CN102482656A

CN102482656A - 具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶

Info

Publication number: CN102482656A
Application number: CN2009801434772A
Authority: CN
Inventors: C·希尔; J·拉维尼; M·惠赛尔; J·托马斯黑克
Original assignee: Iogen Energy Corp
Current assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2012-05-30
Also published as: AU2009287325A1; WO2010022518A1; EP2329016A4; US20100093040A1; US8143049B2; CA2735271A1; EP2329016A1; MX2011002142A; BRPI0918823A2

Abstract

本发明提供源自里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的经修饰的β-糖苷酶，所述修饰的β-糖苷酶在低pH、低pH和高度充气、低pH和强烈搅动或者在低pH和高温的条件下具有提高的稳定性。本发明还提供了包含编码经修饰的β-糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，用于从宿主菌株中经经生产修饰的β-糖苷酶的方法和所述修饰的β-糖苷酶用于水解纤维素的用途。

Description

具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶

技术领域

该发明涉及经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)β-糖苷酶。本发明更具体地涉及具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。本发明还涉及包含编码经修饰的β-糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体、用于从宿主菌株中生产经修饰的β-糖苷酶的方法，以及经修饰的β-糖苷酶用于水解纤维素和化合物生产(如用于医药和食品工业中的那些化合物)的用途。

背景技术

β-糖苷酶包括糖基水解酶家族1和3的成员，所述成员的基本酶功能是水解纤维二糖或可溶性纤维糊精中连接糖残基的β-糖苷键。一些β-糖苷酶对纤维二糖或芳基糖苷是特异的，这些被表征的β-糖苷酶中的大部分具有较宽的特异性并且可以水解多种底物(Bhatia et al，2002)。在一些条件下，这些酶还可以通过逆反应或通过转糖基作用催化糖苷键的合成(Sinnott，1990)。该类酶的水解和合成能力可用于生物技术应用。

β-糖苷酶的水解活性的一个主要应用是减轻纤维素酶***的产物抑制。纤维二糖——纤维素水解的主要产物——强烈地抑制纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)的活性。加入足量的β-糖苷酶以水解纤维二糖成为葡萄糖，葡萄糖抑制性减弱，使得在较高程度的底物转化基础上获得显著的活性增长(US 6,015,703)。

Bhatia等(2002)已经综述了β-糖苷酶的很多其他生物技术应用。依赖于其水解活性的应用实例包括医药上重要的化合物从类黄酮和异类黄酮(isoflavanoid)糖苷中释放，和果汁和酒中芳香化合物的释放(US 6,087,131)。合成活性的典型用途是生产用作去污剂的烷基-糖苷(Ducret et al.，2002)。

糖基水解酶——包括β-糖苷酶——的活性依赖于所述酶的活性位点中催化氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)具体的质子化状态，所述状态受到pH影响。例如，来自里氏木霉的β-糖苷酶I在5.0-5.5的pH范围内最活跃，但在更酸性或者更碱性的条件下活性急剧下降(Woodward and Arnold，1981)。

蛋白质活性和稳定性的pH依赖性不一定有关系。酸性或碱性条件的去稳定作用是由于氨基酸侧链的质子化或去质子化，所述氨基酸侧链可能不是催化性的或者甚至不在活性位点附近。pH依赖的变性主要是由于天然和变性状态下特定氨基酸侧链的不同pK_a值，这将pH依赖性引入状态间的自由能差异。此外，蛋白质在极端pH下可以变得高度荷电并且分子间静电排斥增强(Fersht，1998)。

pH最适值改变的工程酶在新的pH下不一定能长时间稳定。已使一些糖苷水解酶发生突变以改变它们在对工业应用重要的pH值下的活性或稳定性。对于淀粉加工应用，对来自地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)的α-淀粉酶进行工程改造以包括两个氨基酸替换，M15T和N188S，这将其低pH(5.2)活性增加至野生型的140％(美国专利No.5,958,739)。第三个突变H133Y的加入进一步将活性增加至所述双突变体的150％以上。由合理设计方法鉴定到，杆菌内切葡聚糖酶中一个环的替换将其pH最适值转变以用于纺织品应用。用Ala-Gly-Ala替换，pH最适值上移了超过1个pH单位(美国公开文本No.2005/0287656)。另外一个实例是将氨基酸替换A162P和W62E纳入特异腐质霉(Humicola insolens)的Cel45内切葡聚糖酶。这些突变将碱性条件(pH 10)下的活性增加至野生型的124-144％(美国专利No.5,792,641)。最后一个实例，通过加入替换N10H、N11D、Y27M和N29L的多种组合显著提高了重组木霉木聚糖酶在超过5.5的pH下的活性(US 5,866,408)。

很少有经工程改造的β-糖苷酶的报道，尽管有调整这些酶的性质的诱变的报道。例如，曲霉属(Aspergillus)β-糖苷酶四倍突变体A16T/G142S/H226Q/D703G的热稳定性增加，从而使得它在65℃下孵育1小时后保持其活性的约50％而野生型变体仅能保持0-5％。该酶的构建使用了随机诱变、位点饱和和改组(shuffling)的结合(美国公开文本No.2004/013401)。里氏木霉β-糖苷酶I的位点43、101、260和543中一个或多个位点的氨基酸置换产生了具有增加的催化效能的经修饰β-糖苷酶(美国临时申请No.61/182,275)。发现以下突变对于增加里氏木霉β-糖苷酶I的催化效能特别有利：V43I、V43C、V101A、V101G、F260I、F260V、F260Q、F260D、I543N、I543W、I543A、I543S、I543G和I543L。

还注意到具有改变的pH稳定性特征的酶不一定需要具有改变的pH最适值来适于利用。例如，用于表达酶的细胞培养物的pH可不同于所述酶在其作为生物催化剂的应用中的预期工作pH。如果所述酶的稳定性在所述表达pH下被损害，酶活性的总收率将会下降。这已在用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的里氏木霉β-糖苷酶中观察到(Cummings and Fowler，1996)。观察到无缓冲剂的表达培养基随着时间变得更酸，从pH 6.0降至2.0-3.0；该pH下降与β-糖苷酶活性的急剧下降相关。

由混合所述细胞培养物引起的水力剪切使不稳定进一步加重，特别是由充气引起的气-液界面存在的情况下(Weijers and Van′t Riet，1992；Elias and Joshi，1998)。通过生产后加工过程——如超滤——中或者其最终应用中存在的剪切应力可进一步灭活一些酶。

糖基水解酶的剪切灭活在以下文献中已有记录：Jones和Lee(1988)描述了在包含高速叶轮的反应器***中里氏木霉纤维素酶混合物的灭活，但仅在空气存在的情况下；Sachse等人(1990)报道称与常规搅拌反应器相比在低剪切搅拌反应器中生产的里氏木霉纤维素酶有较高的比活；Reese(1980)也报道通过在水解中摇动灭活里氏木霉纤维素酶，并且观察到通过使用表面活性剂可改善所述作用；最后，Gunjikar等人(2001)报道了外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-糖苷酶在混合式反应器中的灭活，灭活的严重程度与使用的混合能成比例。

发明内容

本发明涉及经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。本发明更具体地涉及具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。

本发明的一个目的是提供具有提高的稳定性的β-糖苷酶的变体。

本发明提供在低pH、低pH和强烈搅动、低pH和强烈搅动或者低pH和高温的水性溶液中具有提高的稳定性的修饰β-糖苷酶。本发明的β-糖苷酶可用于需要在低pH和高度充气或强烈搅动的条件下(如微生物发酵中)或者低pH和高温条件下(如通过酶水解有纤维素原料来生产可发酵糖)保持活性的工业方法中。

本发明具体地涉及通过在所述β-糖苷酶I或TrCel3A序列(SEQID NO：1)的66、72、101、235、248、369和386位点中的一个或多个位点进行氨基酸置换来生产经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。发明人发现对这些位点中的一个或多个位点处的天然氨基酸的置换使得所述β-糖苷酶在低pH、低pH和高温、低pH和强烈搅动或低pH和高度充气的水性溶液中的稳定性提高至少2倍，例如约2倍至约500倍。

所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可衍生自亲本TrCel3Aβ-糖苷酶，所述亲本TrCel3Aβ-糖苷酶除了对66、72、101、235、248、369和386位点中一个或多个位点处天然氨基酸的置换之外，在其他方面与所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶相同。此外，所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可包含除66、72、101、235、248、369和386位点之外的位点处的额外氨基酸置换，前提是这些额外的氨基酸置换也存在于相应的亲本TrCel3A中。所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的额外氨基酸置换。

本发明的所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶表现出与SEQ ID NO：1的天然TrCel3A约80％至约99.9％的氨基酸序列同一性。例如，所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶表现出与SEQ ID NO：1的天然TrCel3A约90％至99.9％的氨基酸同一性，或与SEQ ID NO：1的天然TrCel3A约95％至99.9％的氨基酸同一性。

此外，如上定义的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶在以下条件的水性溶液中表现出稳定性提高至少2倍，例如提高约2倍至约500倍，所述条件为：(a)约pH 2至约4.5；(b)约pH 2至约4.5，以约0.1至约100cm/s或约0.5至5vvm的表观气速(superficial gas velocity)充气；(c)约pH 2至约4.5，并且通过以约300至约1000rpm的摇动来搅动；(d)约pH 2至约4.5，并且通过以约0.5至约10m/s的外缘速度通过叶轮搅拌来搅动；(e)约pH 2至约4.5，在以约0.2至约15hp/100加仑搅动的生物反应器中；或(f)约pH 2至约4.5，温度为30℃至60℃。

本发明还涉及选自以下的经修饰的TrCel3A：

TrCel3A-V66I(SEQ ID NO：2)；

TrCel3A-S72N(SEQ ID NO：3)；

TrCel3A-V101M(SEQ ID NO：5)；

TrCel3A-T235S(SEQ ID NO：6)；

TrCel3A-N248K(SEQ ID NO：7)；

TrCel3A-N369K(SEQ ID NO：8)；

TrCel3A-A386T(SEQ ID NO：9)；

TrCel3A-V66I-S72N(SEQ ID NO：10)；

TrCel3A-S72N-F96L-V101M(SEQ ID NO：11)；

TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K(SEQ ID NO：12)；

TrCel3A-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO：13)；

TrCel3A-V66I-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO：14)；

TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO：15)；

TrCel3A-V66I-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO：16)；

TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO：4)；和

TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T(SEQ ID NO：55).

本发明还涉及到指导所述经修饰TrCel3A从宿主微生物中表达和分泌的基因构建体，所述宿主微生物包括但不局限于里氏木霉菌株。

本发明的基因构建体包含编码经修饰的TrCel3A的核酸序列，所述经修饰的TrCel3A与SEQ ID NO：1具有约80％至约99.9％同一性，并且包含在66、72、101、235、248、369和386位点中一个或多个位点处的氨基酸置换，所述氨基酸序列有效连接至调节其从宿主微生物中表达和分泌的核酸序列。例如，调节所述经修饰的TrCel3Aβ-核苷酶的表达和分泌的核酸序列可来自用于表达所述经修饰的TrCel3Aβ-核苷酶的宿主微生物。所述宿主细胞可以是酵母，如酿酒酵母，或者是丝状真菌，如里氏木霉。

本发明还涉及到如上定义的基因构建体，其中由所述基因构建体编码的所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶还包含除在66、72、101、235、248、369和386位点之外的位点处的氨基酸置换。由所述基因构建体编码的所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。

本发明还涉及到包含基因构建体的基因修饰微生物，所述基因构建体编码所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶，所述基因修饰微生物能够表达和分泌经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶，所述修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶表现出与SEQ ID NO：1具有约80％至约99.9％的氨基酸序列同一性并且包含在66、72、101、235、248、369和386位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。所述基因修饰的微生物能够表达和分泌经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶，所述TrCel3Aβ-糖苷酶还包含除在66、72、101、235、248、369和386位点之外的位点处的额外氨基酸置换。由所述基因修饰微生物表达和分泌的所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的额外氨基酸置换。所述基因修饰微生物可以是酵母或丝状真菌。例如，所述基因修饰的微生物可以是酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)或链孢霉属(Neurospora)的种。

本发明还涉及如上所定义的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶在水解反应中的用途，所述水解反应包括纤维素底物和包含所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的纤维素酶混合物。

本发明还涉及生产如上定义的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的方法，包括用基因构建体转化酵母或真菌宿主，所述基因构建体包含编码所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的核酸序列；选择表达所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的重组酵母或真菌菌株；在诱导所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶表达的条件下通过深层液体发酵培养所选择的重组菌株；并通过分离培养物滤出液和宿主微生物回收所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。

本发明的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可用于需要在低pH、低pH和高度充气的结合、低pH和强烈搅动的结合或者在pH和高温的结合下的稳定性的工业中的各种应用。例如，如本文描述的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶可用于将木质纤维素底物转变为可发酵糖以生产乙醇或其他产物的工业方法或微生物发酵方法中。

附图说明

图1描绘了指导由重组酿酒酵母表达和分泌天然和经修饰的TrCel3A的质粒载体YEp352/PGK91-1/α_ss6H-TrCel3A。

图2描绘了指导由重组里氏木霉表达和分泌经修饰的TrCel3A的质粒载体pc/xCel3A-AT003-pyr4。

图3示出了野生型TrCel3A的灭活为pH和温度的函数。(A)在30℃或50℃下，轻微摇动(200rpm)的pH 3.0、4.0或5.0的水性溶液中残余β-糖苷酶活性对孵育时间的图。(B)在30℃和pH 3.0或pH 5.0的水性溶液中残余β-糖苷酶活性对孵育时间的图：所述水性溶液在无挡板烧瓶(unbaffled flask)中轻微摇动(200rpm)；在有挡板烧瓶(baffled flask)中以200rpm摇动(“摇动”)；或者在无挡板烧瓶中机械搅拌(“搅拌”)。

图4为分别在pH 3.5和pH5.0下预孵育后的残余酶活性的散点图。所述数据涉及对包含亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的96孔培养板的筛选。所述亲本TrCel3A数据通过线性回归拟合，其中使得y轴截距固定为零。

图5示出了在pH 3.0和30℃下，在有挡板烧瓶中以400rpm摇动0至30小时的亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的灭活。这些测定中TrCel3A的浓度为4.8-10.8μg/mL，并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。

图6是灭活常量τ(单位为h)对亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的残余活性的图。将野生型的活性设定为1.0并将所有的变体相对于该值进行比较。数据代表三次平行试验的平均值，单个测定的N248K除外，并且误差棒代表+/-1个标准偏差。

图7描绘了在pH 3.0和30℃下，在有挡板烧瓶中以400rpm摇动0至100小时的亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的灭活。这些测定中的TrCel3A的浓度为4.8-10.8μg/mL，并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。

图8描绘了在pH 3.0和30℃下，在有挡板烧瓶中以400rpm摇动0至300小时的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的灭活。这些测定中的TrCel3A的浓度为4.8-10.8μg/mL，并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。

图9描述了亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的相对稳定性。将在纤维素酶混合物中所述亲本TrCel3A和聚集体经修饰的TrCel3A-AT003β-糖苷酶(aggregate modified TrCel3A-AT003beta-glucosidase)的纤维二糖酶比活(在pH 5.0下测量)表示为比率，所述纤维素酶混合物是在pH 3.0或pH 5.0下并且在28℃下进行165个小时的试验性里氏木霉发酵中产生的。1.0的比率表明β-糖苷酶在pH 3.0和pH 5.0下同样稳定；较低的值表明相对于pH 5.0在pH 3.0下的稳定性降低。误差棒代表一个标准偏差。

图10描绘了亲本和经修饰的β-糖苷酶在可用于纤维素水解的条件下的稳定性。在pH 3.0、3.5、4.0或5.0下，在50或60℃下孵育纤维素酶混合物中的亲本和经修饰的β-糖苷酶。在所示时间从酶中取出样本并在pNPGase分析中进行测试。将一阶指数式衰减模型拟合至所述数据以确定每种酶在每组条件下的平均寿命。将所有数据标准化为由所述模型确定的初始活性的最佳拟合值，并且相对于此最初活性绘制灭活曲线。

图11显示了包括TrCel3A——一个家族3β-糖苷酶共有序列——在内的45个真菌家族3β-糖苷酶的氨基酸序列比对，以及每个氨基酸序列对TrCel3A的氨基酸序列的序列同一性百分数。在所比对的序列下面示出了在45个真菌家族3β-糖苷酶之中，图11的家族3β-糖苷酶共有序列的每个位点处氨基酸出现频率的代表图。

具体实施方式

本发明涉及经修饰的β-糖苷酶。本发明更具体地涉及在低pH、低pH和高度充气、低pH和强烈搅动或者低pH和高温的水性溶液中具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶I(下文称为TrCel3A)，所述提高的稳定性是相对于作为其来源的亲本TrCel3A来说的。本发明还涉及到包含编码经修饰的TrCel3A的核苷酸序列的基因构建体、从宿主菌株中生产所述经修饰的TrCel3A的方法和所述经修饰的TrCel3A用于减轻纤维素水解中对纤维素酶的产物抑制的用途。本发明还涉及到所述经修饰的TrCel3A用于催化其他化合物的生产的用途，所述化合物包括但不局限于来自医药或食物工业的化合物，所述生产是通过水解、逆水解或转糖基作用完成。

以下说明是仅通过举例方式的优选实施方案并且不局限于实现本发明所必需的特征的结合。

经修饰的β-糖苷酶

术语“β-糖苷酶”是指归类至EC3.2.1.21并且在氧亲核体之间转移糖基基团(通常导致芳基-β-糖苷、氨基-β-糖苷、烷基-β-糖苷、生氰糖苷、短链寡糖和二糖中连接糖类残基的β-糖苷键水解)的酶。在包含超过2个糖苷的寡糖中，β-糖苷酶的活性随着链长的增加而下降。β-糖苷酶通过双取代反应水解β-1，4-糖苷键，导致端基异构构型的净保留。两个酸性氨基酸——天冬氨酸(D)和/或谷氨酸(E)直接参与底物催化。这些残基中的一个起亲核体的作用并且形成酶-糖基中间体。另外一个酸性残基作为酸碱催化剂起作用。在其氨基酸序列以SEQID NO：1表示的所述里氏木霉β-糖苷酶1(下文称为TrCel3A)中，在位点236处的天冬酰胺作为亲核体而位点447处的谷氨酰胺是酸碱催化剂。

β-糖苷酶是属于糖基水解酶(GH)家族1和3的β-糖苷酶的亚类，使用Henrissat和合作者开发的分类***(Henrissat，B.(1991)；Henrissat，B.and Bairoch，A.(1996))。目前使用该分类***已经鉴定出了115个GH家族，这登记在糖类活性酶(Carbohydrate ActiveEnzyme，CAZy)数据库中(参见URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html用于参考)。家族1包含来自古细菌、植物和动物的β-糖苷酶。来自一些细菌、霉菌和酵母的β-糖苷酶属于家族3。就本发明的目的而言，“β-糖苷酶”因此定义为被分类至EC 3.2.1.21中并且被归类为CAZy***的家族3糖基水解酶的任何蛋白质。

β-D-葡聚糖外切水解酶——一个家族3糖基水解酶——的三维结构由Varghese等(1999)描述。所述结构为两结构域球状蛋白，包含N-末端(α/β)₈TIM-筒结构域和C-末端6-链β-夹层，所述C-末端6-链β-夹层包含5条平行β链和一条反平行β链的β片层，并且在所述片层的任一侧有3个α-螺旋。该结构很可能与其他家族3酶所共有。

如图11所示，家族3β-糖苷酶的一级氨基酸序列显示出高度相似性。45个家族3β-糖苷酶氨基酸序列之间的多重对比显示，大部分天然存在的真菌起源的家族3β-糖苷酶显示出与TrCel3A的氨基酸序列的约40％至约100％的氨基酸同一性(图11)。特别是在家族3β-糖苷酶内有一些具有高度氨基酸序列保守的区域，包括，例如氨基酸225-256和439-459，分别包含催化氨基酸D236和E447。

“TrCel3A”是指由SEQ ID NO：1中氨基酸序列限定的由里氏木霉产生的家族3糖基水解酶。TrCel3A还被称作里氏木霉β-糖苷酶或BGL1。“天然”或“野生型”TrCel3A是指没有任何氨基酸置换的SEQID NO：1的TrCel3A。“经修饰的TrCel3A”是指包含一个或多个氨基酸置换的TrCel3A，所述氨基酸置换是由基因工程技术引入，选自V66X(即位点66的Val由任意氨基酸X置换)、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X、A386X。用于改变氨基酸序列的基因工程技术包括但不局限于定点诱变、盒式诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建、克隆和本领域技术人员可知的其他基因工程技术(Eijsink VG，et al.2005)。应理解，经修饰的TrCel3A可来自于野生型TrCel3A或来自已经包含其他氨基酸置换的TrCel3A。本发明的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶包括那些在以下位点包含氨基酸置换的TrCel3Aβ-糖苷酶：在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任一位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意两个位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意三个位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意四个位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意五个位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意六个位点；或者在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的所有七个位点。

应理解，所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可以来自野生型TrCel3Aβ-糖苷酶或来自于包含其他氨基酸置换的TrCel3Aβ-糖苷酶。例如，所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。或者，在生产包含在66、72、101、235、248、369和386位点中一个或多个位点处的突变的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶之后，随后进一步对它进行修饰以包含额外的氨基酸置换，所述额外的氨基酸置换包括但不局限于上述那些。

关于经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶氨基酸序列，本文使用的“来源自”是指使用针对相应亲本TrCel3Aβ-糖苷酶的遗传材料或核酸或氨基酸序列信息分离编码所需经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的目的核酸序列元件。如本领域技术人员所知的，这样的材料或序列信息可用于通过使用一种或多种分子生物学技术产生编码所需经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的核酸序列，所述分子生物学技术包括但不局限于克隆、亚克隆、通过PCR扩增、体外合成等。

在本发明的第一个实施方案中，如上所定义的经修饰的TrCel3A显示出与SEQ ID NO：1约80％至约99.9％的氨基酸序列同一性，或者其间的任意量的同一性。例如，所述经修饰的TrCel3A可显示出与SEQ ID NO：1约90％至约99.9％的氨基酸序列同一性或与SEQ IDNO：1约95％至约99.9％的氨基酸序列同一性。比对氨基酸序列的方法为本领域技术人员所熟知并且包括可用于对比两个序列的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，参见URLblast.ncbi.nlm.nihh.gov/Blast.cgi；Altschul et al.，J.MoI.Biol.215：403-410，1990)和用于对比两个或多个序列的CLUSTALW(参见URL：ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)。序列同一性还可通过人工对比和肉眼检查来确定。

在本发明的其他实施方案中，所述经修饰的TrCel3A表现出与SEQ ID NO：1约80％至约99.9％的氨基酸序列同一性，和在以下条件的水性溶液中具有至少2倍的稳定性提高，所述条件为：(a)约pH 2至约4.5；(b)约pH 2至约4.5，以约0.1至约100cm/s的表观气速充气；或(c)约pH 2至约4.5，并且通过以约300至1000rpm的摇动来搅动；(d)约pH 2至约4.5，并且通过以约0.5至约10m/s的外缘速度通过叶轮搅拌来搅动；(e)约pH 2至约4.5，在以约0.2至约15hp/100加仑搅动的生物反应器中；或(f)约pH 2至约4.5，温度为30℃至60℃。

“亲本TrCel3A”是指不包含对其66、72、101、235、248、369或386位点处原始氨基酸的一个或多个置换并且在其他方面与所述经修饰的TrCel3A相同的TrCel3A。这样，所述亲本TrCel3A可包含在多至116个(即582个氨基酸的20％)其他位点处的氨基酸置换，所述氨基酸置换可由基因工程或其他技术引入。例如，所述亲本TrCel3A可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。

为了帮助本领域技术人员注意到可以在其处制造氨基酸置换(非V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X)并且产生活性β-糖苷酶的TrCel3Aβ-糖苷酶的那些氨基酸位点，在图11中提供了对来自真菌来源的45个家族3β-糖苷酶与由以最高频率天然出现在每个位点处的氨基酸组成的β-糖苷酶共有序列的比对，以及显示所述共有序列的每个氨基酸在每个位点出现频率的图。使用图11提供的信息，本领域技术人员将识别出对其他家族3β-糖苷酶低序列保守性的区域。这样的区域的非限制性实例包括，例如位点1-20、303-323和403-414之间的区域，和这些区域中选出的氨基酸位点。

如本文所更详细地描述的，已经制备了一些在低pH和搅动的条件下表现出稳定性增加的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。不应被认为以任何方式限制的一些突变体的表在表1中示出。

表1：具有增加的稳定性的TrCel3Aβ-糖苷酶

新突变体：TrCel6A-S413P	SEQ ID NO：
		TrCel3A-V66I	2
TrCel3A-S72N	3
		TrCel3A-V101M	5
TrCel3A-T235S	6
		TrCel3A-N248K	7
TrCel3A-N369K	8
		TrCel3A-A386T	9
TrCel3A-V66I-S72N	10
		TrCel3A-S72N-F96L-V101M	11
TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K	12
		TrCel3A-S72N-V101M-N369K-A386T	13
TrCel3A-V66I-S72N-V101M-N369K-A386T	14
		TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T	15

TrCel3A-V66I-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T	16
		TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T	4
TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T	55

具有提高的稳定性的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。

酶功能灭活是通过确定灭活速率常数k_i测量的，k_i是方程式A_t/A₀＝e^-ki·t中确定酶活性即时下降率的参数，其单位为反比时间，其中A_t是t时的活性而A₀是所述***的初始活性。该参数可通过取k_i的倒数被等效地表示为τ，τ是给定酶的平均活性寿命；或者通过用2的自然对数乘以τ表示为半衰期。更稳定的酶有较小的k_i值和相应的较大的τ值和半衰期。因此如本文所定义，“提高的稳定性”是指较大、较高或增加的τ值，以时间如小时为单位表示。

就本发明的目的而言，经修饰的TrCel3A在以下条件的水性溶液中与相应的亲本家族3糖基水解酶或亲本TrCel3A表现出提高的稳定性(即较大的τ值)，所述条件为：(a)低pH；(b)低pH和高度充气；(c)低pH和强烈搅动；或(d)低pH和高温。

“低pH”是指约2至约4.5的任意pH，或者其间的任意pH，例如约2.5至约4.0的任意pH，或其间的任意pH；例如pH2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.5或其间的任意pH。

“高度充气”是指以约0.1至约100cm/s的表观气速，或其间的任意速率(例如约0.1至约1cm/s的任意速率，或其间的任意速率)向水性溶液提供气体。本领域技术人员已知的测量充气速率的一个可选参数是每分钟的容器体积(vvm)。因此在本发明的上下文中，“高度充气”还可被定义为以约0.5至约5vvm的速率，或其间的任意速率向所述水性溶液提供气体。所述气体可以是单一气体，如氧气、氮气和二氧化碳，或者是混合气体如空气。

强烈搅动是指通过以约300至约1000rpm或其间的任意速率摇动来混合所述水性溶液，或者以约0.5至约10m/s的外缘速度或其间的任意速率(例如约0.5至约3m/s)通过叶轮搅拌来混合。本领域技术人员已知的测量充气的可选参数(尤其是涉及在生物反应器中的充气时)是马力(hp)/100加仑。因此在本发明的上下文中，“高度充气”还可以被定义为以约0.2hp/100加仑至约15hp/100加仑混合所述水性溶液。

高温是指约30℃至约60℃的任意温度，或其间的任意温度，例如约40℃至约60℃的任意温度，或者其间的任意温度，例如30、35、40、45、50、52、54、56、58、60℃，或其间的任意温度。

当在低pH、低pH和高度充气、低pH和强烈搅动或者低pH和高温的相同条件下，经修饰的TrCel3A的τ比作为其来源的亲本TrCel3A的τ高至少2倍例如约2倍至约500倍，则所述经修饰的TrCel3A相对于所述亲本TrCel3A表现出提高的稳定性。例如，在相同条件下，所述经修饰的TrCel3A的τ比相应的亲本TrCel3A的τ高约2倍至250倍，或其间的任意值，比相应的亲本TrCel3A的τ高约3倍至约200倍，或其间的任意值，或者例如所述τ比相应的亲本TrCel3A的τ高约2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、250、300、350、400、450或500倍，或其间的任意值。实施例8详述了测量天然和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的τ的试验。

对一些经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的稳定性进行比较，所述比较是通过在剧烈搅动的条件下在低pH(3.0)下孵育所述酶并在30分钟里的几个时间点检测残余活性进行的，所述剧烈搅动是通过在有挡板烧瓶中在400rpm下旋动所述酶溶液产生的。所述残余β-糖苷酶活性是如实施例1所述通过使用对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物的显色测定法(chromogenic assay)测定的。

位点66、72、101、235、248、369和386处氨基酸置换的作用是通过对所述经修饰的TrCel3A和所述亲本野生型TrCel3A的比较研究确定。相对所述亲本TrCel3A的τ(其中所述亲本TrCel3A的τ值被设为1.0)的相对τ增加在下表2中示出。这些变体的灭活曲线在图5、7和8中示出。

表2：经修饰的TrCel3A的增加的稳定性

氨基酸置换	相对τ
		无(TrCel3A)	1.0
S72N	4.3
		V66I-S72N	13.9
V101M	2.9
		T235S	2.9
N248K	3.8
		N369K	8.2
A386T	5.1
		S72N-F96L-V101M	19.4
S72N-F96L-V101M-N369K	145
		S72N-F96L-V101M-N369K-A386T	134
S72N-V101M-N369K-A386T	205
		V66I-S72N-V101M-N369K-A386T	97
V66I-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T	59
		S72E-F96L-V101M-N369K-A386T	194
S72N-F96L-V101M-N369P-A386T	330

编码经修饰的TrCel3A的基因构建体

本发明还涉及包含有效连接至调节核酸序列的编码所述经修饰的TrCel3A的核酸序列的基因构建体，所述调节核酸序列指导所述经修饰的TrCel3A从所述宿主微生物中表达和分泌。“调节核酸序列”是指指导所述经修饰的TrCel3A的编码核酸序列的转录和翻译的核酸序列，和编码能够指导所述经修饰的TrCel3A从所述宿主微生物中分泌的分泌信号肽的核酸序列。所述调节核酸序列优选地在真菌宿主中起作用。所述调节核酸序列可来自于在工业发酵条件下在宿主微生物中高度表达和分泌的基因。例如，所述调节核酸序列可来自一个或多个里氏木霉纤维素酶或半纤维素酶基因。

所述基因构建体还可以包含选择性标志基因以使得能够如本领域技术人员公知的那样分离所述构建体转化的经基因修饰的微生物。所述选择性标志基因可赋予宿主微生物抗生素抗性或在缺乏特定营养的培养基上生长的能力，所述宿主生物体在这些条件下原本不能生长。本发明不局限于选择性标志基因的选择，并且本领域技术人员可容易地确定合适的基因。例如，所述选择性标志基因可赋予潮霉素、腐草霉素(phleomycin)、卡那霉素、遗传霉素(geneticin)或G418抗性，或者可以补救宿主微生物trp、arg、leu、pyr4、pyr、ura3、ura5、his或ade基因中的一个基因缺陷或者可赋予在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的能力。

所述基因构建体还可以包含其他核酸序列，例如，转录终止子、编码肽标签的核酸序列、将所述多种其他核酸序列连接在一起的合成序列、复制起点等。本发明的实施不局限于这些其他核酸序列的任意一个或多个的存在。

产生经修饰的TrCel3A的基因修饰的微生物

所述经修饰的TrCel3A可从经基因修饰的微生物中表达和分泌，所述经基因修饰的微生物是通过用编码所述经修饰的TrCel3A的基因构建体转化宿主微生物产生。所述宿主微生物可以是酵母或丝状真菌，特别是作为子囊菌(Ascomycota)门的成员的那些微生物。可用作宿主微生物以表达本发明经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的酵母的属包括酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、耶罗维亚酵母(Yarrowia)和Arxula。可用作表达本发明经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的微生物的真菌的属包括木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)和青霉属(Penicillium)。例如，所述宿主微生物可以是里氏木霉的工业菌株。一般地，所述宿主微生物是不表达亲本TrCel3A的微生物。

所述基因构建体可通过任意数量微生物转化领域技术人员所熟知的方法被引入所述宿主微生物，所述方法包括但不局限于用CaCl₂处理细胞、电穿孔、生物射弹轰击和PEG-介导的原生质体融合(例如，White et al.，WO 2005/093072)。在选出表达所述经修饰的TrCel3A的重组真菌菌株之后，在诱导所述经修饰的TrCel3A表达的条件下通过深层液体发酵培养所选择的重组菌株。

经修饰的TrCel3A的生产

本发明所述经修饰的TrCel3A可由使用经基因修饰的微生物的发酵方法通过深层液体培养发酵来生产，所述经基因修饰的微生物包含编码所述经修饰的TrCel3A的基因构建体。

如本领域技术人员所知，包括木霉属和相关丝状真菌在内的微生物的深层液体发酵一般以分批法、补料分批法或连续法进行。在分批法中，除用于需氧过程的氧气外，所有的必需材料都在操作开始时加入到反应器中并且使得所述发酵一直进行直至结束，并且结束之时收获产物。在补料分批法中，培养物被连续地或者顺序地给料一种或多种培养基成分，并且不移除培养液。在连续法中，以体积相同的速度连续地提供新鲜的培养基和移除培养液来使培养物保持稳定的生长速率。

生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法可以分批法、补料分批法、重复补料分批法、连续法或其任意组合来进行。例如，所述方法可以是补料分批法。

本领域技术人员知道包含碳源、氮源和其他营养物、维生素和矿物质的发酵培养基可被加入到所述发酵培养基中来提高所述宿主细胞的生长和酶生产。这些其他培养基成分可在以所述宿主细胞接种所述培养基之前、同时或之后加入。

对于生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法，所述碳源可包含可诱导所述经修饰的TrCel3A从经基因修饰的微生物中的基因构建体中表达的碳水化合物。例如，如果所述经基因修饰的微生物是木霉属的菌株，并且所述基因构建体包含与所述经修饰的TrCel3A核酸序列有效连接的纤维素酶或半纤维素酶启动子，所述碳源可包含一种或多种纤维素、纤维二糖、2-葡糖-β-葡糖苷(sophorose)、木聚糖、木糖、木二糖和相关的已知能诱导木霉属中的纤维素酶、半纤维酶和β-糖苷酶表达的寡糖或多糖。

在分批发酵的情况下，所述碳源可在接种之前或同时加入到发酵培养基中。在补料分批操作或连续操作的情况下，所述碳源也可在发酵过程中连续或间歇地提供。

生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法可在约20℃至约40℃或其间的任意温度、或者在20、22、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40℃或其间的任意温度下进行。

生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法可在约3.0至6.5的pH或者其间的任意pH，例如自约pH 3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5或其间的任意pH下进行。

生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法可在有氧的条件下进行，表观气速为约0.1至约100cm/s。例如，所述表观气速可以是约0.1至约1.0cm/s。或者，在所述生产本发明的经修饰的TrCel3A的方法中使用的表观气速可以是约0.5至约5vvm，或其间的任意速率。

生产本发明所述经修饰的TrCel3A的方法可在以约300至约1000rpm摇动的烧瓶中进行，或者在由叶轮外缘速度为约0.5至约10.0m/s或其间的任意速度的叶轮搅动的生物反应器中进行，所述叶轮外缘速度例如为约0.5至3m/s，或其间的任意速度。或者，所述生物反应器可能会以约0.2hp/100加仑至约15hp/100加仑的动力或其间的任意动力搅动。

发酵之后，包含所述纤维素酶的发酵液可直接使用，或者可例如通过过滤或离心将所述纤维素酶从所述真菌细胞中分离出来。低分子量的溶质，如未消耗的发酵培养基成分可通过超滤除去。所述纤维素酶可通过例如蒸发、沉淀、沉降或过滤而浓缩。可加入化学药品如甘油、蔗糖、山梨糖醇等以稳定所述纤维素酶。可将其他化学药品如苯甲酸钠或山梨酸钾加入所述纤维素酶以防止微生物污染物的生长。

经修饰的TrCel3A用于纤维素底物的水解的用途

本发明的经修饰的TrCel3A可与一种或多种纤维素酶结合以生产用于酶水解纤维素的纤维素酶混合物。就本发明的目的而言，纤维素酶包括已知参与纤维素向可溶性糖转化的所有酶和蛋白质，包括但不局限于纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、内切葡聚糖酶(E.C 3.2.1.4)和其他增强纤维素向可溶性糖的酶转化的辅助酶(accessory enzyme)，如纤维素膨胀因子(swollenin)、植物细胞膨胀素(expansin)等。除所述经修饰的TrCel3A和纤维素酶外，所述纤维素酶混合物还可包括其他酶，如其他β-糖苷酶、半纤维素酶、葡糖醛酸酶(glucuronidase)、半乳糖醛酸酶(galacturonase)、酯酶(esterase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、淀粉酶(amylase)和葡糖淀粉酶(glucoamylase)。应理解包含本发明所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的纤维素酶混合物对纤维素的酶水解不受限于所述纤维素酶混合物的组成。

包含本发明所述经修饰的TrCel3A的所述纤维素酶混合物可用于对存在于“经预处理的木质纤维素原料”中的纤维素的酶水解。经预处理的木质纤维素原料是植物来源的材料，在预处理前包含至少约20％纤维素(干重)，更优选超过约30％纤维素，甚至更优选超过40％纤维素，例如20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90％或其间的任意％；和至少10％木质素(干重)，更常见的是至少12％(干重)，并且已经受到物理和/或化学方法处理以使纤维更容易受纤维水解酶的作用影响和/或接受纤维水解酶的作用。

预处理后，所述木质纤维素原料可包含更高水平的纤维素。例如，如果使用酸预处理，半纤维素成分被水解，这提高了纤维素的相对水平。在这种情况下，所述经预处理原料可包含超过约20％的纤维素和超过约12％的木质素。可用于本发明的木质纤维素原料包括但不局限于农业残余物(agricultural residue)，如玉米秸秆、麦秆、大麦秆、稻秆、燕麦秆、加拿大油菜秆(canola straw)和大豆秆；纤维加工废料如玉米纤维、甜菜渣(sugar beet pulp)、纸浆细屑和废料(pulp millfines and rejects)或者甘蔗渣(sugar cane pulp)；林业残余物如山杨木、其他硬木、软木和锯末；或草，如柳枝稷(switch grass)、芒草(miscanthus)、大米草(cord grass)和草庐(reed canary grass)。可通过以下方法首先对所述木质纤维素原料进行破碎处理，所述方法包括但不局限于磨、碾、搅动、粉碎、压缩/膨胀，或者其他类型的机械作用。通过机械作用进行的破碎可通过适用于所述目的的任意类型的设备进行，例如但不局限于锤式粉碎机。

预处理方法的非限制性实例包括用硫酸、亚硫酸或其他酸；氨、石灰、氢氧化铵或其他碱；乙醇、丁醇或其他有机溶剂；或加压水对木质纤维素原料进行化学处理(参见美国专利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392和4,600,590)。

可进行所述预处理来将存在于所述木质纤维素原料中的半纤维素或其一部分水解为单糖，例如木糖、***糖、甘露糖、半乳糖或其组合。优选地进行所述预处理以使得所述半纤维素几乎全部水解，并且出现少量的纤维素向葡萄糖的转化。在预处理期间，一般将酸浓度为约0.02％(w/w)至约2％(w/w)或为其间任意量的水性浆料用于处理所述木质纤维素原料。所述酸可以是但不局限于盐酸、硝酸或硫酸。例如，在预处理期间使用的酸是硫酸。

进行所述原料的酸预处理的一个方法是使用美国专利No.4,461,648所述的操作条件的蒸汽喷发(steam explosion)。预处理所述原料浆料的另一个方法涉及连续预处理，是指将所述木质纤维素原料连续地泵送通过反应器。本领域技术人员熟知连续酸预处理；参见，例如，美国专利No.5,536,325、WO 2006/128304和美国专利No.4,237,226。本领域已知的其他技术可根据需要使用，如美国专利No.4,556,430中公开的方法。

如上所述，可以用碱进行所述预处理。与酸预处理相比，用碱的预处理不会水解所述原料的半纤维素成分，相反地碱与存在于所述半纤维素上的酸性基团反应以打开所述底物的表面。所述碱的加入还可改变纤维素的晶体结构以使它更容易被水解。可用在所述预处理中的碱的实例包括氨、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。所述预处理优选不使用不溶于水的碱(如石灰和氢氧化镁)进行。

在预处理后但在酶水解前，可采用例如下述一些步骤中的任意步骤处理所述经预处理的木质纤维素原料，所述步骤如本领技术人员熟悉的在酶水解之前用水稀释、用水洗涤、缓冲、过滤、离心或这些处理的组合。

随后对所述经预处理的木质纤维素原料进行酶水解。术语“酶水解”是指纤维素酶作用于纤维素以使其全部或一部分转化为可溶性糖的过程。可溶性糖是指包括水溶性己糖单体和最多达6个单体单元的低聚体，所述单体单元来源于所述经预处理的木质纤维素原料的纤维素部分。可溶性糖的实例包括但不局限于葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精或其混合物。所述可溶性糖可主要是纤维二糖和葡萄糖。所述可溶性糖可主要是葡萄糖。

所述酶水解过程优选将约80％至约100％或其间任意范围的纤维素转化为可溶性糖。所述酶水解过程更优选将约90％至约100％或其间任意范围的纤维素转化为可溶性糖。在最优选的实施方案中，所述酶水解过程将约98％至约100％或其间任意范围的纤维素转化为可溶性糖。所述酶水解过程可以是分批水解、连续水解或其组合。所述水解过程可为被搅动的、不混合的或其组合。

所述使用包含所述经修饰的TrCel3A的纤维素酶混合物的纤维素酶水解可为分批水解、连续水解或其组合。所述水解可为被搅动的、不混合的或其组合。

所述酶水解可在以下温度和pH下进行，所述温度为约45℃至约75℃的温度或其间的任意温度，例如45、50、55、60、65、70、75℃的温度或其间的任意温度；所述pH为约3.0至7.5或其间的任意pH，例如约3.0至约5.5的pH或其间的任意pH，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的pH或其间的任意pH。水解开始前水解反应器中纤维素的初始浓度优选为约4％(w/w)至约15％(w/w)，或其间的任意浓度，例如4、6、8、10、12、14、15％或其间的任意量。包含所述经修饰的TrCel3A的纤维素酶混合物的剂量可以是约1至约100mg蛋白质/克纤维素，或其间的任意量，例如每克纤维素1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白质或其间的任意量。所述水解可进行约12小时至约200小时的时长，或其间的任意时长，例如所述水解进行15小时至100小时或其间的任意时长，或者它可进行12、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200小时或其间的任意时长。应理解所述反应条件并不意味着以任何方式限制本发明并且可根据需要由本领域技术人员调整。

所述酶水解一般在水解反应器中进行。在将所述经预处理的木质纤维素原料(也被称作“底物”)加入所述水解反应器之前、期间或之后将所述酶混合物加至所述底物中。

所述纤维素酶混合物中所有酶均可由一种生物体的菌株分泌，在本文中被称为分泌的酶的“完全混合物”。术语“完全混合物”是指所有蛋白质都是由一种具体的微生物分泌至胞外进入所述生长培养基。所述酶混合物可包括由里氏木霉分泌的酶的完全混合物。

包含所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的纤维素酶混合物的各个酶可单独地或以亚群的方式由不同生物体的不同菌株表达，并且所述酶结合形成所述纤维素酶混合物。还考虑到所述纤维素酶混合物的各个酶可单独地或以亚群的方式由单独一种生物的不同菌株(如里氏木霉的不同菌株)表达，并且所述酶结合形成所述纤维素酶混合物。优选所有的酶均是由里氏木霉的单独一种菌株表达。

实施例

还将在以下实施例中进一步说明本发明。但是，应理解这些实施例是仅用于说明目的并且不应被用来以任何方式限制本发明的范围。

实施例1描述了在轻微和强烈搅动/充气以及不同pH条件下对亲本TrCel3A稳定性的评估。实施例2描述了以下实施例中所使用的菌株和载体。实施例3描述了TrCel3A基因的克隆和酵母的转化。实施例4描述了易错PCR文库的制备。实施例5和6描述了亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶从酵母微量培养物中的表达，和高通量筛选以鉴定具有提高的稳定性的经修饰的TrCel3A。实施例7和8描述经修饰的和天然TrCel3Aβ-糖苷酶的大规模表达和表征。实施例9描述了亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的活性评估。实施例10和11描述了有多个氨基酸置换的聚集体经修饰的TrCel3A的产生，和所述聚集体经修饰的TrCel3A的位点饱和突变文库的制备和筛选。实施例12和13描述了从里氏木霉中生产经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。实施例14描述了亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的相对比活测定。实施例15和16描述了亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的稳定性测定。

实施例1：里氏木霉纤维素酶混合物中的TrCel3A的灭活

该实施例证明亲本TrCel3A在低pH、在低pH和强烈搅动、在低pH和高度充气或在低pH和高温的条件下灭活。

将里氏木霉菌株P59G生产的亲本TrCel3A水平提高的纤维素酶混合物样本调节至pH 3.0、3.5、4.0和5.0(图3A)，并且在30℃或50℃在无挡板烧瓶中通过以200rpm定轨摇动最长达80小时来混合。将里氏木霉菌株P59G生产的亲本TrCel3A水平提高的纤维素酶混合物样本调节至pH 3.0或pH 5.0(图3B)，并且在30℃下在以下条件下孵育最长达400个小时：在无挡板烧瓶中不摇动或搅拌，在无挡板烧瓶中以200rpm定轨摇动(“摇动”)或在有挡板烧瓶中用磁力搅拌器搅拌(“搅拌”)(图3B)。在不同的时间点取出含有所述亲本TrCel3A的纤维素酶混合物样本并且用对-硝基苯基-β-D-糖苷(pNPG)作为底物测定残余β-糖苷酶活性。

对硝基酚从pNPG中的释放可容易地通过它在340nm处的吸光度测出。所述pNPGase测定是在50℃下在Cary300分光光度计中进行，底物的浓度是0.4mM/3mL，向其中加入2μg包含亲本TrCel3A的纤维素酶混合物(P59G纤维素酶)。还在每个时间点通过Bradford等人的方法(Analytical Biochemistry，72：248-254，(1976))测量了总蛋白浓度。对于所述P59G纤维素酶，这表示加入了大约0.4μg的TrCel3A。所述TrCel3A的活性取为A340初始增长的斜率。每个时间点的pNPG活性除t＝0小时时的活性以计算每个时间点的相对pNPG比活。

图3中的结果显示所述亲本TrCel3A在低pH和强烈搅动的条件下易灭活。图3A显示在50℃下，所述β-糖苷酶活性在pH 5下基本稳定，在pH 4下缓慢灭活，并且在pH为3.5和3.0且轻微搅动(在无挡板烧瓶中以200rpm摇动)的条件下迅速灭活。在30℃下，所述酶在这些摇动条件下在pH 3和5下都稳定。图3B显示的结果证明亲本TrCel3A在低pH和强烈搅动的水性溶液中，即使在30℃下也容易灭活。在pH 3.0的并且在有挡板烧瓶中搅拌的水性溶液中，观察到TrCel3A的灭活；但是，所述亲本TrCel3A在低pH和轻微摇动(pH3.0并在无挡板烧瓶中以200rpm摇动)的水性溶液中以及在较高pH和强烈摇动(pH5.0并在有挡板烧瓶中搅拌)的水性溶液中均稳定。

实施例2：菌株和载体

酿酒酵母菌株BJ3505(pep4::HIS3 prb-Δ1.6R HIS3 lys2-208trp1-Δ101 ura3-52 gal2 can1)获自Sigma并且是氨基末端酵母标签表达试剂盒(Amino-Terminal Yeast FLAG Expression Kit)的一部分。从Invitrogen得到大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(F^-φ80lαcZΔM15Δ(lαcZYA-αrgF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_k ^-，m_k ⁺)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ^-)。从National Institute of Health得到载体YEp352/PGK91-1。从Promega得到pGEM T-easy载体。

如美国专利No.6,015,703所述，里氏木霉菌株P59G是生产和分泌高水平TrCel3Aβ-糖苷酶的经基因修饰的菌株，所述TrCel3Aβ-糖苷酶是由里氏木霉bgl1编码。BTR213是RutC30(ATCC #56765；Montenecourt and Eveleigh，1979)的衍生物，是由随机诱变产生的并且因为能在含有1％酸溶胀纤维素和4g/L 2-脱氧葡萄糖的基本培养基琼脂上产生较大透明圈(clearing zone)被首次选出，并且然后因为能在含有0.2μg/ml多菌灵(carbendazim)的乳糖培养基上生长而被选出。菌株P107B是菌株BTR213的衍生物，是通过用粗糙链孢菌(Neurospora crassa)pyr4基因置换cel6a基因产生的。尿苷产生缺陷的BTR213aux和P107Baux菌株是通过能在5-FOA(5-氟乳酸清)上生长而不能在无尿苷时以原养型生长来分离的。

实施例3：将所述亲本TrCel3A基因克隆进入YEp352/PGK91-1并且在酵母中转化

所述TrCel3A基因包含两个内含子。一个内含子位于分泌信号的位点323bp至391bp，另外一个位于所述基因内的位点2152bp至2215bp。所述TrCel3A基因包含一个位于位点1203bp的特有NheI位点。为了便于从酵母中表达并使用NheI和KpnI限制性内切酶克隆，通过3步PCR将位于TrCel3A内位点1203bp处的特有NheI和第二内含子除去。用iPROOF DNA聚合酶(BioRad)从包含TrCel3A的质粒pc/xBG(Xba1)-TV(美国专利No.6,015,703)中将TrCel3A基因以三个区段扩增出来。使用在基因5’端，所述分泌信号下游引入NheI位点的引物(AT048)和除去内部NheI位点的引物(AT051)扩增第一区段(A)。使用除去内部NheI位点的引物(AT050)和除去位点2152至2215bp处的内含子的引物(AT053)扩增第二区段(B)。使用除去位置2152至2215bp处的内含子的引物(AT052)和在所述基因3’端，终止子下游引入KpnI位点的引物(AT049)扩增第三区段(C)。使用引物AT050和AT049用PCR将基因产物B和C连接在一起(以制备基因产物D)。使用AT048和AT049用PCR将基因产物D与基因产物A连接在一起以得到无内含子并且分别在5’和3’端具有特有NheI和KpnI位点的TrCel3A。按照制造商的说明将最终基因产物克隆进入pGEM T-easy载体(Promega)以制备质粒pGEM-TrCel3A。引物序列如下所示：

通过将引物AT046和AT047一起退火制备包含NheI、KpnI和EcoRI限制性位点的DNA衔接头(adapter)。将所述衔接头***包含pgk1启动子、α交配因子分泌信号和pgk1终止序列的YEp基质粒以制备质粒YEp352/PGK91-1/α_ssNKE。具体地，将所述衔接头作为NheI/EcoRI片段***位于α交配因子分泌信号下游和pgk1终止子上游的NheI和EcoRI位点中。引物序列如下所示：

AT046：5’CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G(SEQ ID NO：23)

AT047：5’AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA G(SEQ ID NO：24)

用NheI和EcoRI消化质粒pGEM-TrCel3A来释放所述2235bp的TrCel3A基因。将所述片段纯化并连接至YEp352/PGK91-1/α_ssNKE的所述NheI和EcoRI位点内以得到YEp352/PGK91-1/α_ssCel3A。

通过将引物AT044和AT045A一起退火制备包含SpeI、NheI、KpnI和EcoRI限制性位点的DNA衔接头。所述衔接头包含编码所述SpeI位点下游和所述NheI位点上游的6个组氨酸残基的序列。将所述衔接头***包含pgk1启动子、α交配因子分泌信号和pgk1终止序列的YEp基质粒以制备质粒YEp352/PGK91-1/α_ss6HNKE。具体地，将所述衔接头作为NheI/EcoRI片段***位于α交配因子分泌信号下游和pgk1终止子上游的NheI和EcoRI位点内。引物序列如下所示：

AT044：5’CTA GTC ATC ACC ATC ACC ATC ACG CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G(SEQ ID NO：25)

AT045：5’AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA GCT AGC GTG ATG GTG ATG GTG ATGA(SEQ ID NO：26)

用NheI和EcoRI消化质粒pGEM-TrCel3A来释放所述2235bp的TrCel3A基因。将所述片段纯化并连接至YEp352/PGK91-1/α_ss6HNKE的NheI和EcoRI位点内以得到YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A(图1)。

实施例4：易错PCR文库的构建

使用Mutazyme

II DNA聚合酶方法制备随机诱变文库。使用5、10、15、20ng的YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A载体和Mutazyme

IIDNA聚合酶和引物YalphaN21和3’PGK-term进行一系列的四独立PCR(four independent PCR)。退火温度设为50℃。扩增进行20个循环。合并所述四PCR产物并稀释至16ng/μL。用NheI和KpnI消化所述YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A载体并分离所述空载体片段。将该线性片段和所述最终的扩增子同时转化并且通过体内重组克隆至酵母菌株BJ3505(Butler，T.and Alcalde，M.2003)。

YalphaN21： 5’AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG(SEQ ID NO：27)

3’PGK-term：5’GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC(SEQ ID NO：28)

实施例5：亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶从微平板培养物中的表达

此实施例描述了用于高通量筛选测定的TrCel3A从酿酒酵母中的选择和表达。

酿酒酵母转化株在含有合成完全培养基(SC：2％琼脂w/v、0.17％酵母氮源w/v、0.078％-Ura drop-out补充物w/v、2％葡萄糖w/v、2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)的平板上，在30℃下生长4-5天。通过使用灭菌的丝绒(velvet)将每个菌落的一部分转移至含有添加了0.1％秦皮甲素(esculin hydrate)和0.03％FeCl₃的SC培养基的筛选平板来复制每个生长平板。在30℃下培养3-4天后变为黑色的菌落被鉴定为表达活性酶。将菌落对应至它们的原始生长培养平板，并且选择用于通过以下方式进行液体培养基表达培养：在装有玻璃珠(1.5-2.0mm)的96孔深孔板中的1mL SC培养基进行牙签接种。将表达培养物在30℃和250rpm下培养3天，同时控制湿度。通过将0.050mL液体培养物转移至装有0.050mL 40％甘油的微平板的对应孔中来制备甘油储液，并且在-80℃下保存。将表达培养平板以1600×g离心5分钟以沉淀细胞并且将上清液吸出用于筛选测定。

实施例6：针对在低pH下具有提高的稳定性的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶筛选基因文库

此实施例描述了通过与已克隆至酿酒酵母中的亲本TrCel3A比较来筛选在低pH下具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉TrCel3A。

使用两种不同的0.1mL柠檬酸盐缓冲条件以96孔PCR平板格式预孵育来自酵母微量培养物的经修饰的TrCel3A，如实施例5所述。在46℃以及在pH 5.0和pH 3.5(200mM柠檬酸盐缓冲液)下将来自每个微量培养物的上清液的等分试样预孵育30分钟。通过将所述预孵育混合物的等分试样加入至溶于200mM pH 5.0的柠檬酸盐缓冲液中的0.5mM 4-硝基苯基-β-D-葡糖-吡喃糖苷(pNPG)并且在50℃下孵育20分钟来评估每种经修饰的TrCel3A的残余β-糖苷酶活性。通过加入400mM Na₂CO₃缓冲液停止所述反应。在420nm处测量吸光度。在每个96孔PCR平板中含有6个用于比较的亲本TrCel3A对照。通过用在pH 3.5下预孵育后的活性除以pH 5.0下预孵育后的活性，来计算所有经修饰的TrCel3A和亲本TrCel3A的3.5pH/5.0pH稳定性比率。将每种经修饰的TrCel3A的pH 3.5/pH 5.0稳定性比率与每个平板上所述6个亲本TrCel3A对照的平均比率比较，并且使用t-检验在95％可信度下选择阳性结果。图4给出来自一个筛选平板的数据的样本。所有阳性的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶均再次通过微量培养生产并且重新筛选以减少假阳性的数量。

实施例7：用大规模培养物进行的亲本和经修饰的TrCel3A的表达

将500mL无菌YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)用10mL经转化酿酒酵母在同样培养基(已经用新从琼脂平板上挑出的细胞接种)中的过夜培养物接种。然后将所述培养物在30℃下以250rpm摇动培养96小时。

培养之后，将所述500mL酵母培养物在16,000×g下离心10分钟并弃去酵母细胞沉淀。随后进行标准抗体捕捉ELISA(Harlow andLane，1988，p.564-565)。用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释酵母滤出液并且在进行微平板(Costar #9018)涂覆之前煮沸5分钟。以1∶2000的稀释度使用第一His-标签抗体(Sigma #H1029)和过氧化物酶标记的第二抗体(Sigma #A4416)。

实施例8：在低pH和强烈搅动下对经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的表征

如实施例7所述收集包含亲本和经修饰的TrCel3A的酵母培养物上清液，并且用10mL比例分别为4∶1或1∶1的250mM柠檬酸盐和500mM磷酸盐缓冲剂调节至pH 3.0或pH 5.0。然后将所述样本在30℃下在有挡板烧瓶中以400rpm摇动培养。将每个测定中不同样本的TrCel3A浓度标准化为具有最低浓度的样本。体积的差异用来自包含空载体的酵母发酵液的无细胞废弃培养基补足至总体积为50mL。不同测定中TrCel3A的浓度范围为4.8-10.8μg/mL。

在96小时期间采集等分试样，并且在50℃下测量对溶于167mM柠檬酸盐(pH 5.0)中的0.4mM对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的活性。所述酶浓度为1.9-4.3μg/mL。340nm(A340)处吸光度变化的斜率被用作酶活性的量度。将随时间变化的数据绘图并且用微软Excel的Solver函数将所述数据拟合为一阶衰减模型。用标准方法计算所得k_i值的拟合的95％置信区间(Motulsky andChristopolous，2003)。用2型双尾t-检验比较每种经修饰的TrCel3A的τ(单位为小时)——灭活常量k_i的倒数——和所述亲本TrCel3A的τ。

图5和表2中的结果显示以下氨基酸置换会增加τ值，并且因此会提高TrCel3A在低pH下的稳定性：V66I、S72N、V101M、T235S、N248K、N369K、A386T。

实施例9：测定经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的酶活性

如实施例7所述，通过ELISA测定酵母滤出液中亲本或经修饰的TrCel3A浓度。

如实施例1所述，在pNPG测定(0.4mM pNPG，50mM柠檬酸盐pH 5.0，50℃)中测量包含亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的酵母培养物滤出液的酶活性。对于每次活性测定，将足够的酵母培养物滤出液加入到所述pNPG底物溶液中以使亲本或经修饰TrCel3A的浓度达到5μg/mL的终浓度(基于由ELISA测定的浓度)，并且监测340nm处的吸光度变化。所述pNP生产曲线的起始斜率是通过使用微软Excel确定的，并且作为所述变体活性的量度。三次平行试验测量活性，并且使用t-检验(2型，双尾)比较每个变体的平均活性和亲本TrCel3A的平均活性。

将所述经修饰和亲本的TrCel3Aβ-糖苷酶的活性对每个的τ值作图(图6)。所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的活性在所述亲本TrCel3A的20％以内，说明导致稳定性提高的氨基酸置换不会对所述酶的活性不利。

实施例10：有多个氨基酸置换的聚集体经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的构建

将YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A-S72N用作模板，使用2步PCR法引入另外的突变，所述2步PCR法包括大引物合成和随后使用高保真iProof Taq聚合酶的(BioRad)大引物PCR。修饰内部引物将所需的氨基酸置换引入所述TrCel3A构建体中。所述外部质粒引物(YalphaN21和3′PGK-term)被用来扩增终产物。使用Wizard

SV凝胶和PCR Clean-Up***来纯化所述大引物和终产物。

表3：通过PCR形成聚集体经修饰的TrCel3A酶

为了便于克隆，用NheI+BamHI消化终产物并且将其连接进入用NheI+BamHI线性化的载体YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A。将所述连接混合物转化进DH5α化学感受态大肠杆菌细胞，提取质粒并测序。将编码所述经修饰的β-糖苷酶的质粒转化进入酵母菌株BJ3505。

使用实施例7所述的方法从所述酵母转化株表达表3中通过PCR反应产生的所述聚集体经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。所述聚集体经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的稳定性使用实施例8所述方法表征。如表2和图7所示，包含2个、3个、4个或5个选自V66I、S72N、V101M、N369K、A386T的氨基酸置换的所述聚集体表现出19倍至超过200倍高于所述亲本TrCel3Aτ值的τ值。

将编码所述包含氨基酸置换S72N、F96L、V101M、N369K和A386T的聚集体经修饰的TrCel3A的载体(YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A-AT003)作为模板用于实施例11的位点饱和诱变。由该载体编码的所述聚集体经修饰的TrCel3A(TrCel3A-AT003)在如实施例12所述的里氏木霉中和编码该聚集体经修饰的TrCel3A的酵母载体中表达。

实施例11：位点饱和诱变文库的构建

选择TrCel3A中的4个氨基酸位点(S72、V101、N369和A386)用于位点饱和诱变以寻找在低pH下进一步提高稳定性的氨基酸。使用NNS引物(下文列出)通过PCR(一步PCR反应和两个片段的连接反应)进行位点饱和诱变。将所述YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A-AT003(S72N、F96L、V101M、N369K和A386T)载体用作模板，用iProof高保真DNA聚合酶(Biorad)进行PCR并且用T4DNA连接酶(Fermentas)连接PCR片段。对每个位点都产生一个SSM文库，保持模板中的其他位点不变。使用NNS引物和互补的外部引物3’PGK-term对片段1进行PCR。用不包含NNS的第二引物和互补的外部引物YalphaN21对第二片段进行PCR。不进行纯化步骤并且连接两个扩增的PCR片段，因为引物是磷酸化的。使用缺口修复法在酵母中将所述连接的扩增子克隆在YEp352/PGK91-1/α_ss6HNKE中。

为进行缺口修复，用NheI+KpnI消化所述载体YEp352/PGK91-1/α_ss6HNKE，并且在凝胶上纯化。酿酒酵母菌株BJ3505被用作宿主。将所述经消化的YEp352/PGK91-1/α_ss6HNKE载体和所述连接的扩增子使用Gietz，R.D.和Woods，R.A.描述的方法(Gietz，R.D.and Woods，R.A.2002)转化至所述酵母菌株BJ3505中。使用实施例5和6所述的方法对所得到的位点饱和文库进行筛选，以筛选在低pH下具有提高的稳定性的经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶。如在图3和表2中所示，两个经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶(TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T和TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T)被鉴定为在低pH下与所述亲本TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T相比具有显著提高的稳定性，表明对于提高TrCel3A在低pH下的稳定性来说，所述S72E和N369P置换优于所述S72N和N369K置换。

实施例12：聚集体经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶在里氏木霉中的表达

12.1.里氏木霉转化载体的构建

如下所述构建表达包含氨基酸置换S72N、F96L、V101M、N369K和A386T的聚集体经修饰的TrCel3A(TrCel3A-AT003)的载体的主链。引入另外的独特限制性位点MluI和NotI所需的间隔DNA是从pCAMBIA1301(参见URL：cambia-org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html#dsy585_Description和GenBank获取号No.AF234297)使用引物AC168和AC169扩增的，并且克隆至pUC19的SacI/BamHI位点以形成pUC19-SP。含有cel7a启动子、cel6a编码基因和cel6a终止子的表达盒c/x-Cel6A-cbh2是从载体pC/X-S413P-TV(美国公开文本No.US2008-0076152A1)中分离出来。将所述载体用NdeI限制性内切酶消化，加以平端(blunt-end)并用XbaI消化。然后将此片段克隆至pUC19-SP的EcoRV/XbaI位点中以形成载体pUC19-SP-c/xCel6A。为构建所述TrCel3A-AT003表达盒，使用引物AC230和AC231并且将所述pC/X-S413P-TV载体(美国公开文本No.2008-0076152A1)用作模板来扩增cel7-xyn2启动子和xyn2分泌信号。使用AC232和AC233并且将YEp352/PGK91-1/α_ss6H-Cel3A-AT003载体(实施例10)用作模板来扩增所述TrCel3A-AT003编码序列。所产生的片段分别在3’和5’末端具有短的部分重叠的相同序列。因此，两个片段在10循环PCR反应中被用作引物和模板，相互退火并且填充末端以产生c/x-Cel3A-AT003片段。使用外侧引物(outside primer)AC231和AC232扩增所产生的片段。将所述扩增的片段克隆至pJET(参见URL：fermentas.com/catalog/kits/clonej etpcrclon.htm)中来产生pJET-c/xCel3A-AT003，通过测序证实了所述pJET-c/xCel3A-AT003。随后将所述c/x-Cel3A-AT003片段从pJET-c/xCel3A-AT003载体中作为MluI/KpnI片段分离出来，并连接至pUC19-SP-c/xCel6A的相同位点以产生pUC19-SP-c/xCel3A-AT003。使用引物AC323和AC343从pNCBgl-NSNB(r)(美国公开文本No.2008-0076152A1)中扩增包含粗糙链孢菌pyr4基因的选择性标志盒，将其用PacI/NotI限制性内切酶消化并且克隆至pUC19-SP-c/xCel3A-AT003载体的PvuI/NotI位点中，以形成最终的里氏木霉转化载体pc/xCel3A-AT003-pyr4(图2)。

12.2.里氏木霉的转化

使用PDS-1000/He***(BioRad；E.I.DuPont de Nemours andCompany)通过生物射弹金颗粒轰击(biolistic gold particlebombardment)用pc/xCel3A-AT003-pyr4载体转化里氏木霉菌株BTR213aux和P107Baux(实施例2)。金颗粒(0.6um的中间粒径，BioRad Cat.No.1652262)被用作微载体。以下参数被用在所述转化的最优化方案中：1100psi的破坏压力、29mm Hg的氦压力、0.95cm的间隔距离(gap distance)、16mm的微载体移距和9cm的目标距离。通过用无菌水洗涤来自30℃下培养4-5天的PDA平板的里氏木霉孢子来制备所述孢子悬液。将大约1×10⁶个孢子铺板在包含基本培养基琼脂(MM)的60mm直径平板上。给予粒子后，所有转化平板在30℃下培养5-10天。将出现在转化平板上的转化株转移至MM培养基并且在30℃下培养。分离的稳定转化株被用于随后的分析。

基本培养基(MM)琼脂：

12.3.微量培养物中经修饰的TrCel36A-AT003的生产

为鉴定所述表达聚集体经修饰的TrCel3A蛋白质的转化株，使所有分离的稳定转化株在微量培养基中生长。大约5000个里氏木霉孢子被接种在含1mL木霉微量培养基的24孔培养皿(COSTAR)的每个孔中。将平板在30℃下以250rpm摇动培养5-7天。

木霉微量培养基

**纤维素酶诱导混合物以总碳水化合物计包含56％龙胆二糖、14％2-葡糖-β-葡糖苷、6％纤维二糖、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。

将培养物转移至微量离心管，通过在12,000rpm下微量离心来沉淀细胞，并且将所述培养物上清液转移至干净的微量离心管中。如实施例1所述，通过Bradford蛋白测定测量每个上清液的总蛋白浓度。由转化株生产的所述聚集体经修饰的TrCel3A的相对浓度通过如下ELISA确定。将培养物上清液和纯化的组分标准品在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2，PBS)中稀释至0.01-10μg/mL(以总蛋白计)并且在4℃下在微量滴定板(Costar EIA #9018)上孵育过夜。用包含0.1％Tween-20的PBS(PBS/Tween)洗涤这些平板，随后在室温下在包含1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中孵育1小时。用PBS/Tween洗涤封闭的微量滴定孔。将对TrCel3A特异的兔多克隆抗血清在PBS/BSA中稀释(1∶16,000)，加入至不同的微量滴定板中并且在室温下孵育2小时。洗涤平板并将其与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体(Sigma #A6154，以1/2000稀释在PBS/BSA中)在室温下孵育1小时。洗涤过后，将四甲基联苯胺加至每个平板并在室温下孵育30分钟。测量每个孔中360nm处的吸光度并使用TrCel3A标准曲线将其转换为蛋白浓度。通过用TrCel3A浓度除以所产生的蛋白总量计算所述TrCel3A蛋白的相对浓度，并且选出相对TrCel3A丰度为总蛋白的约20-30％的转化株，用于在14L发酵中的分析(表3)。

表3.里氏木霉转化株所产生的相对Cel3A表达水平，所述里氏木霉转化株是在含有可诱导纤维素酶的碳水化合物的微量培养物中生长的，并且被选出用于在14L发酵中进一步分析的

菌株名称	Cel3A的相对量，总蛋白的％
		P59G(对照)	42.7
BTR213aux(宿主)	6.0
		BTRc/x-penta 54	29.1
BTRc/x-penta 46	54.3
		BTRc/x-penta 69S	51.8
P107Baux(宿主)	6.4
		P107Bc/x-penta 15S	36.1
P107Bc/x-penta 22	42.9

实施例13：包含经修饰的TrCel3A的纤维素酶混合物的生产

将所选择的里氏木霉转化株的孢子接种至含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的标准85mm培养皿中。在30℃下将这些培养皿培养5天以使新的绿孢子汇合生长。为制备用于发酵试验的接种体，将来自单一PDA培养皿的孢子转移至含有750mL液体Berkley培养基(pH 5.5)的2L有挡板锥形烧瓶中。使用以100rpm运行的定轨搅拌器(型号G-52 New Brunswick Scientific Co.)将烧瓶在28℃下孵育3天。

用于***Berkley培养基

*微量元素溶液包含5g/L FeSO₄·7H₂O、1.6g/L MnSO₄·H₂O、1.4g/L ZnSO₄·7H₂O。

将每个接种***内含物转移至装有10L用于Feb-Batch发酵的初始培养基(pH 5.5)的14L试验规模的发酵容器(型号MFl 14 NewBrunswick Scientific Co.)中。所述容器以分批方式运行直到培养基中的葡萄糖耗尽。此时，将以总碳水化合物计包含56％龙胆二糖、14％2-葡糖-β-葡糖苷、6％纤维二糖、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物的纤维素酶诱导混合物从母液以连续方式进料，所述母液是将固体以35％w/v的浓度溶于水中获得的。每次进料均用蠕动泵以每小时每升培养物0.4克碳的速率递送碳源。运行时分批和补料分批部分的操作参数是：在500rpm的叶轮搅动下的混合、每分钟8标准升的空气注入和28℃的温度。使用与连线(online)pH探测器和能加入10％氢氧化铵溶液的泵连接的自动控制器使分批生长期间的培养物pH保持在4.0-4.5，并且使纤维素酶生产期间的pH保持pH3.0或5.0。定期取出100mL培养基样本用于生物量和蛋白质分析。在发酵165小时后，收集1L发酵培养基并过滤用于进一步的蛋白质分析。

用于补料分批发酵的初始培养基

最终发酵滤出液的总蛋白浓度如实施例1所述由Bradford测定来测量。所述最终发酵滤出液中TrCel3A类酶的浓度如实施例12.3所述由ELISA测定。

实施例14：在pH 3.0和pH 5.0的发酵中生产的亲本和经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的纤维二糖酶比活测定

该实施例证明，所述聚集体经修饰的TrCel3A-AT003(具有氨基酸置换S72N、F96L、V101M、N369K和A386T的TrCel3A)的相对比活比亲本TrCel3A的相对比活高，在该实例中，所述相对比活为在pH 3.0下进行的里氏木霉发酵所产生的β-糖苷酶的比活除以在pH5.0下进行的里氏木霉发酵所产生的β-糖苷酶的比活。

初始速率测定被用于测量在pH 5.0或3.0下进行的里氏木霉发酵中所产生的纤维素酶混合物中亲本TrCel3A和所述聚集体经修饰的TrCel3A-AT003对纤维二糖的比活。在pH 5.0下，将包含所述β-糖苷酶的纤维素酶混合物与溶于50mM柠檬酸盐缓冲液中的30mM纤维二糖孵育。使用6个稀释度的纤维素酶混合物，稀释度范围为1000-6000倍。将样本在深孔平板中于50℃下孵育30分钟，然后放置在沸水浴中10分钟以停止反应。使用葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶偶联***测量每个稀释度的纤维素酶混合物所产生的葡萄糖浓度(Trinder P.，1969)。所述比活(单位为IU/mg)是通过用所生产的葡萄糖的微摩尔数除以测定时长30分钟，然后除以存在于反应中的TrCel3A类酶的毫克数确定。每个实验中TrCel3A类酶(亲本的或聚集体经修饰的)的浓度是通过使用如下方式确定的：使用由如实施例1所述的Bradford法确定的粗酶蛋白浓度，和由实施例13所述的ELISA确定的每种培养滤出液的TrCel3A类酶级分含量。进行三次平行试验测定比活。

如图9所示，对于在pH 3.0下生产的所述TrCel3A类β-糖苷酶的纤维二糖酶比活除以在pH 5.0下生产的所述TrCel3A类β-糖苷酶的纤维二糖酶比活，由BTR213aux或P107Baux宿主菌株的转化株生产的所述聚集体TrCel3A-AT003比所述P59G对照菌株生产的亲本TrCel3A显著要高。因此，所述TrCel3A-AT003β-糖苷酶在里氏木霉发酵的低pH、高度充气和强烈搅动条件下比亲本TrCel3A更稳定。

实施例15：在模拟纤维素水解反应的条件下经修饰的和亲本TrCel3A的稳定性

该实施例证明，在降低的pH和标准水解温度下、在升高的温度和标准pH下，以及在升高的温度和降低的pH下所述聚集体经修饰的TrCel3A的稳定性均提高。

如实施例13所述，在pH 5.0下发酵表达包含所述亲本和聚集体经修饰的TrCel3A变体的纤维素酶混合物的里氏木霉。在35mL螺旋盖玻璃离心管中，通过向1mL的1.0M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0、4.0、3.5和3.0)中加入9mL纤维素酶混合物制备10mL pH-调节过的纤维素酶混合物样本。在50℃或60℃下，在空气加热的培养箱中以250rpm的定轨摇动来孵育这些样本。在0、0.5、1、2、4、6、11.5、24.5、74和98h取样，并且使用如实施例1所述的pNPG法测定β-糖苷酶活性。

如图10和表4所示，在50℃和pH 3.5或3.0下以及在60℃和所有测试的pH下，所述聚集体经修饰的TrCel3A-AT003β-糖苷酶比所述亲本TrCel3A都显著更稳定。这些结果表明TrCel3A-AT003中的氨基酸置换(S72N、F96L、V101M、N369K和A386T)赋予了在低pH和高温下提高的稳定性。

表4：在低pH和高温下亲本TrCel3A和聚集体经修饰的TrCel3A-AT003的稳定性

已通过一个或多个实施方案描述了本发明。但是，对本领域技术人员来说很明显可以在不背离如权利要求所界定的本发明的范围的前提下进行很多改变和修改。

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Claims

1.一种经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)TrCel3Aβ-糖苷酶，包含选自V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的一个或多个氨基酸置换，其中所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1具有约80％至约99.9％同一性的序列。

2.一种经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，包含选自V66I、S72E、S72N、F96L、V101M、T235S、N248K、N369K、N369P和A386T的一个或多个氨基酸置换，其中所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1具有约80％至约99.9％同一性的序列。

3.权利要求1或2任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中所述经修饰的TrCel3Aβ-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1具有约90％至约99.9％同一性的序列。

4.权利要求3的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，包含与SEQ ID NO：1具有约95％至约99.9％同一性的序列。

5.权利要求1至4任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中当在约pH 2.0至约pH 4.5的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶相比表现出至少2倍的稳定性提高。

6.权利要求1至5任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中当在约pH 2.0至约pH 4.5的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶相比表现出约2倍至约500倍的稳定性增加。

7.权利要求1或2的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，还包含选自V43X、F96X、F260X和I543X的一个或多个氨基酸置换。

8.权利要求7的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，还包含选自V43I、V43C、F96L、V101A、V101G、F260I、F260V、F260Q、F260D、I543N、I543W、I543A、I543S、I543G和I543L的一个或多个氨基酸置换。

9.权利要求5或6的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中对所述水性溶液以约0.1至约100cm/s的表观气速充气、通过在约300至约1000rpm下摇动来搅动或以约0.5至约10m/s的外缘速度通过叶轮来搅拌。

10.权利要求5的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中对所述水性溶液以约0.5至约5vvm的表观气速充气，或者在生物反应器中以约0.2至约15hp/100加仑搅动。

11.权利要求1或2的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶，其中当在pH为约2.0至约4.5且温度为约30℃至约60℃的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶相比表现出至少2倍的稳定性提高。

12.一种分离的基因构建体，包含编码权利要求1至11任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的核酸序列。

13.权利要求12的分离的基因构建体，还包含指导所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶表达和分泌的调节核酸序列。

14.一种分离的经基因修饰的微生物，包含权利要求12或13所述的基因构建体。

15.权利要求14的分离的经基因修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的种。

16.权利要求15的分离的经基因修饰的微生物，其中所述微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或里氏木霉(Trichodermareesei)。

17.一种用于生产经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的方法，包括以下步骤：在诱导所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶表达和分泌的条件下培养权利要求14的经基因修饰的微生物，并且从所述培养基中回收所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶。

18.权利要求17的方法，其中所述培养步骤是在约2.0至约4.5的pH、约0.1至约100cm/s的表观气速和约0.5至10m/s的叶轮外缘速度下进行。

19.权利要求17的方法，其中所述培养步骤是在约3.0至约4.5的pH、约0.5至约5vvm的表观气速和约0.2至15hp/100加仑的搅动下进行。

20.一种用于水解纤维素底物的方法，包括将所述底物与纤维素酶混合物接触，所述纤维素酶混合物包含权利要求1至11任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶。

21.权利要求20的方法，其中所述纤维素底物是经预处理的木质纤维素原料。

22.权利要求21的方法，其中将所述经预处理的木质纤维素原料在约3.0至7.5的pH和约45℃至75℃的温度下与所述纤维素酶混合物接触约12小时至200小时。

23.一种用于生产里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的方法，包含以下步骤：(i)用如权利要求12定义的基因构建体转化真菌宿主细胞以生产重组真菌菌株；(ii)选择表达所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的重组真菌菌株；并且(iii)在诱导所述经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶表达的条件下通过深层液体发酵培养所选择的重组菌株。

24.一种选自以下的经修饰的里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶：