具有检验速度快、无需使用化学试剂、实验成本低、且对环境无污染的特点，其应用前景广泛。长牡蛎糖原和蛋白质含量快速检测方法的建立，对开展长牡蛎肉质分析、肉质性状选育、育种世代的鉴定及种质资源评价都有非常重要的意义。

附图说明

图1为具体实施方式中长牡蛎鲜样组织所有样本的NIR漫反射原始光谱。

图2为具体实施方式中长牡蛎鲜样组织糖原含量样本NIR光谱一阶求导处理后的图谱。

图3A为具体实施方式中建模过程中水分含量NIR模型的参数指标（精确度高）。

图3B为具体实施方式中建模过程中糖原含量NIR模型的参数指标（精确度高）。

图3C为具体实施方式中建模过程中蛋白质含量NIR模型的参数指标（精确度高）。

图3D为具体实施方式中建模过程中牛磺酸含量NIR模型的参数指标（精确度低）。

具体实施方式

材料与方法

1.1 主要仪器设备

傅里叶变换NIR光谱仪(Antaris MX, USA)，配备RESULT^TM样本光谱采集的集成软件以及数据处理软件TQ analyst(Thermo Fisher, USA)，酶标仪(BIO-RAD, USA)、原子荧光光谱仪(PA-10)和微波消解***(Mars Xpress, USA)、高效液相色谱仪(Waters Inc., USA)、火焰原子吸收分光光度计(AA-800, USA)、自动凯氏定氮仪(FOSS kjeltec^TM 2300, Sweden)、索氏提取器、马福炉和大型真空冷冻干燥机(ZDGX5)，匀浆机(IKA^® T18 basic ULTRA-TURRAX^®，Germany)。

样本采集

在2012年11月至2013年10月期间，分别从山东乳山、芝罘岛、崆峒岛和刘公岛，辽宁东港和小山岛，江苏赣榆等长牡蛎主产区的7个地点，采集了54批野生和养殖的长牡蛎样品共计94份，样品鲜软体部肉重(不包含闭壳肌)为0.51g – 44.69g，样品包含了1龄贝、2龄贝和3龄贝。在不能辨别雌雄的季节，将同批样品分为最大个体和最小个体分为两组，作为极大值样本和极小值样本；在2013年5月-7月，根据雌雄不同，将同批样品分为雌雄两份样本。

样品前处理

将长牡蛎进行解剖，取软体组织，每份样本取20 - 60g，放置在50ml的冷冻离心管中。首先用剪刀将软组织剪碎，再用匀浆机在最大转速匀浆30 - 50s，匀浆过程中，将离心管置于冰盒中。将匀浆好的样本分为两部分：一部分用于NIR光谱采集，另一部分用于8种成分含量的化学测定分析。

近红外光谱采集

光谱扫描前，应用RESULT集成软件编定样品光谱采集的工作流程，并使光谱仪开机预热至少0.5 h。在直径1cm的石英杯中加入高度为1.5cm匀浆好的样本。采用漫反射光谱，光谱扫描范围10000﹣4000 cm^-1，扫描次数为32 次，分辨率为8 cm^-1，测量时环境温度为20 ℃，相对湿度为10 %。每次采集样品前采集背景光谱来消除背景的影响，测量时间小于1 min。

化学真实值测定

在山东省海洋资源与环境研究院中心实验室对94份样本的8种成分含量的化学真实值的进行了测定。蛋白质、总脂肪、锌、硒和灰分含量的测定依据行业标准进行(GB 50095-2010，GB/T 14772-2008，GB/T 9695.20-2008，GB 500993-2010和GB/T 9695.18-2008)；牛磺酸含量的测定参考陈申如(2013)；糖原含量测定使用EnzyChrom^TM糖原试剂盒(BioAssay Systems, USA)。

模型建立和验证

利用TQ Analyst (version 9, USA) 软件处理采集的光谱数据，选用偏最小二乘法(Partial Least Squares, PLC)作为建立定标模型的化学计量方法，选择软件自动推荐的光谱范围，并对模型进行优化和检验，筛选最佳的光谱预处理方法，以确保获得了数理指标最理想的数学模型。本实验中94份样品的建模集和验证集的样本数见表1。检验模型采用内部交叉检验，即每次从建模样品集中依次剔除1个样品，用剩下的样品建立模型预测被剔除的1个样品，使所有样品都被剔除并预测过。主要通过比较预测值与化学分析值的相关系数(R)、交互验证残差均方根(Root mean square error of cross-validation, RMSECV)、预测残差均方根(Root mean square error of external prediction, RMSEP)和RPD(验证用样本真实值的标准差(SD)与RMSECV或者RMSEP的比值，即RPD_CV =SD/RMSECV或者RPD_EV =SD/RMSEP)等指标来衡量定标模型的准确性。由于光谱仪的***误差、光谱信号的漂移等原因，所测得样品的NIR可能出现异常，使得模型预测精度下降(陈雪英等，2009)，本实验采用TQ Analyst软件中马氏距离来判别异常点，进行样本异常值的剔除。

结果

2.1 长牡蛎鲜样组织 8 种成分含量指标描述性统计

本实验在我国多个长牡蛎产地选取不同发育阶段、不同养殖方式和不同年龄的94份样品，超过Windham(1989)所提出的最低样本数为50份的要求。表1为8种不同成分建模集和验证集样本的数目和化学真实值的分析结果。实验中分析的各种成分含量范围较大，含量最大值与最小值的比值分别为：水分(1.23)，糖原(80.63)，蛋白质(3.20)，总脂肪(33.74)，牛磺酸(3.28)，锌(5.55)，硒(4.97)和灰分(2.51)，符合近红外分析模型建立过程中对样品含量分布范围广的要求。

表1. 长牡蛎鲜样组织建模集和验证集样本8种成分含量

注：N是样本的数量；SD_C是建模集的标准偏差；SD_V是验证集的标准偏差。

光谱数据预处理

长牡蛎鲜样组织样本的NIR漫反射原始光谱如图1所示。建模过程中对不同成分的光谱数据进行不同的平滑处理，最终选择适合各自成分模型的最佳参数组合。根据筛选出的最佳参数组合，确定长牡蛎鲜样组织水分，糖原，蛋白质，总脂肪，牛磺酸，锌，硒，灰分的预测模型。各成分含量模型所用的光谱范围、光谱处理方法以及建模用的主因子数等主要参数见表2。

模型建立及优化

根据TQ Analyst软件的推荐，将不同成分含量样本异常值剔除。样本各成分含量建模的结果中，水分、糖原和蛋白质含量的相关系数(R_C )较高，均大于0.96，其RMSEC值均较小(图3. A, B, C)；交叉验证相关系数(R_CV )和外部验证的相关系数(R_EV )较高，均大于0.93，其RMSECV值和RMSEP值也较小；模型验证的重要参数RPD值变化范围为2.80-7.04，说明水分、糖原和蛋白质含量的模型精确度高，可用于长牡蛎鲜样组织的成分预测。另一方面，总脂肪、牛磺酸、锌、硒、灰分含量等5个成分，建模过程中的R_C 值和RMSEC值等参数均不理想(图3. D)；交叉验证和外部验证的相关系数(R_CV 和R_EV )均低于0.85，RPD值除Zn含量以外都低于2.5。综合考虑多个衡量指标，总脂肪、牛磺酸、锌、硒、灰分等5个成分含量的NIR模型不适合于长牡蛎鲜肉组织的精确定量分析。

表2. 长牡蛎成分含量建模集和验证集光谱数据处理参数

^a一阶导数

^b Norris导数过滤器

^c波段长

^d波段之间的差距

^e过滤器

^f数据点

^g多项式次方

^h二阶导数

3 讨论

3.1 鲜样本模型与干样本模型的比较

本实验在建立长牡蛎鲜样组织NIR模型的同时，建立了长牡蛎冷冻干燥样本的NIR模型，鲜样组织和粉末样品两种不同处理形态的建模效果存在差异。其中，粉末样品模型结果显示，糖原和蛋白质含量模型可以精确的预测未知样本的含量，总脂肪、锌、硒、灰分含量可准确的预测未知样本的含量，只有牛磺酸含量模型的预测效果不好(未发表数据)。长牡蛎鲜样组织和粉末样品两个实验结果中，糖原和蛋白质含量建模效果一致，均可以精确的预测未知样品；牛磺酸含量模型在两个实验中均不能准确的预测未知样品；而鲜样组织的脂肪、锌、硒和灰分含量的模型却不能准确预测。Viljoen et al. (2005, 2007)在对鸵鸟肉和羊肉鲜样组织和冷冻干燥样品研究过程中发现，冷冻干燥样品模型的预测效果更好。对冷冻干燥样品进行光谱分析时，样品温度变化不明显；而且冷冻干燥样品可以避免在红外光谱区域的非常高的吸收峰(Murray & Williams, 1987)，这些噪音可能降低模型预测的准确性(Pedersen et al. 2003)。由于长牡蛎鲜样组织中水分含量高(约80%)，导致光谱采集过程中温度变化的不确定性，这可能是导致建模不成功的主要原因。

模型建立过程中的主要参数标准

在构建的模型中，建模相关系数(R_C )、交互验证相关系数(R_C )和外部验证相关系数(R_C )值越接近1模型的预测效果越好，在本实验中，各个相关系数都在0.93以上，最高值是0.99，说明模型的精确度非常高。同时模型的RPD值是衡量模型是否准确的另一个重要指标，好的模型具有高的RPD值。当RPD值大于2.5时模型可以进行准确预测(Zhou et al., 2012; Guy et al. 2011)。在本实验中虽然锌含量预测模型的RPD值超过10，但不论是其R _C值、R _CV值还是R _EV值均小于0.52，综合考虑各个个指标，锌含量的NIR模型不具备准确预测的能力。

牛磺酸是一种游离氨基酸，属于有机物，理论上通过建立NIR模型，可以准确的预测未知样本的含量。但是本实验中牛磺酸含量模型预测效果差，分析原因可能是牛磺酸化学真实值的SD值小(Zhou et al., 2012)，变动范围窄(Prieto et al., 2009)所致。

模型建立对肉质性状选育的意义

本实验结果将用于长牡蛎肉质性状选育、育种世代的鉴定及种质资源评价等研究。这些方面的研究需要对几千个个体、多个指标进行成分含量的分析，因此常规的化学分析方法难以快捷、高效批量的完成这些分析工作。课题组将运用本实验结果对构建的长牡蛎家系进行成分含量分析，进行遗传参数估计和育种值估计，为开展肉质性状选育奠定基础。

结论

NIR技术可以快速精确地测定长牡蛎鲜肉组织中的水分、糖原和蛋白质3种成分含量，但是对总脂肪、锌、硒、牛磺酸和灰分含量不能准确测量。本研究中建立的以上3种成分含量NIR模型，可快速、准确、无环境污染地对长牡蛎肉质分析、肉质性状选育及育种世代的鉴定和种质资源评价都有非常重要的意义。

Claims (1)

1.一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法，首先对待测样品进行匀浆处理，然后进行近红外光谱数据采集，最后与预先建立的长牡蛎糖原和蛋白质含量近红外模型进行比对，从而获取待测样品的测量值，其特征在于：所述的长牡蛎糖原和蛋白质含量近红外模型的建立包括如下步骤：

①对长牡蛎主产区进行周年取样，获取不同年龄、不同季节的长牡蛎样本，样本数在50份以上；

②采集各个样品的近红外光谱，并将样本分为建模集样本和验证集样本；

③运用常规化学检测的方法检测样品中糖原和蛋白质的含量，获取各样品的化学真实值；

④通过偏最小二乘回归法将光谱信息与化学真实值信息进行拟合，建立糖原和蛋白质近红外分析模型，并检验模型的准确性和预测能力。