CN113908224A - 一种具有免疫调节功能的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有免疫调节功能的中药组合物及其制备方法，属于中药领域。由如下重量份的原料制成：地黄1～6份，牡丹皮2～5份，丹参2～5份，黄芪1～6份，佛手2～5份，浙贝母2～5份，金荞麦2～5份，北沙参1～6份。优点是本发明药物组合物用于免疫调节、预防癌症，药物组成精致简练，主要成分清晰，通过诸药调节脾胃，活血化淤，治宜滋阴清热、凉血活血达到免疫调节、对癌症的预防与治疗作用，采用水煎技术提取技术，既保持了传统的中医药用药特色，又能最大限度地提取并保留处方中药物的有效成分，发挥处方的综合作用的特点，在未来具有非常广阔的前景。

Description

一种具有免疫调节功能的中药组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种具有免疫调节功能的中药组合物及其制备方法。
背景技术
当今时代癌症患者日益增多，最普遍发生的癌症有肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，结肠癌和直肠癌。乳腺癌的发病率也呈增长趋势。国际抗癌联盟发布的数据表明，世界范围内因癌症死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。癌症已经成为危害健康的首要问题，如果癌症得不到有效的治疗和预防，必将会对于我们的生产生活产生巨大的影响。
目前为有效地预防癌症，提高免疫调节能力是有效途径之一，许多药材具有免疫调节功能，经统计如下：
地黄的免疫调节功能：地黄中的地黄苷A单体具有增强体液免疫和细胞免疫的功效，地黄多糖具备显著的免疫促进作用，可以加强外周血中T淋巴细胞的比例以增强免疫细胞功效；熟地黄煎液能够增加小鼠四周白细胞的数量；地黄黄煎液能加速脾淋巴细胞中DNA的生物合成，并且能够加强白细胞介素-II的产生。鲜地黄煎液能够加强阴虚小鼠，非特异性免疫力和T、B淋巴细胞的性能。地黄的多糖成分具有促进免疫细胞增殖的功效在马霞等人的研究中也有发现。地黄还有很好的抗肿瘤功能，与西药抗肿瘤药物比较，中药地黄无细胞毒作用，对肿瘤细胞无直接杀伤作用。现代研究表明，地黄中的水苏糖与梓醇具备抗癌效用。地黄多糖在炮制的过程中，由于热不稳定性而发生水解，因此在抗癌的作用上，地黄黄的效果较好，能抑制抗原细胞的增长。何纯经过对照实验发现六味地黄丸和四君子汤改善了肿瘤化疗患者的生活品质。六味地黄丸主要通过抑制炎症因子生成，进而调节免疫力，抑制原癌基因和增强抗癌基因的表达、对化疗具有减毒增效的作用，能够防治肿瘤。地黄对心血管***也有一定的作用，许多研究证实地黄具有强心的作用，其发挥正性肌力作用的化学成分主要是地黄中的梓醇。李红伟等用成年雄性大鼠建模，建立心肌缺血模型，采用术前注射梓醇，与对照组进行比较发现梓醇能明显改善心脏功能，减少心肌梗死。孙立峰以乳鼠的心肌细胞进行实验，通过缺氧、复氧损伤研究发现地黄多糖能够修复心肌细胞形态，增加细胞存活数量。赵丽娟发现，地黄可以对冠心病患者的临床症状和心功能不全具有改善作用。
牡丹皮的免疫调节功能：王云等在研究牡丹皮对免疫力的影响中发现，通过雾化吸入方式，使大鼠吸入丹皮酚，测定吸入前后的免疫器官指数数据，吸入丹皮酚的大鼠体内的免疫细胞的免疫功能明显增强于对照组大鼠，实验组的免疫器官脾脏、胸腺等免疫功能增强，实验表明牡丹皮中的丹皮酚成分在增强机体免疫力上具有较好的疗效。蒋丽丽研究发现牡丹皮通过抑制肿瘤细胞增殖，以及抑制新生成的肿瘤血管、抑制癌细胞的转移、抑制癌症基因的转录、诱使癌细胞的凋亡，以及具有与化药一同作用癌变细胞达到抗肿瘤效果。丹皮酚能够抑制结肠癌、肝癌和胃癌等多种肿瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡，牡丹皮抑瘤率超过50％，因此牡丹皮具有一定的抗肿瘤作用。田福忠等从细胞水平探讨牡丹皮活性机制，丹皮酚可以抑制肿瘤细胞增殖，此外诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭，还可以抑制肿瘤新生血管形成，从而引发免疫调节反应，抑制引发肿瘤的慢性炎症反应。牡丹皮作为中药与化疗药物协同作用，可以改善微循环障碍。郑彦懿对溃疡性结肠炎小鼠研究中发现大黄牡丹汤成分能够抑制淋巴细胞的活化和增殖，具有较好的免疫抑制作用。欧叶涛在牡丹皮有效成分的提取的研究中发现牡丹皮通过细胞免疫和体液免疫调节的协同作用，增强Th1细胞的活性，降低Th2细胞活性，促进胰岛B细胞的增殖分化，达到降低血糖，治疗糖尿病的效用。张利霞等在用响应曲面法优化牡丹皮中的多糖提取工艺中发现牡丹皮中的多糖对免疫缺陷的小鼠具有免疫调节作用。此外，还有一定的抑菌作用。
浙贝母的免疫调节功能：浙贝母中的贝母素甲是通过抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡，来实现抗肿瘤的作用。贝母素甲通过将细胞周期阻滞在G1期来抑制细胞增殖，且细胞增殖的抑制作用与时间和浓度呈现依赖性，研究发现贝母素甲对乳腺癌细胞的细胞抑制率达80％，有显著抑制作用。贝母素甲能够显著抑制癌症细胞的增殖，有抗肿瘤的功效.
金荞麦的免疫调节功能：金荞麦提取物能够抑制人食管癌细胞株CaEs-17细胞的增殖并且能促进其凋亡，起到抗癌的作用。金荞麦中多酚类成分Fr4可以通过下调金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，起到明显抑制小鼠lewis肺癌的生长，达到抗肿瘤的作用。金荞麦中黄酮类成分红车轴草黄酮(RCFGB)通过抑制IL-6蛋白的表达，抑制人胃癌 SGC7901细胞的迁移能力，起到抗癌的作用。金荞麦提取物通过下调Tiam-1基因和上调nm23-H1基因的表达，抑制肝癌细胞HepG2的生长，起到抗肿瘤侵袭的作用。金荞麦提取物不仅对以上癌细胞具有抑制作用，同时对HCT116(结肠)及U2OS(骨骼)等癌细胞具有明显的抑制作用，对Hela(子宫颈)、OVCAR-3(卵巢)癌细胞具有轻微的抑制作用，当浓度达到一定值时，对***癌细胞DU145与脑癌细胞T98G的生长也具有抑制作用。
丹参的免疫调节功能：丹参的作用而发挥对免疫应答的双向内调节作用。丹参素对 LPS刺激下大鼠肝巨噬细胞分泌多种细胞因子有明显抑制作用，丹参酮Ⅱa对人白细胞的游走趋化有明显的抑制作用。丹酚酸B可以显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬作用、肝脾指数和廓清指数，从而增强其非特异性免疫功能。此外，研究发现丹参多糖也具有显著的免疫调节活性，丹参多糖能显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，刺激淋巴细胞增殖，提高二硝基氟苯所致的小鼠胸腺指数，抑制血管通透性的增加及耳肿胀，下调细胞因子 IL-1β、人白细胞干扰素α及诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达，说明丹参具有较强的免疫调节功能。
佛手的免疫调节功能：大量药理和临床研究均表明,多糖类化合物是一种能激活免疫细胞,提高机体免疫功能的免疫调节剂,并对正常细胞无毒副作用。近年，已有研究报道一些天然多糖通过提高NO水平和细胞因子的产生来增强巨噬细胞的免疫调节活性。多糖可结合巨噬细胞表面的特异性膜受体，比如Toll样受体、补体受体3、树突状细胞相关性C型植物血凝素1和甘露糖受体，然后触发几种不同的细胞内信号转导途径。黄玲等研究佛手多糖对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。佛手多糖可促进免疫功能低下小鼠的巨噬细胞外白介素6(IL-6)水平的提高，对巨噬细胞内IL-6浓度无影响。IL-6可影响B细胞的增殖分化和直接或间接增强自然杀伤细胞及细胞毒性 T细胞的杀瘤活性。He等通过对佛手粗多糖进行提取分离和纯化，获得均一性良好的多糖，命名为FCp-3，并测定FCp-3在体外对脾细胞和胸腺细胞增殖的影响。结果显示： FCp-3在浓度达25μg/ml时表现出显著的促脾细胞增殖活性，并且能促进胸腺细胞的增殖，表明佛手多糖FCp-3可作为一种新型的免疫调节剂。
北沙参的免疫调节功能：沙参中多糖类成分对免疫调节的影响。研究发现，北沙参粗多糖(GLP)灌胃可以显著增强甲亢型阴虚小鼠脾脏NK细胞杀伤率和T淋巴细胞转化功能，提高血清免疫球蛋白IgM和IgG含量。北沙参多糖的纯化组分对体外脾脏淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用，具有良好的体外免疫活性。以环磷酰胺为阳性对照，对BALB/c小鼠灌胃给予北沙参提取物，发现北沙参可以增加小鼠胸腺、脾质量，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性粒细胞的能力，提高小鼠淋巴细胞的杀瘤率和自然杀伤细胞的杀伤能力。北沙参超临界流体萃取物还可提高T淋巴细胞亚群和T淋巴细胞的数量，明显升高辅助性T细胞与抑制性T细胞比值(Th/Ts)，具有增强细胞免疫的作用。莱阳北沙参茎叶水提后的醇提物具有抑制环磷酰胺致小鼠外周血白细胞数和胸腺指数降低的作用，可增强免疫低下小鼠网状内皮***的吞噬功能。此外，莱阳沙参茎叶提取物的2个剂量组均能明显增加小鼠足跖厚度，且随剂量增加功能有增强趋势，表明莱阳沙参茎叶具有促进小鼠迟发型***反应的作用。北沙参(大红袍品种) 茎叶提取物亦具有调节体液免疫的作用。
黄芪的免疫调节功能：黄芪糖蛋白在抑制JAK-STAT3信号的同时降低Th17录因子RORγ，下调Th17，激活JAK-STAT5通路，提高Treg转录因子Foxp3表达；上调Treg以调节Th17/Treg平衡。过敏性鼻炎的发生主由免疫细胞及其因子参与，前文提到的黄芪甲苷可调控PD-L1对抗肿瘤，研究证明PD-L1和其受体作用影响Th17/ Treg的平衡亦可缓解过敏性鼻炎的病理特征，因此黄芪甲苷以PD-L1途径治疗过敏性鼻炎也具极大可能性。影响巨噬细胞是调节免疫的另一途径，黄芪提取物可抑制自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠CD4+、CD11b+巨噬细胞、CD11c+细胞百分比，抑制外周免疫细胞激活从而抑制进一步炎症。黄芪多糖调节细胞免疫通过增加模型鼠脾淋巴细胞和腹膜巨噬细胞的吞噬作用，进而改善模型小鼠胸腺指数和脾脏指数、恢复受损胸腺及脾脏组织，其对免疫器官作用使受损脏器免受抗癌药更大的损害。黄芪对巨噬细胞的调节作用呈双向性，正常培养的巨噬细胞RAW264.7和LPS刺激培养的巨噬细胞对黄芪总黄酮作用的反应相反，且剂量依赖。黄芪强有力的免疫调节作用提示其可能通过诸如激活免疫效应相关细胞活化及降低有害黏附分子途径提高机能。
发明内容
本发明提供一种具有免疫调节功能的中药组合物及其制备方法，目的通过其具有的免疫调节功能，可以有效的预防癌症。
本发明药物对提高免疫力、预防癌症的作用机制方面进行研究，阐明药物的作用机理，本发明处方是由地黄、牡丹皮、丹参、黄芪、佛手、浙贝母、金荞麦、北沙参8 味中药组成；方中生地为君，其性苦寒，为清热凉血之要药，又其性甘寒质润，能清热养阴，生津止渴。丹皮苦辛微寒，入心肝血分，既可清热凉血，又善于清透阴分伏热；浙贝苦寒，归肺心经，苦泄清热解毒之力强，兼能化痰散结消痈；二者同用，清热凉血，助君药以清热养阴凉血，共为臣药。北沙参补胃阴、清胃热，养阴益胃，生津止渴；金荞麦辛凉，能够清热解毒，并有健脾消食之功；丹参入心经，既可清热凉血，又可除烦安神，既能活血又能养血以安神定志；黄芪甘温，善入脾胃，为补中益气之要药，补气健脾，气行则血行，补气以助行血活血，共为佐药。佛手芳香醒脾，苦温燥湿而善健脾化痰，辛行苦泄又能舒肝理气而为使药。全方共奏滋阴清热、凉血活血之效。处方由生地、牡丹皮、浙贝母、北沙参、金荞麦、丹参、佛手、黄芪等8味中药组成，主治火热毒邪亢盛，耗伤阴液，导致阴亏液少之证。癌症都是体内有淤阻，血液经脉不通，脾胃为后天之本，气血生化之源，诸药通过调节脾胃，活血化淤，治宜滋阴清热、凉血活血达到对癌症的预防作用，现代药理研究结果表明，具有免疫调节，可以用于癌症的预防。
本发明采取的技术方案是，由如下重量份的原料制成：
地黄1～6份，牡丹皮2～5份，丹参2～5份，黄芪1～6份，佛手2～5份，浙贝母2～5份，金荞麦2～5份，北沙参1～6份。
本发明一种实施方式中，由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮4份，丹参2份，黄芪1份，佛手4份，浙贝母3份，金荞麦2 份，北沙参1份。
本发明一种实施方式中，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮2份，丹参4份，黄芪4份，佛手2份，浙贝母5份，金荞麦3 份，北沙参6份。
本发明一种实施方式中，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮3份，丹参3份，黄芪4份，佛手3份，浙贝母2份，金荞麦3 份，北沙参4份。
本发明一种实施方式中，由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮3份，丹参5份，黄芪3份，佛手5份，浙贝母3份，金荞麦4 份，北沙参4份。
本发明一种实施方式中，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮5份，丹参3份，黄芪5份，佛手3份，浙贝母4份，金荞麦3 份，北沙参5份。
本发明还提供了该中药组合物的制备方法，包括下列步骤：
水煎煮提取：取地黄、牡丹皮、丹参、黄芪、佛手、浙贝母、金荞麦、北沙参加入水煎煮提取1～4次，滤过，合并滤液，浓缩，得到浸膏；
将浸膏干燥，得到中药组合物。
作为优选，水煎煮提取步骤中，水溶液的加入量为药材总重量的4～10倍，提取的次数为1～4次，每次提取的时间为0.5～3h。
本发明还提供了一种中药制剂，包括本发明中药组合物和药学上可接受的辅料。
作为优选，中药制剂的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂或口服液。
本发明的有益效果是：
本发明药物组合物用于免疫调节、预防癌症，药物组成精致简练，主要成分清晰，通过诸药调节脾胃，活血化淤，治宜滋阴清热、凉血活血达到免疫调节、对癌症的预防与治疗作用，处方毒副作用小、能全面调节体内环境提高免疫力的作用，并且可在癌症放、化疗、手术治疗中起到减毒增效作用。采用水煎技术提取技术，既保持了传统的中医药用药特色，又能最大限度地提取并保留处方中药物的有效成分，发挥处方的综合作用的特点，安全有效，药效明确，对癌症的预防治疗具均有正向功能意义且具有抑制肿瘤、抗转移、抗复发的作用，大大改善了肿瘤患者的生存质量，在未来具有非常广阔的前景。
具体实施方式
本发明公开了一种免疫调节、预防癌症的中药组合物及其制备方法和中药制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1本发明胶囊剂的制备
由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮4份，丹参2份，黄芪1份，佛手4份，浙贝母3份，金荞麦2 份，北沙参1份；
以上8味药材，加8倍量水提取2次，每次2h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉；
加入1.5倍量糊精，混匀，制成颗粒剂，装胶囊即得。
实施例2本发明片剂的制备
由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮2份，丹参4份，黄芪4份，佛手2份，浙贝母5份，金荞麦3 份，北沙参6份；
以上8味药材，加6倍量水提取3次，每次1.5h，滤过，合并提取液，浓缩干燥，粉碎成细粉；
将上述提取物，加入1倍量淀粉混匀，制粒，压制成片，即得。
实施例3本发明颗粒剂的制备
由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮3份，丹参3份，黄芪4份，佛手3份，浙贝母2份，金荞麦3 份，北沙参4份；
以上8味药材，加10倍量水提取3次，每次1h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉；
加入0.8倍量糊精，混匀，制成颗粒剂，即得。
实施例4本发明滴丸剂的制备
由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮3份，丹参5份，黄芪3份，佛手5份，浙贝母3份，金荞麦4 份，北沙参4份；
以上8味药材，加6倍量水提取3次，每次2h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉；
将上述提取物，加入1倍量聚乙二醇加热热熔，混匀，滴制成丸，即得。
实施例5本发明物口服液的制备
由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮5份，丹参3份，黄芪5份，佛手3份，浙贝母4份，金荞麦3 份，北沙参5份；
以上8味药材，加8倍量水提取1次，每次1.5h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉；
将上述提取物，加入0.02倍量甜味素，加水溶化制成口服液，即得。
实施例6
由如下重量份的原料制成：
地黄1份，牡丹皮2份，丹参2份，黄芪1份，佛手2份，浙贝母2份，金荞麦2 份，北沙参1份；
以上8味药材，加1倍量水提取1次，每次0.5h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉。
实施例7
由如下重量份的原料制成：
地黄6份，牡丹皮5份，丹参5份，黄芪6份，佛手5份，浙贝母5份，金荞麦5 份，北沙参6份；
以上8味药材，加10倍量水提取4次，每次3h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，粉碎成细粉。
下边通过免疫调节功能实验来进一步说明本发明的效果
实验例
1.1实验动物
吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供的清洁级ICR雄性小鼠，生产许可证号：SCXK-(吉)20200004。饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK-(吉)2020-0001。本实验动物环境设施合格证，吉动设字10-1005，实验动物使用许可证号：SYXK-(吉)2020-0011。选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫一组，进行脏器/体重比值测定、半数溶血值(HC50) 的测定和抗体生成细胞检测；选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验；选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK 细胞活性测定；选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫四组，进行迟发型***反应实验；选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4 组，每组12只，作为免疫五组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。
1.2剂量选择与配制
实施例1，2次/日，10克/次，即10.0g/60kg BW，相当于0.165g/kg BW，以厂家日推荐摄入量的1、10、和30倍设置灌胃剂量，即0.165、1.65、4.95g/kg BW,各剂量组以纯水稀释。以纯水作阴性对照组，各组小鼠灌胃量均为0.2mL/10g BW，连续灌胃30 天后测各项免疫指标。
1.3仪器与试剂：
电子天平(0.1g)、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺(精密度0.02mm)、微量注射器(25μL)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank’s液(pH7.2–7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、l％冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇(96mL 异丙醇加4mL盐酸)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2–7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁***0.2g，***0.05g，加蒸馏水至1000mL)、YAC–1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液(pH8.2)、l％NP40、印度墨汁、Na2CO3、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.4实验方法
1.4.1脏器/体重比值测定
小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
1.4.2迟发型***反应(足跖增厚法DTH)
取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2％(V/V)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/ 只。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，20μL/ 只，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。
1.4.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数(应在 95％以上)，调整细胞浓度至3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2 37 ℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入lmL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，后定OD570nm。
1.4.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，4℃冰箱保存备用(可保存2周)。压积SRBC以生理盐水配成2％(V/V)细胞悬液，鼠腹腔注射0.2mL/只。将SRBC免疫4～5天后的小鼠脱臼处死，取脾，放入Hank’s液，将脾磨碎制成细胞悬液，纱布过滤，Hank’s液洗2次，每次离心(1000r/min)10min，后将脾细胞悬液加入RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×106个/mL。琼脂糖加热溶解后，45～50℃水浴保温，与等量PH7.2～7.4 2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL,再向管内加10％(V/V，用SA液配制)压积SRBC 50μL、脾细胞悬液20μL，混匀后倾倒于已刷有琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，CO2培养箱中温育1.5h，后用SA缓冲液稀释的补体(1:8) 加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
1.4.5半数溶血值(HC50)的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，腹腔注射2％(V/ V，生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL/只进行免疫。4天后，取血于离心管，放置约1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA 缓冲液将血清稀释(400倍)，稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(V/V)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。37℃恒温水浴中保温15～30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(V/V)SRBC0.25mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，以对照作空白，分别测定各管OD540nm，溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，计算：
HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数
1.4.6小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射1:4倍稀释的印度墨汁，立即计时，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立刻将其加到2mL 0.1％Na2CO3溶液中，以Na2CO3为对照，测定OD600nm。处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重。计算吞噬指数a：
k＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
Figure RE-GDA0003408640890000101
1.4.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
小鼠腹腔注射20％(V/V用生理盐水配制)压积鸡红细胞(2000r/min，10min) 悬液1mL，间隔30min，脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，37℃孵箱温育20min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，甲醇固定，4％(V/V) Giemsa–磷酸缓冲液染色，蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬率％＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
1.4.8 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h传代培养靶细胞YAC–l，应用前以Hank’s液洗3次，含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×105个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度至2×107个/mL，使效靶比为50：1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入 U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和l％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入 LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入lmol的HCl溶液30μL终止反应，测定OD490nm，计算NK活性：
NK细胞活性％＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
LDH基质液的配制：
乳酸钠5×10-2mol/L，硝基氯化四氮唑6.6×10-4mol/L，吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×l0-4mol/L，氧化型辅酶I1.3×10-3mol/L；
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液中(pH8.2)；
1.5数据统计
采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析进行均值比较，方差齐时，各组间两两比较用LSD法；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane法。
2、结果
2.1受试物对小鼠体重的影响，见表1：
表1.受试物对免疫一组小鼠体重影响
Figure RE-GDA0003408640890000111
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表1可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
表2.受试物对免疫二组小鼠体重影响
Figure RE-GDA0003408640890000112
Figure RE-GDA0003408640890000121
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表2可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
表3.受试物对免疫三组小鼠体重影响
Figure RE-GDA0003408640890000122
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表3可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
表4.受试物对免疫四组小鼠体重影响
Figure RE-GDA0003408640890000123
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表4可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
表5.受试物对免疫五组小鼠体重影响
Figure RE-GDA0003408640890000124
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表5可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
2.2受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
表6.受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
Figure RE-GDA0003408640890000131
脾脏/体重比值P1值：各实验组与阴性对照组比较；
胸腺/体重比值P2值：各实验组与阴性对照组比较；
由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，各剂量组脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的脏器/ 体重比值无明显影响。
2.3、受试物对小鼠细胞免疫功能的影响
2.3.1受试物对小鼠体重和迟发型***反应(DTH)的影响
表7.受试物对小鼠体重和迟发型***反应(DTH)的影响
Figure RE-GDA0003408640890000132
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05
由表7可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组间比较差异无显著性(P>0.05)；低剂量组足跖肿胀度与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，中、高剂量组与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)，即中、高剂量的受试物能增强小鼠的迟发型***反应。
2.3.2受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
表8.受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
Figure RE-GDA0003408640890000141
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组淋巴细胞的增殖能力与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力无明显影响。
2.4受试物对体液免疫的影响
2.4.1受试物对抗体生成细胞数的影响
表9.受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响
Figure RE-GDA0003408640890000142
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组抗体生成细胞数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的抗体生成细胞数无明显影响。
2.4.2受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
表10.受试物对小鼠半数溶血值HC50的影响
Figure RE-GDA0003408640890000143
Figure RE-GDA0003408640890000151
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表10可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组半数溶血值与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠半数溶血值无明显影响。
2.5受试物对小鼠单核–巨噬细胞吞噬功能的影响
2.5.1受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
表11.受试物对小鼠单核–巨噬细胞碳廓清功能的影响
Figure RE-GDA0003408640890000152
P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01
由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，低剂量组碳廓清功能与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，中、高剂量组与阴性对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，即中、高剂量组受试物能提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力。
2.5.2受试物对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响
表12.受试物对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响
Figure RE-GDA0003408640890000153
吞噬率(％)P1值：各实验组与阴性对照组比较
吞噬指数P2值：各实验组与阴性对照组比较
由表12可见，经统计学处理，经口给予受试物30天,各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)；各剂量组吞噬率与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，各剂量组吞噬指数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无明显影响。
2.6受试物对小鼠NK细胞活性的影响
表13.受试物对小鼠NK细胞活性的影响
Figure RE-GDA0003408640890000161
P值：各实验组与阴性对照组比较
由表13可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组 NK细胞活性与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的NK细胞活性无明显影响。
3、小结
经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，能增强小鼠迟发型***反应，即能增强细胞免疫功能；能提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力，即能增强单核—巨噬细胞功能；对小鼠半数溶血值、小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性无影响。由此判定，实施例1具有增强免疫力功能作用。

Claims (10)

1.一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄1～6份，牡丹皮2～5份，丹参2～5份，黄芪1～6份，佛手2～5份，浙贝母2～5份，金荞麦2～5份，北沙参1～6份。
2.根据权利要求1所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮4份，丹参2份，黄芪1份，佛手4份，浙贝母3份，金荞麦2份，北沙参1份。
3.根据权利要求1所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮2份，丹参4份，黄芪4份，佛手2份，浙贝母5份，金荞麦3份，北沙参6份。
4.根据权利要求1所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮3份，丹参3份，黄芪4份，佛手3份，浙贝母2份，金荞麦3份，北沙参4份。
5.根据权利要求1所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄5份，牡丹皮3份，丹参5份，黄芪3份，佛手5份，浙贝母3份，金荞麦4份，北沙参4份。
6.根据权利要求1所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料制成：
地黄4份，牡丹皮5份，丹参3份，黄芪5份，佛手3份，浙贝母4份，金荞麦3份，北沙参5份。
7.如权利要求1～6任一项所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
水煎煮提取：取地黄、牡丹皮、丹参、黄芪、佛手、浙贝母、金荞麦、北沙参加入水煎煮提取1～4次，滤过，合并滤液，浓缩，得到浸膏；
将浸膏干燥，得到中药组合物。
8.根据权利要求7所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述水煎煮提取步骤中，水溶液的加入量为药材总重量的4～10倍，提取的次数为1～4次，每次提取的时间为0.5～3h。
9.制备如权利要求1～6任一项所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物的中药制剂，其特征在于：包括中药组合物和药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的一种具有免疫调节功能的中药组合物的中药制剂，其特征在于：所述中药制剂的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂或口服液。
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