CN109172795A - 灵芝组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

灵芝组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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徐广宇
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韩笑
孙晶波
郭笑
王锰
田程
张婧
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Abstract

本发明公开了一种灵芝组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该组合物的有效成分由以下重量份的药材制备而成：灵芝3‑9份，甘草1‑3份，生姜2‑4份。该组合物从健脾胃出发，灵芝主要益气血，俗称还魂草，能回阳救逆；甘草为国老，可调合诸药，还可增强肝胆代谢，有利毒物排出；制生姜温中散寒，保护胃粘膜，降低药物对胃的刺激，并可解毒。三位药合用，灵芝为君，生姜甘草为辅，共同发挥扶正去邪的功效。并通过动物实验证实，其中多肽类成分具有较好的增强免疫功能，特别是分子量为1000道尔顿‑5000道尔顿的多肽部分，具有最佳效果。

Description

灵芝组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种灵芝组合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着当今社会生活方式的改变，人们压力逐渐增加，体力运动相对减少，同时由于饮食、作息规律的紊乱，导致免疫功能大大下降，机体长时间处于疲劳、亚健康和不抵抗状态。因此，提高机体免疫功能成为了目前学术界和人们关注的焦点。但是，目前常规的调节免疫的产品不仅价格昂贵，而且局限于短期身体状态的调节，临床效果不甚理想。
因此，利用我国传统中医中药理论，开发作用明确，价格便宜的增强免疫的产品符合大众需求并具有极为重要的现实意义和社会意义。
发明内容
本发明的目的，就是克服现有技术的不足，提供一种灵芝组合物及其制备方法和应用
为了达到上述目的，采用如下技术方案：
一种灵芝组合物，所述组合物的有效成分由以下重量份的药材制备而成：
灵芝3-9份，甘草1-3份，生姜2-4份。
上述组方中，灵芝味甘，性平，无毒，归肺、心、脾、肾经，具有益气血，安心神，健脾胃的功效；甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效；生姜味辛，性微温，归肺、脾、胃经，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳、解毒的功效。
脾胃乃后天之本，脾胃健则身体强。灵芝、甘草、生姜均可健脾胃，灵芝主要益气血，俗称还魂草，能回阳救逆；甘草为国老，可调合诸药，还可增强肝胆代谢，有利毒物排出；制生姜温中散寒，保护胃粘膜，降低药物对胃的刺激，并可解毒。三位药合用，灵芝为君，生姜甘草为辅，共同发挥扶正去邪的功效。
在其中一个实施例中，所述组合物的有效成分由以下重量份的药材制备而成：灵芝5-7份，甘草1.5-2.5份，生姜2.5-3.5份。采用上述配比，具有较好的效果。
在其中一个实施例中，所述有效成分为所述药材中的多肽部分。经研究表明，药材中的多肽部分起到较好的提高免疫功能。
在其中一个实施例中，所述多肽的分子量为1000道尔顿-5000道尔顿。上述分子量范围的多肽，具有最佳的效果。
本发明还公开了上述的灵芝组合物的制备方法，包括以下步骤：
提取：取所述药材，以水为溶剂，回流提取，得提取液；
纳滤：取提取液，以截留分子量为5000道尔顿的纳米膜过滤，取滤过液，再以截留分子量为1000道尔顿的纳米膜过滤，取截留液，即得。
上述制备方法具有工艺简洁、操作容易的优点。
在其中一个实施例中，所述提取步骤中，所述生姜先经过炮制再提取，所述炮制过程为：将所述生姜置于火上烤至外糊内黄。
在其中一个实施例中，所述提取步骤中，按照1g药材：10-20ml水的量加入溶剂，80-100℃回流提取1-2次，每次1-3小时。
在其中一个实施例中，所述纳滤步骤中，先以截留分子量为10万道尔顿的纳米膜进行初滤，取初滤液，再以截留分子量为5000道尔顿的纳米膜过滤。经过初滤可提高制备效率。
本发明还公开了上述的灵芝组合物在制备具有增强免疫作用的药物或保健品中的应用。
在其中一个实施例中，所述药物或保健品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、粉剂、合剂、丸剂或滴丸。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的一种灵芝组合物，将灵芝、甘草和生姜组合，从健脾胃出发，灵芝主要益气血，俗称还魂草，能回阳救逆；甘草为国老，可调合诸药，还可增强肝胆代谢，有利毒物排出；制生姜温中散寒，保护胃粘膜，降低药物对胃的刺激，并可解毒。三位药合用，灵芝为君，生姜甘草为辅，共同发挥扶正去邪的功效。并通过动物实验证实，其中多肽类成分具有较好的增强免疫功能，特别是分子量为1000道尔顿-5000道尔顿的多肽部分，具有最佳效果。
本发明的灵芝组合物的制备方法，具有工艺简洁、操作容易的优点，适用于工业大生产中应用。
具体实施方式
下面将结合具体实施方法来详细说明本发明，在本发明的示意性实施及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下实施例所用材料如下：
1、实验动物
SPF级ICR雄性小鼠。
2、仪器与试剂：
电子天平(0.1g)、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺(精密度0.02mm)、微量注射器(25μL)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank’s液(pH7.2–7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、l％冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇(96mL异丙醇加4mL盐酸)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2–7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁***0.2g，***0.05g，加蒸馏水至1000mL)、YAC–1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液(pH8.2)、l％NP40、印度墨汁、Na2CO3、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
实施例1
一、灵芝组合物制备。
1、组方。
按照下表取不同药材，制备药物组合物。
表1.组方
组别 成分(重量份比)
组合物A 灵芝：甘草：生姜＝6：2：3
组合物B 灵芝：甘草：生姜＝1：1：1
组合物C 冬虫夏草：甘草：生姜＝6：2：3
组合物D 香菇：甘草：生姜＝14：5：11
组合物E 灵芝：枸杞：生姜＝6：2：3
2、制备方法。
(1)炮制：
生姜制法：采用竹签串之，置火上烤至外糊内黄。
(2)提取：
取各组别药材，以水为溶剂，按照1g药材：10ml水的量加入溶剂，100℃回流提取3小时，得提取液，回收溶剂，浓度至1mL/g药材，分别记为组合物A、组合物B、组合物C、组合物D、组合物E。
二、增强免疫力功能实验。
取上述组合物，分别进行各项免疫力功能实验。
1、方法。
1.1分组。
选健康雄性小鼠，体重18g～22g，按照实验需求分组，每组12只，分为五大组，具体如下：
免疫一组，进行脏器/体重比值测定、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测，包括组合物A-E和对照组。
免疫二组，进行碳廓清实验，包括组合物A-E和对照组。
免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定，包括组合物A-E和对照组。
免疫四组，进行迟发型***反应实验，包括组合物A-E和对照组。
免疫五组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，包括组合物A-E和对照组。
1.2剂量。
取浓度为1mL/g药材的组合物溶液，按照1.0/kg BW的剂量给药，各组以纯水稀释。以纯水作阴性对照组，各组小鼠灌胃量均为0.2mL/10g BW，连续灌胃30天后测定。
1.3实验步骤。
1.3.1脏器/体重比值测定
小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
1.3.2迟发型***反应(足跖增厚法DTH)
取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2％(V/V)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/只。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，20μL/只，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。
1.3.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度至3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2 37℃的CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入lmL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，后测定OD570nm。
1.3.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，4℃冰箱保存备用(可保存2周)。压积SRBC以生理盐水配成2％(V/V)细胞悬液，鼠腹腔注射0.2mL/只。将SRBC免疫4～5天后的小鼠脱臼处死，取脾，放入Hank’s液，将脾磨碎制成细胞悬液，纱布过滤，Hank’s液洗2次，每次离心(1000r/min)10min，后将脾细胞悬液加入RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×106个/mL。琼脂糖加热溶解后，45～50℃水浴保温，与等量PH7.2～7.4 2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％(V/V，用SA液配制)压积SRBC 50μL、脾细胞悬液20μL，混匀后倾倒于已刷有琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，CO2培养箱中温育1.5h，后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
1.3.5半数溶血值(HC50)的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，腹腔注射2％(V/V，生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL/只进行免疫。4天后，取血于离心管，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释(400倍)，稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(V/V)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。37℃恒温水浴中保温15～30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(V/V)SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，以对照作空白，分别测定各管OD540nm，溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，计算：
HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数
1.3.6小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射1:4倍稀释的印度墨汁，立即计时，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立刻将其加到2mL0.1％Na2CO3溶液中，以Na2CO3为对照，测定OD600nm。处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重。计算吞噬指数a：
k＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
1.3.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
小鼠腹腔注射20％(V/V用生理盐水配制)压积鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1mL，间隔30min，脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，37℃孵箱温育20min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，甲醇固定，4％(V/V)Giemsa–磷酸缓冲液染色，蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬率％＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
1.3.8 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h传代培养靶细胞YAC–l，应用前以Hank’s液洗3次，含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×105个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度至2×107个/mL，使效靶比为50：1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和l％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入lmol的HCl溶液30μL终止反应，测定OD490nm，计算NK活性：
NK细胞活性％＝(反应孔OD–自然释放孔OD)/(最大释放孔OD–自然释放孔OD)×100％
LDH基质液的配制：乳酸钠5×10-2mol/L
硝基氯化四氮唑6.6×10-4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×l0-4mol/L
氧化型辅酶I 1.3×10-3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液中(pH8.2)
1.4数据统计.
采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析进行均值比较，方差齐时，各组间两两比较用LSD法；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane法。
2、结果。
2.1受试物对小鼠体重的影响
表2.受试物对免疫一组小鼠体重影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。
表3.受试物对免疫二组小鼠体重影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。
表4.受试物对免疫三组小鼠体重影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。
表5.受试物对免疫四组小鼠体重影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。
表6.受试物对免疫五组小鼠体重影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。
2.2受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
表7.受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
脾脏/体重比值P1值：各实验组与阴性对照组比较；
胸腺/体重比值P2值：各实验组与阴性对照组比较；
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，各组脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的脏器/体重比值无明显影响。
2.3受试物对小鼠细胞免疫功能的影响
2.3.1受试物对小鼠迟发型***反应(DTH)的影响
表8.受试物对小鼠迟发型***反应(DTH)的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，组合物C、D和E组足跖肿胀度与阴性对照组比较无较好的促进，且差异无显著性(P＞0.05)，组合物A和B组与阴性对照组间比较有较好的促进，且组合物A组与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)，即组合物A和B能增强小鼠的迟发型***反应，且组合物A效果最佳。
2.3.2受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
表9.受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各组淋巴细胞的增殖能力与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力无明显影响。
2.4受试物对体液免疫的影响
2.4.1受试物对抗体生成细胞数的影响
表10.受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各组抗体生成细胞数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的抗体生成细胞数无明显影响。
2.4.2受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
表11.受试物对小鼠半数溶血值HC50的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各组半数溶血值与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠半数溶血值无明显影响。
2.5受试物对小鼠单核–巨噬细胞吞噬功能的影响
2.5.1受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
表12.受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05**P＜0.01
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，组合物C、D和E组廓清能力与阴性对照组比较无较好的提高，且与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，组合物A和B组与阴性对照组比较有较好的提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力，且组合物A组与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)。
2.5.2受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响
表13.受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响
吞噬率(％)P1值：各实验组与阴性对照组比较
吞噬指数P2值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各组吞噬率与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，各组吞噬指数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无明显影响。
2.6受试物对小鼠NK细胞活性的影响
表14.受试物对小鼠NK细胞活性的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各组NK细胞活性与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的NK细胞活性无明显影响。
3.小结
经口给予小鼠组合物A和B 30天，能增强小鼠迟发型***反应，即能增强细胞免疫功能；能提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力，即能增强单核—巨噬细胞功能；但对小鼠半数溶血值、小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性无影响。
经口给予小鼠组合物C、D和E 30天，对小鼠迟发型***反应、小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力、小鼠半数溶血值、小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性均无影响。
实施例2
一、灵芝组合物制备。
1、组方。
取灵芝、甘草和生姜，按照重量份比为6:2:3组合，待用。
2、制备方法。
(1)炮制：
生姜制法：采用竹签串之，置火上烤至外糊内黄。
(2)提取：
取上述药材，以水为溶剂，按照1g药材：10ml水的量加入溶剂，100℃回流提取3小时，得提取液。
(3)纳滤：
取提取液，先以截留分子量为10万道尔顿的纳米膜进行初滤，得初截留液和初滤液，取初滤液，再以截留分子量为5000道尔顿的纳米膜过滤，得5000D截留液和滤过液，取滤过液，再以截留分子量为1000道尔顿的纳米膜过滤，得截留液和1000D滤过液；将各部分溶液回收溶剂至浓度为1ml/g药材。
二、增强免疫力功能实验。
1、参照实施例1的方法进行迟发型***反应(足跖增厚法DTH)和小鼠碳廓清实验。
2、结果。
2.1迟发型***反应结果。
表15.受试物对小鼠迟发型***反应(DTH)的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，初截留液、1000D滤过液足跖肿胀度与阴性对照组比较无明显差异；初滤液、5000D滤过液和滤过液足跖肿胀度与阴性对照组比较有一定的促进作用，且滤过液效果较好，5000D滤过液较差；截留液具有最佳的促进足跖肿胀，且与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)。
2.2受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
表16.受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05**P＜0.01
由上表可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，初截留液、1000D滤过液廓清能力与阴性对照组比较无明显差异；初滤液、5000D滤过液和滤过液廓清能力与阴性对照组比较有一定的提高作用，且滤过液效果较好，5000D滤过液较差；截留液具有最佳的促进廓清能力，且与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)。
3、小结
通过上述结论，可以推测出，本发明的组合物中活性成分主要为上述分子量大小为1000-5000道尔顿的部分。
实施例3
1、类型确证。
取上述实施例2制备得到的截留液，进行双缩脲反应呈阳性，证实其中主要成分为多肽类。
2、工艺优化。
以微量双缩脲法测定多肽浓度，并选择提取时间、提取次数、提取温度和加水倍数为指标，对灵芝、甘草和生姜的多肽提取作正交试验和方差分析。
2.1微量双缩脲法测定。
在试管分别加0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL标准蛋白质溶液，用水补足到，加氢氧化钠溶液混匀，再加巧微量双缩脲试剂，混匀后在室温下20-25℃保温15min，然后在310nm或330nm比色测定，作标准曲线。牛血清白蛋白溶液(1mg/ml)的A310约为1.04，A330约为0.67。取未知浓度的样品同上测定，然后从标准曲线上查得其浓度。
2.2正交试验。
表17.指标及水平
表18.正交试验结果
表19.方差分析表
注：F0.01(2，2)＝99，F0.05(2，2)＝19,F0.1(2，2)＝9
由上表可知，在灵芝、甘草和生姜多肽提取率的影响因素中，加水倍数(A)、提取时间(B)对灵芝、甘草和生姜总多肽得率有显著性影响，C、D因素的影响不显著，四因数的影响顺序依次为：加水倍数(A)>提取时间(B)>提取次数(C)>提取温度(D)。在这四个因素中，加水倍数和提取时间对提取效果的影响最大，均达到显著水平(P<0.05)；提取次数影响其次；提取温度影响最小。由此可以得出，常规法提取的最佳工艺条件是：A3B1C2D2，即加水倍数为1:15，提取时间为2.0h，提取次数为2次，提取温度为90℃。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种灵芝组合物，其特征在于：所述组合物的有效成分由以下重量份的药材制备而成：
灵芝3-9份，甘草1-3份，生姜2-4份。
2.根据权利要求1所述的灵芝组合物，其特征在于：所述组合物的有效成分由以下重量份的药材制备而成：灵芝5-7份，甘草1.5-2.5份，生姜2.5-3.5份。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝组合物，其特征在于：所述有效成分为所述药材中的多肽部分。
4.根据权利要求3所述的灵芝组合物，其特征在于：所述多肽的分子量为1000道尔顿-5000道尔顿。
5.权利要求1-4任一项所述的灵芝组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取：取所述药材，以水为溶剂，回流提取，得提取液；
纳滤：取提取液，以截留分子量为5000道尔顿的纳米膜过滤，取滤过液，再以截留分子量为1000道尔顿的纳米膜过滤，取截留液，即得。
6.根据权利要求1所述的灵芝组合物的制备方法，其特征在于：所述提取步骤中，所述生姜先经过炮制再提取，所述炮制过程为：将所述生姜置于火上烤至外糊内黄。
7.根据权利要求1所述的灵芝组合物的制备方法，其特征在于：所述提取步骤中，按照1g药材：10-20ml水的量加入溶剂，80-100℃回流提取1-2次，每次1-3小时。
8.根据权利要求1所述的灵芝组合物的制备方法，其特征在于：所述纳滤步骤中，先以截留分子量为10万道尔顿的纳米膜进行初滤，取初滤液，再以截留分子量为5000道尔顿的纳米膜过滤。
9.权利要求1-4任一项所述的灵芝组合物在制备具有增强免疫作用的药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的组合物在制备具有增强免疫的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述药物或保健品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、粉剂、合剂、丸剂或滴丸。
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