CN105548577B - 一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用 - Google Patents
一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用 Download PDFInfo
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。本发明的第一方面，提供了一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白（VlsE）。在检测时，每张芯片可同时检测多例血清样本，灵敏度、特异性均较高，减少组间检测假阳性和假阴性的发生几率。在与传统方法相比时，运用其对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可靠的检测方法，提高了筛查效率以及阳性检测率和准确度。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种琥珀酰-β-环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。
背景技术
莱姆病(Lyme Diseas，LD)是一种由蜱虫传播的旋体感染引起的累及皮肤、神经、关节、心脏等多组织器官损伤的疾病，又称莱姆疏螺旋体病(Lymeborreliosis)。莱姆病的主要病原体为伯氏疏螺旋体，主要分为三个亚型：狭义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi sensue stricto)，嘎氏伯氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)和伽氏伯氏疏螺旋体(Borrelia garinii)。莱姆病菌株在我国也分为三种基因型，其中B.burgdorferisensue stricto、B.afzelii、B.garinii基因种比率分别为5.81％、23.26％、66.28％。莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区；在中国，莱姆病的发病主要分布在山区以及林区，儿童发病率高于成人。
环形游走性红斑(Erythema migrans，EM)是莱姆病早期典型症状，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累，导致神经性莱姆病(neuroborreliosis,NB)。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。实验研究表明宿主动物对三种基因型伯氏疏螺旋体感染引起的临床症状有所不同，狭义伯氏疏螺旋体主要引起与关节有关的疾病，嘎氏伯氏疏螺旋体主要引起皮肤疾病，伽氏伯氏疏螺旋体主要引起与神经***有关的疾病等。目前用于实验室诊断伯氏疏螺旋体感染的方法包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种琥珀酰-β-环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。
优选地，所述固定为点阵固定。
优选地，所述固相载体为金箔芯片。
本发明的优选实施例中所采用的金箔芯片的基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。
进一步优选地，所述固相载体为表面依次修饰有16-氨基-1-十六烷硫醇和琥珀酰-β-环糊精的金箔芯片。
优选地，琥珀酰-β-环糊精上由羧基活化而成的琥珀酰亚胺基与金箔芯片上所修饰的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基结合。
优选地，伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)与琥珀酰-β-环糊精结合。
优选地，所述固相载体上伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的密度范围是：3.9x 10-4ng/mm2～0.41ng/mm2。
进一步优选地，所述固相载体上伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：1.3x10-2ng/mm2～0.41ng/mm2。
本发明的第二方面，提供了上述用于莱姆病检测的蛋白质芯片中固相载体的制备方法，包括步骤：
(1)将琥珀酰-β-环糊精上的羧基活化为琥珀酰亚胺基，获得活化后的琥珀酰-β-环糊精；
(2)在金箔芯片上修饰16-氨基-1-十六烷硫醇，获得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片；
(3)在步骤(2)中所得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片上修饰步骤(1)所得活化后的琥珀酰-β-环糊精，获得固相载体。
优选地，步骤(1)中，采用EDC和NHS对琥珀酰-β-环糊精上的羧基进行活化。
本发明的第三方面，提供了上述用于莱姆病检测的蛋白质芯片的构建方法，包括步骤：
将捕获分子进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。
本发明的第四方面还提供了前述用于莱姆病检测的蛋白质芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。
本发明的第五方面提供了一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述用于莱姆病检测的蛋白质芯片。
优选地，所述伯氏疏螺旋体检测试剂盒中还含有阴性对照。
所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。
所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M的磷酸盐缓冲液PBS(PH 7.2-7.4)；0.1％(v/v)Tween 20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。
所述阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人的血清。
优选地，所述伯氏疏螺旋体检测试剂盒中还含有阳性对照。
所述的阳性对照选用人免疫球蛋白IgG、IgM或阳性血清。
所述的阳性血清是临床确诊的伯氏疏螺旋体感染患者的血清。
特殊抗原和金箔芯片的选用是本发明蛋白质芯片的关键创新点。基于本发明的所述试剂盒采用的是荧光方法来进行检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂。例如：标准品，稀释液，清洗液中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。
所述标准品包括伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的IgG或IgM抗体。
优选地，所述的试剂盒还包括荧光素标记的IgG二抗、荧光素标记的IgM二抗。
优选地，所述荧光素标记为Cy3标记或Cy5标记。
优选地，所述试剂盒中还含有稀释液PBST-BSA溶液。所述稀释液可用于稀释抗原、抗体、血清等。所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M的磷酸盐缓冲液PBS(PH 7.2-7.4)；0.1％(v/v)Tween 20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。
本发明的第六方面还提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
将血清样本点于前述蛋白质芯片上，孵育，清洗，再点加荧光素标记的IgG二抗和荧光素标记的IgM二抗混合溶液。
清洗用于将未完全反应的血清从芯片上除去，可选用本领域常规的用于抗原抗体反应的洗液。优选地，可选用PBST(pH7.4)作为洗液。
优选地，清洗时，PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
优选地，所述荧光素标记的IgG二抗为Cy3标记的IgG抗体。更优选为Cy3标记驴抗人IgG抗体。
优选地，所述荧光素标记的IgM二抗为Cy5标记的IgM抗体。更优选为Cy5标记山羊抗人IgM抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)一方面本发明利用金箔作为基质。其与传统玻璃片、硅片以及高分子材料基质的优势在于，金箔本身为惰性金属，但其与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比来说更加牢固。并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附，大大降低了非特异性，避免了检测结果假阳性的产生。
(2)在用于实际检测临床莱姆病患者血清中抗伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)抗原时，每张芯片可同时检测多例血清样本，灵敏度、特异性均较高，减少组间检测假阳性和假阴性的发生几率。在与传统方法相比时，运用其在对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可靠的检测方法，提高了筛查效率以及阳性检测率和准确度。
附图说明
图1：为金箔芯片点样布阵示意图。
图2：利用原子力显微镜(AFM)观察金箔芯片修饰前表征情况。
图3：利用原子力显微镜(AFM)观察金箔芯片修饰后表征情况。
图4：为傅里叶红外光谱仪扫描化学修饰后金箔芯片平面表征图。
图5A：使用芯片扫描仪对实施例2中琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯片对不同蛋白质兼容性的质控实验所得蛋白质芯片分别进行扫描所得结果图。
图5B：实施例2中琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯片对不同蛋白质兼容性的质控实验所得蛋白质芯片的荧光曲线图。
图6：实施例2中抗原孵育温度-时间质控实验所得蛋白质芯片的荧光曲线图。
图7A：使用芯片扫描仪对实施例2中兔抗VlsE抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验所得蛋白质芯片分别进行扫描所得结果图。
图7B：实施例2中兔抗VlsE抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验所得蛋白质芯片的荧光曲线图。
图8A：实施例3组内重复性实验中三组荧光结果，不受不同的点样孔和不同时间的限制，重复性较好，稳定性较高。
图8B：实施例3组间可重复性实验中各组荧光结果，不受不同的点样孔和不同时间的限制，重复性较好，稳定性较高。
图9A：使用芯片扫描仪实施例4血清稀释度实验所得各蛋白质芯片进行扫描所得结果图。
图9B：实施例4中以血清稀释度为横坐标，荧光强度平均值A为纵坐标，绘制所得荧光强度曲线图。
图10A：实施例5中使用芯片扫描仪对所得蛋白质芯片进行扫描，莱姆病患者血清中IgM检测图。
图10B：实施例5中使用芯片扫描仪对所得蛋白质芯片进行扫描，莱姆病患者血清中IgG检测图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明各实施例原材料的来源与准备如下：
1.金箔芯片来源：本发明所用金箔芯片来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
2.金箔芯片表面化学修饰试剂：
修饰液1：浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液。16-氨基-1-十六烷硫醇的分子式为C16N36ClNS；
化学结构式为：购自日本DOJINDO公司。
修饰液2：浓度为1mM的琥珀酰-β-环糊精(Succinyl-β-CD，Mr＝1135g/mol)的PBS水溶液。具体配制备方法可以是：称取1.14mg琥珀酰-β-环糊精(Succinyl-β-CD，Mr＝1135g/mol)溶解在10mM PBS(PH＝7.4)中配制成浓度为1mM的溶液。琥珀酰-β-环糊精购自美国SIGMA-ALDRICH公司。
修饰液3：浓度为430mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS，Mr＝115.09g/mol)水溶液。具体配制方法可以是：称取49.49mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS，Mr＝115.09g/mol)溶解在1ml高压蒸汽处理过的去离子水得浓度为430mM的溶液。N-羟基丁二酰亚胺购自美国SIGMA-ALDRICH公司。
修饰液4：浓度为50mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Mr＝191.70g/mol)水溶液。具体配置方法可以是：称取9.59mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Mr＝191.70g/mol)溶解在1ml高压蒸汽处理过的去离子水得浓度为50mM的溶液1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐购自美国SIGMA-ALDRICH公司。
修饰液5：等体积的EDC和NHS溶液混匀，混合后的溶液与Succinyl-β-CD溶液按体积比1/10混合，4℃孵育2h所得的混合溶液。
3.抗原、抗体、荧光素类
抗原：伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(重组)(variable majorprotein-like sequence E protein,VlsE)、伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(重组)(Flagellin)购自MYBIOSOURCE公司；伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(重组)(Outer space protein C，OspC)购自Aviva公司；
抗体：兔抗伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白抗原IgG抗体均购自ROCKLAND公司、兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白抗原IgG抗体，兔抗伯氏疏螺旋体外膜蛋白C抗原IgG抗体；
荧光素：Cy3标记山羊抗兔IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记驴抗人IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记山羊抗人IgM抗体购自KPL公司。
4. PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与0.01M Tween 20混合构成。
PBST配制：PBS一包溶解在1000ml去离子水中，然后加入1ml Tween-20，混匀，平放在摇床上过夜。PBS：0.01M，PH 7.2-7.4；Tween-20：0.1％(v/v)。
5. PBST-BSA溶液是由0.01M、PH 7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS；0.1％(v/v)Tween 20及0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。
PBST-BSA溶液配制：取50μl BSA(200mg/ml)于10ml PBST溶液中，震荡，静置。得PBST-BSA溶液(需BSA质量浓度是0.1％(w/v))。
磷酸缓冲液(PBS)、Tween 20及胎牛血清(BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
实施例1载体的选择及表面化学处理
本发明选用金箔芯片，来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
步骤1.金箔芯片的清洗
配制TL1溶液(H2O:H2O2:NH3·H2O＝5:1:1)倒入不锈钢盒中，将芯片放入盒中，82℃水浴5min，去离子水冲洗4～5次，乙醇2次，每次3min；氮气风干，干燥保存。
步骤2.对清洗后金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
对金箔芯片进行清洗后，浸入前述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干，获得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片；取出后浸于前述修饰液5中孵育4h；然后取出芯片用高压蒸汽处理过的去离子水清洗3次，每次2分钟，氮气干燥，琥珀酰-β-环糊精上由羧基活化而成琥珀酰亚胺基与金箔芯片所修饰的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基结合，获得琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯片，待用。
利用原子力显微镜(AFM)观察金箔芯片修饰前后表征情况，分别如图2和图3所示，可以看出，修饰后的平面表面较修饰前的平面表面更为粗糙，表示经修饰后，化学基团共价连接到金箔芯片表面上。
采用傅里叶红外光谱仪对修饰后金箔芯片平面进行扫描，化学表征图详见图4：1232cm-1峰值归属于羟基中C-O振动；1423和1560cm-1峰值分别归属于酰胺键中C-N和C＝O振动；1708cm-1峰值归属于酸酐基中C＝O振动；2935cm-1峰值归属于十六烷中C-C振动，3278-3357cm-1峰值可能主要归属于羟基中O-H振动、氨基中N-H振动和羧酸基中O-H振动。
实施例2质控实验
制备孵育液1：将VlsE抗原溶于PBST-BSA溶液，分别配置成浓度梯度为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml的抗原溶液。
制备孵育液2：将人IgG溶于PBST-BSA溶液，配置成浓度梯度为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml的溶液；
制备孵育液3：将Flagellin抗原溶于PBST-BSA溶液，配置成浓度梯度为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml的溶液；
制备孵育液4:将OspC抗原溶于PBST-BSA溶液，配置成浓度梯度为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml的溶液；
制备孵育液5：将兔抗VlsE IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，分别配置成抗体浓度梯度为50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.13μg/ml，1.56μg/ml，0.78μg/ml，0.39μg/ml，0.19μg/ml，0.095μg/ml，0.0475μg/ml的溶液；
制备孵育液6：将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/ml的溶液；
制备孵育液7：兔抗Flagellin IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成抗体浓度为50μg/mL的溶液；
制备孵育液8：将兔抗OspC IgG抗体分别溶于PBST-BSA溶液，配置成抗体浓度为50μg/mL的溶液；
制备孵育液9：将Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/mL的溶液；
制备孵育液10：将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/mL的溶液；
制备孵育液11：将Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体等量溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/ml的Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体混合溶液。
1、琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯片对不同蛋白质兼容性的质控实验
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体，取四个不同的琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯，分别编号为1、2、3、4，1号芯片点加孵育液1；2号芯片点加孵育液2；3号芯片点加孵育液3；4号芯片点加孵育液4；每个梯度浓度设置两个重复，室温条件(25℃)下孵育2小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，获得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片。
再将浓度为50μg/mL兔抗VlsE IgG抗体、兔抗Flagellin IgG抗体、兔抗OspC IgG抗体溶液分别点样于上述孵育有VlsE(编号为1)、Flagellin(编号为3)、OspC(编号为4)抗原探针的蛋白质芯片之上，另外将浓度为2.5μg/ml的Cy3标记驴抗人IgG抗体点样于上述孵育有人IgG抗体探针(编号为2)的蛋白质芯片之上。室温(25℃)条件下，湿盒孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，待用。
将浓度为2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶液点样与上述孵育有抗体的编号分别为1、3、4蛋白质芯片之上，避光，室温(25℃)条件下孵育0.5小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟。氮气吹干。
使用芯片扫描仪(北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan 10K-A)对以上蛋白质芯片分别进行扫描，结果显示于图5A。如图5A所示，对于编号为1的VlsE蛋白质芯片，从左自右，第1列至第11列分别代表的VlsE浓度分别为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零；对于编号为2的IgG蛋白质芯片，从左自右，第1列至第11列分别代表的IgG浓度分别为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗体浓度为零；对于编号为3的Flagellin蛋白质芯片，从左自右，从左自右，第1列至第11列分别代表的Flagellin的浓度分别为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零；对于编号为4的OspC蛋白质芯片，从左自右，第1列至第11列分别代表的OspC的浓度分别为0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.0313μg/ml，0.0156μg/ml，0.0078μg/ml，0.0039μg/ml，0.0019μg/ml，0.00095μg/ml，0.000475μg/ml，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零。
图5B为采用不同浓度抗原包被进行检测时所得荧光强度曲线图：将图5A中每一列同一浓度所得2个荧光强度取平均值，以抗原浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图，结果如图5B所示。从图5B可以看出：在兔抗各个莱姆病抗原IgG抗体和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当VlsE重组抗原孵育浓度分别大于等于0.000475μg/ml时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育VlsE重组抗原的最优浓度应在0.000475μg/ml以上。而人IgG、Flagellin、OspC重组抗原与琥珀酰-β-环糊精修饰的蛋白质芯片的结合率很差。充分说明，琥珀酰-β-环糊精与蛋白质的结合是有一定的选择性的，并不是所有的蛋白都能够与琥珀酰-β-环糊精良好地结合，并实现检测。
2、抗原孵育温度-时间质控实验
将浓度为0.0156μg/ml的VlsE抗原溶液点到实施例1完成表面琥珀酰-β-环糊精化学修饰的金箔芯片固相载体上，分别在37℃，室温(25℃)和4℃条件下孵育24小时、12小时、6小时、3小时、1小时和0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50μg/ml的兔抗VlsE抗原IgG抗体溶液点样于孵育有VlsE抗原探针的固相载体之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为2.5μg/ml的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液点样于孵育有抗体的固相载体之上，黑暗室温孵育0.5小时，取出用PBST-BSA清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪(北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan 10K-A)对以上蛋白质芯片分别进行扫描，即为抗原孵育温度-时间的质控实验，结果显示如图6所示。首先获得相同浓度的VlsE抗原在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光扫描图；然后根据荧光扫描图计算获得如图6所示的VlsE抗原在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光强度曲线图。
根据抗原孵育温度-时间的质控实验可以获知：
(1)荧光强度随着孵育时间的延长而延长，当孵育时间大于1小时，荧光强度随着孵育时间的延长变化不是很明显。故在实际检测中，为了缩短孵育时间，建议探针制作的孵育时间大于1小时即可满足需求。
(2)孵育温度，荧光强度在室温(25℃)条件下强于37℃和4℃条件下的荧光强度。故在实际检测中，建议在室温(25℃)条件下进行孵育实验。
3、兔抗VlsE抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度均为0.0156μg/ml的VlsE重组抗原溶液之中，室温(25℃)条件下孵育2小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将孵育液5的兔抗VlsE抗原IgG抗体溶液点样于孵育有VlsE、重组抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再加2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为兔抗VlsE抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验，结果显示如图7A所示。如图7A所示，对于VlsE蛋白质芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，兔抗VlsE抗原IgG抗体的浓度分别为50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.13μg/ml，1.56μg/ml，0.78μg/ml，0.39μg/ml，0.19μg/ml，0.095μg/ml，0.0475μg/ml，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗体浓度为0。
图7B为采用不同浓度抗体包被进行检测时所得荧光强度曲线图：将图7A中每一列同一浓度所得4个荧光强度取平均值，以抗体浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。
从图7B可以看出：在VlsE重组抗原和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当兔抗VlsE抗原IgG抗体孵育浓度分别大于0.39μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度存在着可辨识的差异。说明此修饰芯片可以检测到肉眼可视兔抗VlsE抗原IgG抗体浓度在μg/mL级。
实施例3可重复性实验
表1为组内可重复性实验，每16个孔作为一组，共三组，在同一天内按照步骤孵育浓度为0.0156μg/ml的VlsE抗原、浓度为50μg/ml的兔抗VlsE抗原IgG抗体和浓度为2.5μg/ml的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体。
表1
表2为组间可重复性实验，每24个孔作为一组，共三组，分别在三天内按照步骤孵育浓度为0.0156μg/ml的VlsE抗原、浓度为50μg/ml的兔抗VlsE抗原IgG抗体和浓度为2.5μg/ml的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体。
表2
表1、2中，SD是标准差，CV是变异系数，这两种指标可以反映生物芯片在抗蛋白样序列表达E蛋白抗体检测中的稳定性及不会出现大的偏差。
如图8A所示：组内重复性实验中三组荧光结果不受不同的点样孔和不同时间的限制，重复性较好，稳定性较高。
如图8B所示，组间可重复性实验中各组荧光结果不受不同的点样孔和不同时间的限制，重复性较好，稳定性较高。
综上所述，本发明蛋白质芯片检测VlsE抗原IgG抗体的结果不受不同的点样孔和不同时间的限制，重复性较好，稳定性较高。
实施例4血清稀释度实验
任意取临床已确诊伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清和临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的的健康人血清各3例。
将每例血清用PBST-BSA按照梯度1:2.5,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160；1:320,1:640，1:1280.1:2560稀释。然后按照从左自由的顺序依次点样到含有孵育浓度为0.0156μg/ml的伯VlsE抗原的探针的芯片上，其余6个空点样液为PBST-BSA溶液。亦即，对于检测阳性血清的VlsE蛋白质芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，血清稀释比例分别为1:2.5,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160；1:320,1:640，1:1280.1:2560，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，血清浓度为0。对于检测阴性血清的VlsE蛋白质芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，血清稀释比例分别为1:2.5,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160；1:320,1:640，1:1280.1:2560，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，血清浓度为0。
常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再加2.5μg/ml的Cy3标记驴抗人IgG抗体，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，结果显示如图9A所示，上面3排是阳性血清组(任取3例阳性血清组)，下面3排是阴性血清组(任取3例阴性血清组)。图9B：计算阳性血清组荧光平均值与对应稀释度阴性血清对照组荧光平均值的比值A。以血清稀释度为横坐标，荧光强度平均值A为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。我们设定阳性血清组组3个血清荧光值的平均值与阴性血清组3个血清荧光值之比A大于4的稀释度可以用于实验检测，所以用于检测的血清稀释度的范围是(1:10)～(1:160)。
实施例5莱姆病患者血清样本检测
按照实施例1的方法制备琥珀酰-β-环糊精修饰的金箔芯片，作为固相载体，将孵育浓度为0.0156μg/ml的VlsE抗原溶液分别点样于固相载体的各个孔上，室温条件(25℃)下孵育2小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，获得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片。
如图10A和如图10B所示，将188例临床已确诊为伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清分别点样于所示蛋白质芯片的其中188个孔上，另外2个孔点样液为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清，其余2个孔点样液为PBST-BSA溶液，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将孵育液11点样于孵育有患者血清抗体的芯片之上，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，结果分别显示为图10A和图10B。其中，图10A为莱姆病患者血清中IgM检测图；图10B为莱姆病患者血清中IgG检测图。从图中可以看出：在实际检测临床已诊断为莱姆病患者的血清中，阳性患者的血清的荧光强度与健康人群的血清以及PBST-BSA点样的荧光强度之间存在着明显的差异性。
根据荧光检测结果进行统计，分别采用本发明的蛋白质芯片(Biochip)与传统方法ELISA方法对188例临床已确诊莱姆病患者血清进行检测方法比较，结果如表3所示：
表3
“+”：positive；“-”：negtive
*:χ2＝0.44,p>0.05
进行卡方检验：Biochip vs.ELISA，p>0.05，说明芯片方法与传统的ELISA方法检测莱姆病没有显著性差异。
根据表3结果计算得：Biochip方法检测的阳性率是45.2％(85例)，ELISA方法检测的阳性率是43.6％(82例)。由此可得，Biochip方法检测莱姆病的阳性率高于ELISA方法。
综上所述，本发明的蛋白质芯片可以分别检测患者体内的抗VlsE抗原IgG和IgM抗体，蛋白质芯片方法可以作为一种替代传统的ELISA方法检测莱姆病，尤其在大量筛查样本中有着极大的优势。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种用于莱姆病检测的蛋白质芯片，包括固相载体和固定于所述固相载体上的捕获分子，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)；所述固相载体为表面依次修饰有16-氨基-1-十六烷硫醇和琥珀酰-β-环糊精的金箔芯片；琥珀酰-β-环糊精上由羧基活化而成的琥珀酰亚胺基与固相载体上所修饰的16-氨基-1-十六烷硫醇中的氨基结合；伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)与琥珀酰-β-环糊精结合。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述固相载体上伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的密度范围是：3.9x10-4ng/mm2～0.41ng/mm2。
3.根据权利要求1～2任一权利要求所述用于莱姆病检测的蛋白质芯片中固相载体的制备方法，包括步骤：
(1)将琥珀酰-β-环糊精上的羧基活化为琥珀酰亚胺基，获得活化后的琥珀酰-β-环糊精；
(2)在金箔芯片上修饰16-氨基-1-十六烷硫醇，获得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片；
(3)在步骤(2)中所得16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片上修饰步骤(1)所得活化后的琥珀酰-β-环糊精，获得固相载体。
4.根据权利要求1～2任一权利要求所述用于莱姆病检测的蛋白质芯片的构建方法，包括步骤：将捕获分子进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。
5.根据权利要求1～2任一权利要求所述用于莱姆病检测的蛋白质芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。
6.一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～2任一权利要求所述用于莱姆病检测的蛋白质芯片。
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